一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用
阅读说明：本技术 一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用 (Recombinant human collagen, encoding gene and application thereof in preparation of biodegradable collagen-based cornea substitute ) 是由 殷世清 赵学彩 张凤龙 蔡永刚 魏静 孙晖 李倩 张甲庆 李鑫 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用,它是将重组人胶原蛋白和高分子聚合物,于水相中通过复合交联方式处理,模具固化成型后获得；或将重组人胶原蛋白和高分子聚合物采用静电纺丝为纳米纤维膜后,进一步进行复合交联、干燥获得三维角膜支架,临床时复水溶胀后添加富血小板血浆使用。本发明的角膜替代物无病毒隐患、无免疫原性、降解性可控,具有良好的屈光性和机械强度,添加富血小板血浆(APRP)使用后对角膜上皮细胞及角膜小体、角膜神经的再生具有显著的诱导作用。(The invention discloses a recombinant human collagen, a coding gene and application thereof in preparing a biodegradable collagen-based cornea substitute, which is obtained by treating the recombinant human collagen and a high molecular polymer in a water phase in a composite crosslinking way and solidifying and molding a mold; or the recombinant human collagen and the high molecular polymer are subjected to electrostatic spinning to form a nanofiber membrane, then the nanofiber membrane is further subjected to composite crosslinking and drying to obtain a three-dimensional corneal scaffold, and the three-dimensional corneal scaffold is used by adding platelet-rich plasma after being swelled by water in clinic. The cornea substitute has no virus hidden trouble, no immunogenicity, controllable degradability and good refraction and mechanical strength, and has obvious induction effect on regeneration of corneal epithelial cells, corneal bodies and corneal nerves after being added with platelet rich plasma (APRP).)
技术领域
本发明属于组织工程角膜移植物材料技术领域，具体地，本发明涉及一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用。
背景技术
世界上超过1000万人的眼盲是由角膜病引起，为导致眼盲的第二大原因，仅次于白内障。穿透性角膜移植术是角膜病主要的洽疗手段，但对于重度干眼症、Stevens-Johnson综合症、重度化学烧伤等的预后较差，且面临移植排斥、供体不足等问题。人工角膜的应用和组织工程角膜的研究为眼盲患者带来了希望，目前常用的角膜构建材料主要为生物支架材料、高分子材料等。
生物材料支架常作为机械支架支持细胞生长，减轻细胞反应，并随着时间的推移，逐渐改变它们的化学和机械特性。生物相容性是其最重要的一个特性，生物材料越接近组织微环境，生物相容性越好。理想的组织工程角膜材料应满足以下条件：(1)生物相容性好，维持三维空间，促进正常细胞生长和分化，不干扰其他生理过程；(2)无不良组织反应；(3)材料制作简单，并能按不同的形状和大小重塑；(4)植入体内后，材料可被降解或吸收。
胶原蛋白是动物体内含量最多的结构蛋白，具有很强的生物活性及生物功能，为细胞生长提供依附和支撑，能诱导上皮细胞、纤维细胞等进行黏附、增殖和迁移，使结缔组织具有机械强度；同时，具有止血、生物相容性和生物降解性；还能改善细胞生长微环境，促进皮肤组织新陈代谢，修复皮肤屏障，能够引导机体组织再生。基于这些特征，胶原蛋白常被用于组织工程领域、医疗器械领域及美容领域。
富血小板血浆(APRP)是自体全血离心后获得的血小板浓缩物，含有大量细胞生长因子，如血小板原性生长因子，转化生长因子、神经生长因子、表皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。这些生长因子不仅能在多种组织修复与再生过程中起促进作用，还能促进细胞增殖、分化、趋化等加速神经、血管再生。APRP中还具有高浓度血小板及白细胞，能充分发挥抗菌作用，避免创口的感染。
