Gpr21基因敲除小鼠模型及其建立方法
阅读说明：本技术 Gpr21基因敲除小鼠模型及其建立方法 (GPR21 gene knockout mouse model and establishment method thereof ) 是由 谢欣 李静 赵婷婷 李艳利 于 2021-05-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种GPR21基因敲除小鼠模型及其建立方法,具体涉及用于GPR21基因敲除的sgRNA、载体及其构建方法和检测方法,以及F0、F1代小鼠基因型检测方法。实施方法为利用CRISPRCas9基因敲除技术,靶向敲除GPR21基因第2个外显子。有研究表明GPR21是2型糖尿病的新靶标,GPR21敲除小鼠显示出更好的葡萄糖耐量和胰岛素反应。本发明GPR21基因敲除小鼠模型为进一步研究糖尿病的发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型,具有良好的推广应用价值。(The invention provides a GPR21 gene knockout mouse model and an establishment method thereof, and particularly relates to sgRNA for GPR21 gene knockout, a vector, a construction method and a detection method thereof, and F0 and F1 mouse genotype detection methods. The implementation method is to target knock out the 2 nd exon of GPR21 gene by using CRISPRCs 9 gene knock-out technology. There are studies showing that GPR21 is a new target for type 2 diabetes, and GPR21 knockout mice show better glucose tolerance and insulin response. The GPR21 gene knockout mouse model provides an economic, simple and reliable animal model for further researching the pathogenesis and gene therapy of diabetes, and has good popularization and application values.)
技术领域
本发明涉及一种GPR21基因敲除小鼠模型及其建立方法。
技术背景
糖尿病是以长期高血糖为主要特征得代谢紊乱综合症，是由于遗传因素、环境因素、免疫功能紊乱或微生物感染等引起的胰岛素绝对不足或相对不足导致，主要包括1型糖尿病和2型糖尿病。
G蛋白偶联受体(GPCR)超家族包括近千种参与多种生理和病理功能的七跨膜受体。大约36％的市售药品以人GPCR为靶标。已经有超过30种GPCR涉及到β细胞功能障碍、胰岛素抵抗、肥胖和2型糖尿病药物的开发。其中GPR21受体可能为肥胖引起的胰岛素抵抗从而引发糖尿病的相关受体之一。
孤儿受体GPR21最初是从大脑中分离出来的，通过人RNA的Northern印迹分析，GPR21位于人类的9号染色体q33区和小鼠的2号染色体，与GPR52的同一性最高(71％)。
GPR21的生理作用仍然未知。有研究表明GPR21是2型糖尿病的新靶标。肥胖引起的胰岛素抵抗是2型糖尿病病因的主要因素，并且这些疾病的流行率在全球范围内呈上升趋势。近年来，慢性低度炎症已成为胰岛素抵抗发生的一个重要的因素。肥胖引起的炎症反应促进了巨噬细胞和其他免疫细胞向脂肪组织和肝脏的浸润。因此，肥胖和炎症都成为胰岛素抵抗状态(包括2型糖尿病)的关键病因。孤儿受体GPR21在小鼠的下丘脑和巨噬细胞中高表达，并且该受体的全身敲除导致葡萄糖耐量，胰岛素血症和全身胰岛素敏感性改善。数据表明，在肥胖诱导的胰岛素抵抗的情况下，GPR21可能是协调巨噬细胞促炎活性的新型控制点，GPR21在2型糖尿病的发生中可能发挥的潜在作用。药理GPR21抑制作用可以通过增加能量消耗和改善胰岛素敏感性来预防高糖高脂饮食的负面影响，从而减少胰岛素抵抗和2型糖尿病发展。
成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatedproteins,CRISPR/Cas)技术是近几年出现的一种定点基因组编辑新工具，具有灵活、高效、廉价且易于操作等优点。利用CRISPR/Cas9技术，通过设计特异性的sgRNA，可以实现特异性的DNA识别，并且在靶向位置完成切割，再通过细胞本身的DNA修复机制，完成断裂处的修复，从而实现目标基因的“编辑”。根据实验需求，把小鼠一个或几个特定基因基因敲除后，培养出的小鼠，就成为适合药物实验的动物模型。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种GPR21基因敲除小鼠模型。
