具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

正如背景技术部分所描述的，现有体内评价方法存在局限性，体外筛选模型也存在毒性靶点评价指标单一，缺乏特异性的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种用于评价候选化合物神经毒性的方法，该方法包括：

(1)在候选化合物存在时培养神经元，并确定该候选化合物对于神经突生长毒性的影响；以及

(2)在该候选化合物存在时培养神经元，并监测该神经元电生理活动的情况。

目前国内外报道的iPSC细胞诱导的神经元模型多采用一般毒性指标进行筛选或针对具体个别化合物(case-by-case)的设计，本发明设计的形态指标(神经突生长情况)加电生理指标模型适用于几类神经毒物的评价，包括中药，神经治疗药物、抗结核药等。

在一种优选的实施方式中，在培养该神经元的过程中，不添加血清。

其中，对血清诱导分化的神经细胞模型和无血清定向分化神经元模型进行电生理检测，血清诱导分化的神经细胞模型最早出现电信号，证明血清可加速神经干细胞分化，但是血清诱导分化的细胞模型电信号持续时间短，转板后3天即可出现电信号，但在2天后信号逐渐减弱，很难形成连续、稳定的放电簇，因此后续实验采用无血清定向分化神经元的模型进行。

在一种优选的实施方式中，该候选化合物选自以下的一种或多种：奥沙利铂、苯妥英钠、大黄素、乌头碱、异烟肼、乙胺丁醇、金刚烷胺、丙烯酰胺和氧化铁。

其中，本发明的候选化合物包含已知具有神经毒性的抗肿瘤药物奥沙利铂，具有发育神经毒性作用的抗癫痫药苯妥英钠，具有潜在神经毒性的中药单体乌头碱和抗病毒药物金刚烷胺，以及能够通过血脑屏障的纳米制剂氧化铁纳米粒子。

在一种优选的实施方式中，该方法进一步包括：在该候选化合物不存在时培养该神经元，并与该候选化合物存在时的该情况相比较。

在一种优选的实施方式中，该神经元来源于人神经干细胞的定向分化。

在一种优选的实施方式中，该人神经干细胞为商业化的人神经干细胞。

在一种优选的实施方式中，该人神经干细胞为人类诱导多能干细胞(hiPSC)诱导的神经干细胞。

其中，由hiPSC衍生的神经元模型避免了动物实验种属差异问题和细胞来源的伦理问题。此细胞培养的生物变异性较原代细胞小，容易控制细胞分化程度、神经元和胶质细胞成分比例。

在一种优选的实施方式中，该人神经干细胞为由女性皮肤成纤维细胞诱导的神经干细胞。

在一种优选的实施方式中，该神经干细胞的接种浓度为1×10⁸L^-1至1×10⁹L^-1。

其中，在一定范围内，低密度有利于神经干细胞的分化，且密度过高也不利于形态学检测。密度过低或者过高都不利于神经干细胞的增殖。本发明发现，神经干细胞的适宜接种浓度一般用1×10⁸L^-1至1×10⁹L^-1。说明神经干细胞间相互作用在其增殖过程中的重要性，可能与细胞增殖中存在自分泌现象(能分泌一些重要的促增殖因子)有关。

在一种优选的实施方式中，该方法进一步包括：添加神经干细胞维持培养基、神经元定向分化维持培养基和神经元接种培养基，将该人神经干细胞定向分化成该神经元。

在一种优选的实施方式中，在该人神经干细胞的定向分化成该神经元的过程中，分别于该神经干细胞定向分化第7、14、21天，使用β-微管蛋白Ⅲ和微管相关蛋白2免疫荧光标记该神经元。

在一种优选的实施方式中，在该人神经干细胞的定向分化成该神经元的过程中，分别于该神经干细胞定向分化第0、7、14、21、28天检测以下基因的表达情况：微管蛋白、突触素、胶质纤维酸性蛋白、波形纤维蛋白、谷氨酸转运体和巢蛋白。