申请号为200510042812.3的中国发明专利申请公开了一种具有生物活性的人工角膜的制备方法，以动物角膜基质为材料，采用酶消化、反复冻融、洗涤、60Co辐照、复合添加促进角膜细胞生长或/和阻止局部病变发展的功能组分的步骤制备。该发明叙述其具有与正常角膜相似的拉伸强度、屈光度，阻止病变发展及角膜溶解，促角膜上皮再生等优点。但是，采用动物角膜基质为材料，存在异种胶原免疫排斥反应，细胞毒反应等风险因素。
申请号为201510453581.9的中国发明专利申请公开了一种组织工程角膜的制备方法，具体为采用人角膜缘细胞复合动物源性角膜制备的支架材料的方式，将前弹力层、基质层和后弹力层分离，涂布人角膜缘细胞制备的细胞混悬液，后通过交联、粘合等方式完成含细胞的组织工程角膜构建，此方法制备的组织工程角膜在使用方面具有组织相容性高、细胞不易分化、可以产业化制备等优点。但该方法未考虑承载细胞生物材料的保存期问题，难以形成市场化角膜替代物，不利于市场推广，且外源性细胞与动物源材料混合型产品的免疫排斥风险较高，产品植入后提供光线屈光性作用也很难保证。
申请号为200910068343.0的中国发明专利申请公开了一种具有生物活性的胶原基复合角膜替代物及其制备方法，主要是以胶原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺(EDC)对胶原进行交联；以IRGACURE 2959为光引发剂，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)为交联剂对MPDSAH进行引发聚合并交联。混合均匀后，注入模具内固化成型。该方法制备的复合角膜替代物可诱导和促进角膜再生，可随角膜再生而生物降解，生长因子的引入可以促进自体生长因子的富集，减少术后并发症的出现。但该方法所用的聚合物MPDSAH及光引发剂为刺激类试剂，生物相容性较差，且后期保存采用氯仿溶液，不如当前湿热或辐照等终端灭菌方式安全性高。
上述专利中公开的人工角膜都存在一定的不足，无法兼顾生物相容性、生物安全性和角膜移植后的有效性，同时部分产品难以市场化，不具备临床应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题包括：第一在于提供一种重组人胶原蛋白及其对应的编码基因，第二是于提供一种质量稳定、生物安全性高、可生物降解的胶原基角膜替代物，以及该角膜替代物的制备及应用方法。
本发明提供的重组人胶原蛋白，该重组人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
KREAEAGKDGPPGPAGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGPRGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGSPGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAGPRGPVGPSGPPGKDGTSGHPGPIGPPGPRGNRGERGSEGSPGHPGQPGPPGPPGAPGPCCGGVGAAAIAGIGGEKAGGFAPYYG
本专利提供设计长度为328氨基酸的人胶原蛋白(SEQ ID NO:1)，并根据毕赤酵母密码子的偏好性设计相应核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，将该核苷酸序列插入毕赤酵母表达载体，构建pPIC9K-COL表达载体，通过电转化将该表达载体转化毕赤酵母宿主菌GS115，通过筛选获得高拷贝数菌株，最后经过高密度发酵、分离、纯化获得高纯度的重组人源胶原蛋白原料。
本发明的重组人源胶原蛋白稳定性好，纯度高，能够满足本发明的需要。另外，本发明还提供编码上述重组人源胶原蛋白氨基酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸的DNA序列包括SEQ ID NO:2：
AAAAGAGAGGCTGAAGCTGGAAAAGATGGTCCTCCTGGTCCTGCTGGTAATACTGGTGCTCCTGGTAGTCCTGGTGTCAGTGGTCCTAAGGGTGACGCTGGTCAACCTGGTGAAAAGGGTTCTCCAGGTGCTCAAGGTCCACCTGGTGCTCCAGGTCCTTTGGGTATTGCTGGTATTACTGGTGCTAGAGGTTTGGCTGGTCCACCTGGTATGCCAGGTCCTAGAGGTTCTCCAGGTCCTCAAGGTGTTAAGGGTGAATCTGGTAAACCAGGTGCTAACGGTTTGTCCGGAGAGAGAGGTCCACCTGGACCACAAGGTTTGCCAGGTTTGGCTGGTACTGCTGGTGAACCTGGTAGAGATGGTAACCCAGGTTCTGATGGTTTGCCTGGTAGAGATGGTTCTCCAGGTGGTAAAGGAGATAGAGGTGAAAATGGTTCTCCAGGTGCTCCTGGTGCTCCAGGTCATCCTGGTCCACCTGGACCAGTTGGTCCTGCTGGTAAATCCGGAGATAGAGGTGAATCTGGTCCAGCTGGTCCTGCTGGTGCTCCAGGTCCTGCTGGTTCTAGAGGTGCTCCAGGTCCTCAAGGTCCAAGAGGAGATAAGGGTGAAACTGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGTATTAAAGGTCACAGAGGTTTTCCAGGTAACCCTGGTGCTCCAGGTTCTCCAGGTCCTGCTGGTCAACAAGGTGCTATTGGTTCTCCAGGACCAGCTGGTCCTAGAGGTCCAGTTGGTCCTTCTGGTCCACCTGGTAAAGATGGTACTTCTGGTCATCCAGGTCCTATTGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTAATAGAGGTGAAAGAGGTTCTGAGGGTTCTCCAGGTCACCCTGGTCAACCAGGTCCACCTGGTCCACCTGGAGCCCCAGGTCCTTGTTGTGGTGGTGTTGGTGCTGCAGCTATCGCAGGTATCGGAGGAGAGAAAGCAGGAGGTTTTGCCCCTTATTACGGTTAG
同时，本发明还提供一种可生物降解的胶原基角膜替代物制备及应用方法：
(1)将本发明提供的重组胶原蛋白和高分子聚合物按质量比为2～8:1混合，得到胶原基共混物。
(2)将胶原基共混物加入去离子水中，并加入交联剂，然后置于模具中，进行复合交联；
或将胶原基共混物通过静电纺丝制成纳米纤维膜后，浸入交联剂的乙醇溶液或交联剂的水溶液中，进行复合交联。
(3)交联反应完后除去交联剂，干燥、灭菌，获得角膜替代物。
(4)临床使用之前将角膜替代物置于添加富血小板血浆(APRP)的PBS溶液中于4℃溶涨3～4天，待角膜完全恢复形变后进行临床应用。
上述步骤(1)中，所述的重组胶原蛋白为微生物发酵技术获得的重组人胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白、重组类胶原蛋白，其分子量为30～300kDa；所述的高分子聚合物为聚乙烯醇、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种，优选聚乙烯醇。
上述步骤(1)中，进一步优选重组胶原蛋白与高分子聚合物的质量比为2～8:1。
上述步骤(2)中，所述的交联剂为京尼平、碳化二亚胺、戊二醛、谷氨酰胺转氨酶、环氧氯丙烷中的一种或多种种，优选交联剂的添加量为胶原基共混物质量的0.1％～3％。
上述步骤(2)中，将胶原基共混物通过静电纺丝制成的纳米纤维膜的厚度为0.1～0.2mm，其中纳米纤维的直径为50～500nm。
上述步骤(3)中，除去交联剂的方法为透析、PBS漂洗、超声清洗中任意一种。
上述步骤(3)中，所述的灭菌为低温辐照灭菌，温度是-20～-10℃，处理时间为4-8小时，辐照剂量是10～25kGy。
上述步骤(4)中富血小板血浆(APRP)的制备采用二次离心法，第一次离心条件为2500r/min，10min。离心后取上清液置于另一离心管中，进行第二次离心，离心条件为3500r/min，5min，弃去上清液，剩余液体吹打摇匀后即为富血小板血浆(APRP)。该过程要求在无菌条件下进行操作。
上述步骤(4)中富血小板血浆(APRP)的添加量为10％～20％。
相对于现有技术，本发明的胶原基角膜替代物及其制备应用方法具有如下有益效果：
1、本发明的胶原蛋白通过基因工程的方法获得，具有同源性高，样品纯度高，稳定性好，无免疫原性风险，细胞黏附效果极佳。
2、本发明与胶原共混的高分子聚合物，均为高生物相容性医用原料，且可安全降解，无毒副作用，同时可为角膜基质提供临床所需的机械性能。
3、本发明采用复合交联方式，可保证交联效果(提高机械强度)的同时进一步减少交联剂使用量，同时后续通过有效去除工艺可控制交联剂残留，最终产品细胞毒性检测结果显示为0～1级细胞毒性，安全性高，适合植入材料的严要求。
4、本发明采用低温环境辐照，既可以保证产品的无菌水平(SAL≤10-6)，也可防止胶原及高分子聚合物分子结构损坏。
5、本发明胶原基角膜替代物的机械强度良好，屈光性佳，且可生物降解。
6、本发明的胶原基角膜配合APRP的临床应用，效果显著。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
下列实施例中的胶原蛋白是依据SEQ ID NO:1序列转入毕赤酵母，经过高密度发酵、分离、纯化获得高纯度的重组人源胶原蛋白原料，分子量32KD，纯度高达99％以上。该重组人源胶原蛋白无免疫原性，可体内完全降解，具有优良的细胞黏附效果。
实施例1
1、将18g分子量为32kDa的重组人源胶原蛋白和2g数均分子量为17万的聚乙烯醇124混合均匀，得到胶原基共混物。
2、将步骤1得到的胶原基共混物用去离子水定容至100mL，搅拌均匀，然后
加入0.02g碳化二亚胺，然后将所得混合液置于模具中，在25℃下交联反应2h。
3、将步骤2交联反应后的样品置于1kDa截留的透析袋中进行交联剂去除处理，每6h更换外环境超纯水，共更换4次；洁净环境下将去除交联剂残留的样品置于磷酸盐无菌保存液中并封装，于-10℃处理8h，10kGy Co60辐照灭菌，获得可生物降解的胶原基角膜替代物。
4、在10mL无菌注射器中加入1mL10％复方枸橼酸钠抗凝剂并润管，取角膜受损的新西兰耳中央动脉5mL，摇匀，离心制备APRP备用。
5、使用PBS溶液配制10％的APRP溶液，4℃下溶涨角膜替代物3天，用于新西兰兔的临床使用。