在一种优选的实施方式中，该人神经干细胞定向分化第21天转变成该神经元。

其中，在该人神经干细胞的定向分化成该神经元的过程中，与该神经干细胞定向分化第0、7、21、28天的神经元分化率相比较，第21天的神经元分化率最高。

在一种优选的实施方式中，使用微电极阵列技术监测该神经元电生理活动的情况。

与测量时需要插入细胞膜内，容易造成细胞损伤，且只能记录单个细胞信号的膜片钳技术相比，微电极阵列(Microelectrode Array,MEA)记录的是形成神经网络功能的群体细胞的场电位，系统检测神经网络的功能，包括放电频率、同步性和网络震荡。其检测通道多，可实现高通量筛选潜在神经毒性化合物。无细胞损伤特征允许在网络发育过程中多次重复测量。此外，还具有响应速度快，制备工艺简单，可长期检测等优点。

在一种优选的实施方式中，使用该微电极阵列技术监测该神经元平均放电率和簇频率均值变化的情况。

其中，本发明中监测药物对神经元平均放电率MFR的结果证明该指标的敏感性，且易于获取，适用于快速高通量评价化合物干扰神经元活性。

在一种优选的实施方式中，将该神经元转移至微电极阵列板，培养约60天直至产生稳定连续的放电后，分别加入不同浓度的该候选化合物，分别检测给药24h、48h和72h后的所述神经元电生理活动的情况。

在一种优选的实施方式中，使用高内涵细胞成像系统检测该神经突生长的情况。

在一种优选的实施方式中，使用高内涵细胞成像方法确定该候选化合物对于该神经突生长毒性的影响。

在一种优选的实施方式中，在该高内涵细胞成像方法中，绿色荧光标记该神经元和该神经突，蓝色荧光标记细胞核；

在一种优选的实施方式中，该神经突生长毒性的评价指标选自以下的一种或多种：神经突总长度、最长神经轴突数、神经突端点数、神经段数、神经根数和神经节点数。

在一种优选的实施方式中，向该神经元分别添加4个剂量水平的该候选化合物，检测该候选化合物影响该神经突生长的该评价指标的剂量效应关系。

根据本发明的另一方面，提供了一种根据上述方法在评价药物神经毒性中的用途。

实施例

1材料和方法

1.1细胞来源

hiPSC(由女性皮肤成纤维细胞诱导)诱导的神经细胞：NeuroEasy人神经干细胞1*10⁶购自北京赛贝生物。

1.2主要试剂及仪器

1.2.1试剂

神经干细胞贴壁培养基(包括神经干细胞复苏接种培养基100ml、神经干细胞维持培养基100ml、神经干细胞消化液50ml)：货号：A20B272，厂家：北京赛贝生物；

神经元定向分化培养基(包括神经元接种培养基100ml、神经元定向分化维持培养基250ml、神经干细胞消化液50ml、神经元分化铺底工作液10ml)：货号：I20G251，厂家：北京赛贝生物；

DMEM/F12高糖培养基：规格：500mL/瓶；批号：2085088，厂家：Gibco；

胎牛血清(FBS)：规格：500mL/瓶，批号：Lot.No.1965564，厂家：Gibco；

鸡抗巢蛋白抗体：规格150ug，货号：ab134017，厂家：Abcam；

小鼠抗β微管蛋白III抗体：规格100ug，货号：ab78078，厂家：Abcam；

大鼠抗胶质纤维酸性蛋白抗体：规格50ul，货号：ab7260厂家：Abcam；

山羊抗鸡IgY(H+L)交叉吸附二抗，荧光标记Alexa FluorPlus 647：规格1mg，批号：UH289711，厂家：Thermo Fisher；

山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附二抗，荧光标记Alexa Fluor Plus488：规格1mg，批号：UD277967，厂家：Thermo Fisher；

驴抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附二抗，荧光标记Alexa Fluor Plus 555：规格1mg，批号：UI284002，厂家：Thermo Fisher；

单克隆抗体MAP2(2a+2b)小鼠：规格100ug，货号：M1406-100UL，厂家：Sigma-Aldrich；

含DAPI的永久抗淬灭封片剂：规格2ml，货号P36941，厂家：Thermo Fisher；

多聚甲醛，规格：500ml，批号：0708A20，厂家：雷根生物；

曲拉通X-100溶液(1％无菌)，规格：100ml，批号：1213A19，厂家：雷根生物；

多聚赖氨酸溶液，规格：50ml，批号：0114A20，厂家：雷根生物；

N-2添加剂，规格：5ml，批号：2161604，厂家：Gibco；

人纤连蛋白，规格：2mg，批号：SLBZ5857，厂家：Sigma-Aldrich；

抗生素：规格：100ml，批号：2108964，厂家：Thermo Fisher；

山羊血清：规格：50ml，批号：011520200430，厂家：碧云天；

PBS：规格：2L，批号：18112401，厂家：中杉金桥；

通用性总RNA提取试剂盒，货号：HS0402厂家：北京厚生博泰生物技术有限公司；

cDNA第一链合成试剂盒，货号：HS0611厂家：北京厚生博泰生物技术有限公司；

Real SYBR Mixture染料法实时荧光定量PCR预混体系，货号：HS0613厂家：北京厚生博泰生物技术有限公司；

2×Taq PCR Mastermix两倍浓度PCR预混合液，货号：HS0602厂家：北京厚生博泰生物技术有限公司；

D2000 DNA标记物，货号：HS0713厂家：北京厚生博泰生物技术有限公司；

琼脂糖，货号：111860厂家：Spain Biowest；

10,000×DuRed核酸染料，货号：D009-500ul厂家：北京富百科生物技术有限公司；

引物合成：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.2仪器

倒置显微镜：型号：CKX31，厂家：日本OLYMPUS；

倒置荧光显微镜：型号：IX71，厂家：日本OLYMPUS；

光学显微镜：型号：BX-51，厂家：OLYMPUS；

超净工作台：型号：BCN1360B，厂家：北京东联哈尔仪器制造有限公司；

CO₂培养箱：型号：10-0221，厂家：日本R.K.J；

多孔微电机阵列(MEA)系统：型号：PRO；厂家：美国Axion Biosystems；

高内涵细胞成像分析仪：型号：Opretta cls，厂家：PerkinElmer；

涡旋振荡器：型号：Vortex-Genie 2；厂家：美国Scientific Industries公司；

分光光度计：型号：Nano-100厂家：杭州奥盛仪器有限公司；

荧光定量PCR仪：型号：FQD-96A；厂家：杭州博日Line Gene 9620；

湘仪迷你离心机：型号：WTL-10K；厂家：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

台式高速冷冻离心机：型号：LEGEND MICRO17R；厂家：Thermo FisherScientific；

涡旋振荡器：型号：Vortex-Genie 2；厂家：美国Scientific Industries公司。

1.3受试物

氧化铁(II,III)：规格：10mL，直径5nm的磁性纳米颗粒溶液，胺官能化，1mg/mLFe，在H₂O中的分散体，批号：MKCL5871，厂家：Sigma；

金刚烷胺：规格：50mg，批号：100426-201703，厂家：中检院标准物质；

苯妥英钠：规格：100mg，批号：100584-201804，厂家：中检院标准物质；

奥沙利铂：规格：20mg，批号：100367-201903，厂家：中检院标准物质；

异烟肼：规格：50mg，批号：100439-201809，厂家：中检院标准物质；

乌头碱：规格：100mg，批号：100348-201908，厂家：中检院标准物质；

大黄素：规格：100mg，批号：T02S8F42983，厂家：中检院标准物质；

乙胺丁醇：规格：50mg，批号：130675-201601，厂家：中检院标准物质；

丙烯酰胺：规格：1mg/mL，批号：Lot.No.20150427，厂家：国药集团化学试剂有限公司。

2构建hiPSC诱导分化神经细胞模型

2.1神经干细胞复苏及传代

2.1.1复苏培养

提前30分钟打开紫外灭菌，37℃温水，热水和容器，快速解冻细胞。小心摇晃细胞至熔化，迅速用75％酒精消毒冻存管外表面，转移至无菌操作台。将细胞悬液转移至新的15ml离心管中，缓慢加入4ml神经干细胞复苏接种完全培养基，轻柔吹吸2次混匀，1000rpm离心5min。弃上清，加入适量人神经干细胞复苏接种完全培养基重悬细胞，轻柔吹吸2次混匀，并接种到准备好的培养瓶中，显微镜下观察细胞。37℃CO₂培养箱培养24h，显微镜下可见神经干细胞均匀贴壁。弃上清，加入适量的人神经干细胞维持培养基，放入培养箱后，2-3天换一次维持培养液。显微镜下观察细胞汇合度达到100％即可传代。

2.1.2细胞传代

室温平衡人神经干细胞复苏接种完全培养基、神经干细胞消化液。弃培养液后加入人神经干细胞消化液1mL，于37℃培养箱中消化3分钟左右。显微镜下观察当细胞变圆、漂浮，即可终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，在离心管中加入适量神经干细胞复苏接种完全培养基，重悬细胞接种至合适的皿中。37℃恒温CO₂细胞培养箱中培养24小时，更换人神经干细胞维持培养基。