实施例2
1、将8g分子量为32kDa的重组人源胶原蛋白和8g数均分子量为12万的聚乙烯醇124混合均匀，得到胶原基共混物。
2、将步骤1得到的胶原基共混物用去离子水定容至100mL，搅拌均匀，然后加入0.032g谷氨酰胺转氨酶，然后将所得混合液置于模具中，在4℃下交联反应48h；所得产物用PBS清洗30min，然后加入100mL去离子水中，搅拌均匀，加入0.016g戊二醛，在25℃下交联反应4h。
3、将步骤2交联反应后的样品超声清洗除去交联剂，然后在洁净环境下将去除交联剂残留的样品置于磷酸盐无菌保存液中并封装，于-20℃处理6h，15kGy Co60辐照灭菌，获得可生物降解的胶原基角膜替代物。
4、在10mL无菌注射器中加入1mL10％复方枸橼酸钠抗凝剂并润管，取角膜受损的新西兰耳中央动脉5mL，摇匀，离心制备APRP备用。
5、使用PBS溶液配制15％的APRP溶液，4℃下溶涨角膜替代物4天，用于新西兰兔的临床使用。
实施例3
1、将8g分子量为32kDa的重组人源胶原蛋白冻干粉与1g数均分子量为4万的聚乳酸、1g数均分子量为2万的聚羟基乙酸混合均匀，得到胶原基共混物。
2、将上述胶原基共混物采用静电纺丝技术进行支架成型，获得纳米级三维网状支架，将支架材料裁剪为所需大小，并浸没于100mL含有0.3g碳化二亚胺的乙醇溶液中，在25℃下交联反应10h；所得产物用PBS漂洗30min，再浸没于100mL含有0.2g谷氨酰胺转氨酶的水溶液中，在4℃下交联反应16h。
3、将步骤2交联反应完后的角膜支架用PBS反复清洗除去剩余交联剂，经冷冻干燥处理后，封装于医用铝箔袋中，封口，于-20℃冷冻处理4h，20kGy Co60辐照灭菌，获得胶原基角膜支架。
4、在10mL无菌注射器中加入1mL10％复方枸橼酸钠抗凝剂并润管，取角膜受损的新西兰耳中央动脉5mL，摇匀，离心制备APRP备用。
5、使用PBS溶液配制20％的APRP溶液，4℃下溶涨角膜替代物4天，用于新西兰兔的临床使用。
为了测试本发明的有益效果，发明人对实施例1获得的胶原基角膜替代物进行了性能测试，具体测试如下：
1、降解性测试
分别称取各实施例制备的胶原基角膜替代物0.05g，加入200U/mL的I型胶原酶200μL，在37℃水浴锅中分别作用1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h，计算不同时间的降解率，结果见表1。
表1
再生修复是组织工程研究的重点方向，材料降解并被组织自身逐渐替代、修复是组织重建的目的，因此可降解性是组织工程材料基本要求之一，根据表1中的检测结果，本发明胶原基角膜替代物体外降解平缓、可控，满足体内研究的技术要求。
2、力学强度测试
根据杨坚《人角膜生物力学特性的实验研究》中人角膜力学强度相关数据，并对各实施例制备的胶原基角膜替代物进行拉伸强度和弹性模量检测，对比结果如表2所示。
表2
由表2结果可知，本发明制备的胶原基角膜替代物在拉伸强度方面具有和天然人角膜相同的数量级，且较为接近，可满足临床手术中操作要求，同时弹性模量在天然角膜范围内，质量稳定。
3、透光性
采用带有记录仪的分光光度计对各实施例制备的胶原基角膜替代物在430nm波长处进行透光率检测，并与龙玉宇在《角膜修复材料的制备及生物相容性研究》中提到的天然人角膜透光率做对比，结果见表3。
表3
透光率％
天然人角膜(文献)
＞80％
实施例1胶原基角膜替代物
83.6±2.1％
实施例2胶原基角膜替代物
85.5±2.5％
实施例3胶原基角膜替代物
83.9±2.8％
由上述表3中的对比结果可知，本发明制备的胶原基角膜替代物具有良好的透光率，可提供后期较佳的视力恢复效果。
4、动物有效性测试
取实施例2制备的胶原基角膜替代物进行动物有效性研究，选取实施例2中常规角膜损伤模型——新西兰兔角膜碱烧伤模型，其中左眼为对照眼，右眼为试验眼，对右眼进行角膜替代物板层移植，缝合后于1月、3月、6月进行观察，并与对照组进行对比，结果见表4。
表4
由实验结果可知，新西兰兔右眼进行胶原基角膜替代物移植后，与角膜基质之间结合良好，无明显炎症反应，无植入不良反应，基质层胶原纤维排列规整，且生物相容性良好，材料逐渐降解，植片表面可观察到少量基质细胞长入，内皮细胞的吸水作用也使角膜呈现良好的透光性，在6个月时，角膜即可完全愈合。
序列表
<110> 山东汉肽医美生物科技有限公司
<120> 一种重组人胶原蛋白、编码基因及其在制备可生物降解的胶原基角膜替代物上的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 328
<212> PRT
<213> 重组人胶原蛋白(氨基酸序列)
<400> 2
Lys Arg Glu Ala Glu Ala Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly
1 5 10 15
Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Pro Lys Gly Asp
20 25 30
Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Pro Pro
35 40 45
Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr Gly Ala Arg Gly
50 55 60