2.2诱导神经干细胞分化

2.2.1血清诱导神经干细胞分化

用纤连蛋白包被培养皿/孔板，放置37℃恒温二氧化碳细胞培养箱中2h。将神经干细胞接种于培养板中，加入分化培养基(组成为DMEM/F12、1％N-2、不同浓度胎牛血清，包括0％、2％、5％、10％浓度)。24小时后，更换无血清培养基继续培养。分别取2天、4天、8天、12天、16天、21天时间点的细胞做免疫荧光鉴定。

2.2.2神经干细胞定向分化神经元

用纤连蛋白包被培养皿/孔板，放置37℃恒温二氧化碳细胞培养箱中2h。弃培养皿上清液，加入神经干细胞消化液，37℃消化5min，加入等体积神经元分化接种完全培养基终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，加入适量神经元分化接种培养基，重悬细胞。37℃恒温CO₂细胞培养箱中培养24h，显微镜下观察细胞贴壁，弃上清，更换为神经元分化维持培养基继续培养，每3天更换神经元维持培养液一次。在分化7、14、21天时进行免疫荧光鉴定。

2.3免疫荧光技术鉴定神经细胞

采用以下步骤对血清分化神经元和星形胶质细胞及定向分化神经元进行免疫荧光标记。具体操作如下：用预温的PBS洗3次；4％多聚甲醛室温固定20min；PBS洗3次；0.2％Triton X-100透化15min；PBS洗3次；5％羊血清封闭37℃孵育30min；小鼠抗β微管蛋白(Ⅲ)、鸡抗巢蛋白抗体、大鼠抗胶质纤维酸性蛋白抗体(稀释比例分别为1:500)4℃过夜；PBS洗3次；加二抗37℃孵育1小时，PBS洗3次；1μg/mL DAPI染核室温避光5min，PBS洗3次后，直接进入高内涵分析细胞成像系统进行图像扫描。

2.4 Q-PCR技术鉴定神经细胞模型

Q-PCR技术分别检测血清诱导分化模型和定向分化模型中以下基因的表达情况：微管蛋白(β-tubulin Ⅲ标记神经元)，突触素(synaptophysin标记突触)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP标记成熟星形胶质细胞)，波形纤维蛋白(vimentin标记未成熟星形胶质细胞)，谷氨酸转运体(Glutamate transport)，巢蛋白(Nestin标记神经干细胞)。引物设计，样本总RNA的提取、质量监测，逆转录合成cDNA，RealTime PCR样本检测等试验操作由生工生物工程(上海)股份有限公司合作完成。

2.5 MEA技术监测神经细胞电生理活动

1×10⁸L^-1神经干细胞定向分化神经元传3代后，细胞增殖不明显，神经干细胞基本分化为神经细胞，将此时的神经细胞转至Cytoview48孔MEA板，每孔约5×10⁴个细胞。转板稳定后，每2天上机测定一次电生理活动，持续检测至60天左右。

3 hiPSC诱导定向分化神经元模型评价研究

3.1高内涵成像系统检测神经突生长毒性

3.1.1试验设计及分组

将神经干细胞消化吹散成单细胞悬液后以密度为1×10⁸接种于纤连蛋白包被的96孔板中，注意细胞接种时应将96孔板四边留白并加入无菌PBS以防边缘效应。待单细胞贴壁后，加入定向分化培养基使神经干细胞分化为神经元。本发明检测给药48h奥沙利铂、苯妥英钠、大黄素、乌头碱、异烟肼、乙胺丁醇、金刚烷胺、丙烯酰胺、纳米氧化铁(II，III)对神经突生长的毒性作用。受试物分组情况见表1。

表1神经突生长毒性试验受试物分组设计

3.1.2免疫荧光标记神经细胞

采用以下步骤对神经干细胞，神经元和星形胶质细胞进行免疫荧光标记。具体操作如下：用预温的PBS洗3次；4％多聚甲醛室温固定20min；PBS洗3次；0.2％Triton X-100透化15min；PBS洗3次；5％羊血清封闭37℃孵育30min；加入一抗4℃过夜；PBS洗3次；加二抗37℃孵育1小时，PBS洗3次；0.1-1μg/mL DAPI染核室温避光5min，PBS洗3次后，直接进入高内涵分析细胞成像系统进行图像扫描，测定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞的细胞比例。

3.2 MEA技术检测药物影响神经细胞电生理活动

将分化成熟的神经细胞转至MEA板，待产生稳定连续的放电后，加入苯妥英钠、乌头碱、金刚烷胺，氧化铁纳米粒子处理，检测药物对神经细胞电生理活动的影响。对抗癫痫药物苯妥英钠设置不同浓度组，分别为10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，其他药物异烟肼25μg/mL，金刚烷胺50μg/mL，氧化铁纳米50μg/mL，分别检测给药24h、48h、72h后神经电生理活动。

3.3统计学方法

首先用t检验方法对数据进行正态性分布检验，如果数据均一(检验P>0.05)，则进行方差分析检验(F检验)；如果方差分析检验结果显著(P≤0.05)，则进一步用Dunett参数检验法进行多重比较检验；若方差分析结果不显著(P>0.05)，则统计结束。

4结果与分析

4.1神经干细胞培养及分化

复苏培养第1天光镜下见细胞贴壁，折光性好，于24h后更换神经干细胞维持培养基，第4天可见细胞数量明显增多，细胞增殖能力良好。

加入神经元定向分化培养基后，细胞开始聚集，神经突数量增加，轴突树突延长，细胞间建立网络连接(如图1所示)。神经元定向分化特点为培养物中含有少量神经胶质细胞和少突胶质细胞，神经元所占比例达90％以上，神经突生长较快，逐渐交织形成密集的神经纤维网。

4.2鉴定血清分化神经细胞

4.2.1免疫荧光鉴定神经元和星形胶质细胞

在短时间内，含10％血清的分化培养基比5％、2％血清分化培养基对神经干细胞的分化进程更快，更早出现神经突触，建立细胞联系，且促进干细胞增殖。

细胞密度对神经干细胞分化有一定影响。在相同条件下，细胞密度过大，不利于神经干细胞增殖，因为神经元生长突触，星形胶质细胞体积较大，都需要一定生长空间。本研究探索了1×10⁸L^-1、1×10⁹L^-1和1×10¹⁰L^-1三个细胞接种密度，其中1×10⁸L^-1为适宜的神经干细胞接种密度。

在相同条件下，神经干细胞随着时间增加，分化的比例越高，神经元生长突触的数量和长度增加，细胞间联系越复杂，神经干细胞比例减小，若细胞密度过大，不利于形态学检测。本研究探索了含10％血清培养基分化神经干细胞2、4、8、12、16、21天时的细胞形态学特征(如图2所示)。

4.2.2Q-PCR鉴定神经细胞发育

随时间增加，加入血清后巢蛋白的表达量下降，β微管蛋白Ⅲ和突触素的表达呈上升趋势，说明神经元的生长和突触的生长是被促进，波形纤维蛋白的表达被抑制，而胶质纤维酸性蛋白的表达呈上升趋势，说明未成熟星形胶质细胞减少，星形胶质细胞逐渐成熟，谷氨酸转运体的表达呈上升趋势，说明星形胶质细胞的转运谷氨酸功能也趋于成熟(如图3所示)。

4.2.3 MEA技术监测神经电生理活动

与神经元定向分化相比，血清诱导分化进程相对较快，转板后3天即可出现电信号，但在2天后信号逐渐减弱，不能产生连续、稳定的电信号。

4.3鉴定定向分化神经元

4.3.1免疫荧光鉴定神经元形态

Β微管蛋白Ⅲ免疫荧光标记定向分化神经元，7天可见少量神经突形成，定向分化14到21天，神经突数量逐渐增加，形成密集的神经纤维网，神经干细胞逐渐分化为结构复杂的成熟神经元。微管相关蛋白MAP₂是神经元树突标志物，在神经元发育过程中比β微管蛋白Ⅲ的表达稍晚，分化21天时此细胞模型MAP₂表达阳性(如图4所示)。通过高内涵筛选平台统计细胞表型变化，神经突总长度、最长神经轴突数、神经突端点数、神经根数、神经段数、神经节点数，从分化7天到21天均呈增长趋势(如图5所示)。