Leu Ala Gly Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Pro
65 70 75 80
Gln Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala Asn Gly Leu Ser
85 90 95
Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly
100 105 110
Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ser Asp Gly Leu
115 120 125
Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp Arg Gly Glu Asn
130 135 140
Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly
145 150 155 160
Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Ser Gly Pro
165 170 175
Ala Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly Ala Pro
180 185 190
Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Arg Gly
195 200 205
Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly Asn Pro Gly Ala
210 215 220
Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala Ile Gly Ser Pro
225 230 235 240
Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly
245 250 255
Lys Asp Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro
260 265 270
Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro
275 280 285
Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys
290 295 300
Gly Gly Val Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu Lys Ala
305 310 315 320
Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly
325
<210> 2
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaagagagg ctgaagctgg aaaagatggt cctcctggtc ctgctggtaa tactggtgct 60
cctggtagtc ctggtgtcag tggtcctaag ggtgacgctg gtcaacctgg tgaaaagggt 120
tctccaggtg ctcaaggtcc acctggtgct ccaggtcctt tgggtattgc tggtattact 180
ggtgctagag gtttggctgg tccacctggt atgccaggtc ctagaggttc tccaggtcct 240
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ccacctggac cacaaggttt gccaggtttg gctggtactg ctggtgaacc tggtagagat 360
ggtaacccag gttctgatgg tttgcctggt agagatggtt ctccaggtgg taaaggagat 420
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aagggtgaaa ctggagagag aggtgctgct ggtattaaag gtcacagagg ttttccaggt 660
aaccctggtg ctccaggttc tccaggtcct gctggtcaac aaggtgctat tggttctcca 720
ggaccagctg gtcctagagg tccagttggt ccttctggtc cacctggtaa agatggtact 780
tctggtcatc caggtcctat tggtccacct ggtccaagag gtaatagagg tgaaagaggt 840
tctgagggtt ctccaggtca ccctggtcaa ccaggtccac ctggtccacc tggagcccca 900
ggtccttgtt gtggtggtgt tggtgctgca gctatcgcag gtatcggagg agagaaagca 960
ggaggttttg ccccttatta cggttag 987
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