4.3.2 Q-PCR鉴定神经细胞发育

神经元定向分化14天，巢蛋白和β微管蛋白Ⅲ表达抑制/促进没有明显改变，突触素表达呈促进趋势，在7-14天时间段促进趋势减缓，谷氨酸转运体表达呈促进趋势，未成熟星形胶质细胞标志物波形纤维蛋白表达抑制，胶质纤维酸性蛋白表达增加，此时间段以神经干细胞增殖为主，尚无明显的神经元分化，星形胶质细胞开始分化。定向分化14天至21天时，巢蛋白表达抑制明显，β微管蛋白Ⅲ、突触素、谷氨酸转运体促进表达的趋势明显，神经干细胞进入快速分化为神经元阶段。定向分化21天至28天时，β微管蛋白Ⅲ、突触素、谷氨酸转运体促进表达的趋势下降，此时蛋白质合成逐渐完成，神经元发育趋于成熟，状态稳定。14至28天，GFAP表达呈促进趋势，波形纤维蛋白表达抑制，星形胶质细胞逐渐发育成熟(如图6所示)。

4.3.3 MEA技术监测神经电生理活动

待神经元细胞分化状态良好，细胞增殖不显著时，将体外培养8天的神经元转入MEA板，转板后细胞稳定培养5天后，神经突逐渐延长，此时开始使用Maestro MEA平台记录神经元电活动。转板后10天出现强电信号，电信号特点为振幅大、不连续、不稳定的异常放电。从转板后18天起，电信号为连续稳定的均匀放电，转板后35天，出现网络同步放电，形成突触连接。此48孔板培养至60天左右，多数孔出现稳定的同步放电(如图7、图8和图9所示)。

4.4药物毒性筛选

两种细胞模型构建及鉴定结果显示，虽然血清诱导分化的神经细胞模型在神经元形态发育中未见与定向分化的神经元存在较大差异，但在电生理活动监测中发现其很难形成连续、稳定的放电簇，因此，本研究选用定向分化神经细胞模型开展了药物毒性筛选研究。检测指标包含显示神经形态学变化的神经突生长和神经电生理指标。

4.4.1神经突生长毒性

奥沙利铂和大黄素对神经细胞有明显毒性作用，从10μg/mL剂量组起，表现为显著的神经突损伤(P<0.05，P<0.01)，进而发生神经细胞崩解坏死。乌头碱和异烟肼在10-50μg/mL剂量组未见显著的神经突生长毒性，100μg/mL剂量组可见显著的神经突损伤(P<0.05)。乙胺丁醇各剂量组未见显著的神经突生长毒性。苯妥英钠从50μg/mL剂量组起与阴性对照组相比表现为显著的神经突生长毒性(P<0.05)。金刚烷胺从100μg/mL剂量组起与阴性对照组相比表现为显著的神经突生长毒性(P<0.05，P<0.01)。丙烯酰胺从50μg/mL剂量组起与阴性对照组相比表现为显著的神经突生长毒性(P<0.05，P<0.01)。纳米氧化铁粒子在10-200μg/mL剂量组未表现剂量相关性的神经突生长毒性。上述神经突生长毒性表现为神经突的总长、最长神经轴突、神经突端点数、神经突段数、神经根数指标与阴性对照组相比的显著性降低(如图10和图11所示)。

4.4.2神经电生理活动毒性

给药第一天，50μg/mL金刚烷胺对神经元放电有促进作用，平均放电频率短暂上升后，迅速下降，从给药第二天信号消失。25μg/mL异烟肼对神经元放电呈抑制作用，放电频率缓慢下降，至第三天电信号消失。纳米氧化铁粒子对神经元放电抑制作用明显，给药第一天电信号接近消失。苯妥英钠对神经元放电呈抑制作用，且给药第一天信号接近消失，而高剂量组在第四天，电信号出现异常波动，放电频率增加，超过给药前放电频率(如图12所示)。

5结论

本发明构建的由hiPSC衍生的神经元模型避免了动物实验种属差异问题和细胞来源的伦理问题。此细胞培养的生物变异性较原代细胞小，容易控制细胞分化程度、神经元和胶质细胞成分比例。近年来，国内外对人神经干细胞的培养技术进行了探索性研究，不同文献报道的方法类似但并不完全一致，试验结果也存在显著差异，其不同主要表现在细胞生长方式(悬浮还是贴壁)、存活时间、诱导分化结果等方面，培养方法的细微差别将导致细胞具有明显不同的特性，目前还没有一个被普遍接受的人神经干细胞培养程序，因此现阶段根据所使用的hiPSC衍生神经元的特征，设计一项神经毒性评估研究非常重要。本发明在参考多种神经干细胞分化方法的基础上探索了适合神经系统特异性形态学和电生理功能检测的细胞培养方法及检测体系，并对细胞模型的发育程度进行了评估。对其中的细胞培养方式、培养密度、分化时间进行了摸索。例如，神经干细胞的增殖和分化有一定浓度依赖性。在一定范围内，低密度有利于神经干细胞的分化，且密度过高也不利于形态学检测。密度过低或者过高都不利于神经干细胞的增殖。本发明发现，神经干细胞的适宜接种浓度一般用1×10⁸L^-1至1×10⁹L^-1。说明神经干细胞间相互作用在其增殖过程中的重要性，可能与细胞增殖中存在自分泌现象(能分泌一些重要的促增殖因子)有关。

神经干细胞分化为成熟的神经细胞需要经历一系列事件。添加的生长因子、分化程序都可能影响细胞成熟的速度和程度。细胞存活时间，稳定性和成熟度均是神经毒性药物体外评价方法学建立的重要研究内容。本发明从神经元和星形胶质细胞的特异性蛋白、基因表达，神经元的电生理活动，包括放电频率、同步性和网络震荡对神经细胞模型进行形态学和功能性的鉴定。例如β微管蛋白(β-tubulin)和MAP-2的表达反映了神经元的发育过程，波形纤维蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达反映了星形胶质细胞的成熟度，谷氨酸转运体的表达标志着神经元和星形胶质细胞具有谷氨酸转运功能，是神经细胞成熟的标志。具有同步簇放电的成熟神经网络可用于评价影响神经功能的药物或神经治疗性药物。

神经突生长是神经发育的体外研究的一个重要指标，有许多很好的体外方法已经用于检测药物对神经突生长的化学作用，如PC12细胞是广泛用于神经生物学研究的细胞系。本发明首次构建hiPSC诱导分化的神经元模型并用于多种类神经毒性药物的评价，研究结果显示，奥沙利铂、丙烯酰胺具有显著的神经细胞毒性。大黄素在本发明中也表现显著的神经细胞毒性，而文献均报道大黄素的神经保护作用，说明在一定剂量水平大黄素仍然具有神经毒性。苯妥英钠、金刚烷胺、乌头碱和异烟肼在高剂量组具有抑制神经突生长作用，乙胺丁醇和氧化铁纳米粒子未见显著的神经突生长抑制作用。

神经细胞电生理主要包括跨膜电位、离子电流、胞外场电位等。研究跨膜电位、离子电流的传统方法是胞内记录方式的膜片钳技术，根据其记录到的通道电流的变化情况，能够分析药物对通道功能的可能影响以及作用位点，虽然膜片钳记录的信号幅值大，但测量时需要插入细胞膜内，容易造成细胞损伤，且只能记录单个细胞信号。微电极阵列(Microelectrode Array，MEA)记录的是形成神经网络功能的群体细胞的场电位，系统检测神经网络的功能，包括放电频率、同步性和网络震荡。其检测通道多，可实现高通量筛选潜在神经毒性化合物。无细胞损伤特征允许在网络发育过程中多次重复测量。此外，还具有响应速度快，制备工艺简单，可长期检测等优点。MEA技术的优势在于，与增殖、神经突生长等指标相比，神经网络发育是一个更“顶端”或“宽带”的终点，结合了神经元分化和轴突生长、突触发生、神经元和神经胶质之间的相互作用等方面，能够捕获其它指标不能检测出的神经毒性化合物。例如，本发明中氧化铁纳米粒子并未见显著的神经突生长抑制作用，但却具有明显的神经元放电抑制作用。此外，本发明中监测药物对神经元平均放电率(Meanfiring rate,MFR)的结果证明该指标的敏感性，且易于获取，适用于快速高通量评价化合物干扰神经元活性。

药物神经毒性体外评价模型及检测指标众多，但至今尚未形成可用于临床前药品监管系统的方法学指南。本发明构建的人源神经细胞模型来源一致，体系稳定，适用于神经系统特异性检测指标的评价，且首次使用了两个神经系统体外模型的特异性检测指标即形态学和功能测定用于药物筛选，排除了一般细胞毒性的非特异性干扰。研究所完成的多种类阳性药物筛选结果也证明了该模型及方法的特异性和敏感性，可用于今后的潜在神经毒性药物或化合物的筛选及评价。

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