本发明的目的之二在于提供该GPR21基因敲除小鼠模型的构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种GPR21基因敲除小鼠模型，其特征在于该模型是通过敲除小鼠GPR21基因中的第2号外显子而得到的具有GPR21基因敲除的F1代小鼠模型。
上述的小鼠模型的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.对小鼠GPR21基因，设计基因敲除策略，敲除区域选择为第2号外显子；
b.采用CRISPR-Cas9基因编辑、卵母细胞注射方法获得F0代小鼠；
c.将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有GPR21基因敲除的阳性F1代小鼠模型。
上述步骤b的CRISPR-Cas9基因编辑方法的具体步骤为：
a.设计sgRNA：sgRNA的长度为80个核苷酸，包含两个区域：sgRNA 5'端前20个核苷酸对应于靶标DNA，剩余的核苷酸形成一个发夹结构，所述的sgRNA中的与靶标DNA结合的序列条件是：
①20bp；
②与靶标DNA完全互补；
③靶标DNA与插入的碱基序列对应的末端是任意核苷酸序列(N)+5’末端两个胞嘧啶核苷酸(-NCC)；
b.sg RNA-PX330-mCherry质粒构建：用Bbs1酶切载体之后与sg RNA退火产物进行连接并转化；挑克隆进行菌液PCR验证正确之后，抽质粒，备用。
c.验证性target-GFP reporter质粒构建：将包含sgRNA在内的切割位点(80bp)，前后加入BamHI和HindIII末端，Target:ATGAACTCCA CCTGGGATGG TAATCAGAGC AGCCATCCTTTCTGTCTTCT GGCACTGGGC TACTTGGAAA CTGTCAGGTT；
用BamHI和HindIII切载体酶切GFP reporter载体后与target退火产物进行连接，转化；挑克隆进行菌液PCR验证正确之后，抽质粒，备用；
d.sgRNAs效果验证：将sg RNA/PX330-mCherry质粒与target-GFP reporter质粒共转HEK293T细胞，如果转入细胞中的target-GFP reporter质粒中target序列有双链断裂则细胞会表达GFP，在转染后第48h拍照，看sgRNAs切割效率。
根据小鼠GPR21基因，即GenBank：NM_005294.3序列，基于CRISPR-Cas9系统设计构建sgRNA靶点，所述的步骤a中设计的sgRNA靶点的序列为：
sg1 GCTCTGATTACCATCCCAGG sg2 GGGATGGTAATCAGAGCAGC
sg3 GTGCCAGAAGACAGAAAGGA。
上述的步骤b的卵母细胞注射方法的具体步骤为：将sgRNA靶点与C as9蛋白混匀，将其注射到C57BL/6小鼠单细胞受精卵的胞浆中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，代孕鼠产出小鼠，即F0代小鼠。
上述GPR21基因敲除小鼠模型在糖尿病的发病研究中的应用。
有研究表明GPR21是2型糖尿病的新靶标，GPR21敲除小鼠显示出更好的葡萄糖耐量和胰岛素反应。本发明GPR21基因敲除小鼠模型为进一步研究糖尿病的发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型，具有良好的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明中构建的GPR21基因敲除小鼠模型模式图；
图2为本发明中设计sgRNA的敲除效率验证图；
图3为本发明中F0代小鼠基因型鉴定图。
具体实施方式
实施例一：
1)对小鼠GPR21基因，设计基因敲除策略，敲除区域选择为第2号外显子；
2)设计GPR21基因的sgRNA
根据小鼠GPR21基因(GenBank：NM_005294.3)序列，基于CRISPR-Cas9系统设计sgRNA；所述GPR21的sgRNA序列如表1。
表1：mGPR21的sgRNA序列
靶点编号
靶点序列
sg1
GCTCTGATTACCATCCCAGG
sg2
GGGATGGTAATCAGAGCAGC
sg3
GTGCCAGAAGACAGAAAGGA
。
验证性target-GFP reporter质粒构建：将包含sgRNA在内的切割位点(80bp)，前后加入BamHI和HindIII末端，Target:ATGAACTCCA CCTGGGATGG TAATCAGAGC AGCCATCCTTTCTGTCTTCT GGCACTGGGC TACTTGGAAA CTGTCAGGTT；
用BamHI和HindIII切载体酶切GFP reporter载体后与target退火产物进行连接，转化；挑克隆进行菌液PCR验证正确之后，抽质粒，备用；
2)sgRNA切割效率验证
将3条sgRNA构建至PX330-mCherry载体中，该载体包含S.pyogenes Cas9序列，并表达mCherry红色荧光蛋白。Target-GFP-reporter载体与sgRNA-PX330-mCherry载体共转入HEK 293T细胞，错误的GFP序列在插入片段被sgRNA剪切后，会通过同源重组原理重组成可正常表达的GFP，发出绿色荧光(图2)。第三条sgRNA的体外切割效率相对较高，因此后续选择其进行显微注射实验。
3)卵母细胞显微注射
将sgRNA与Cas9蛋白混匀，使用显微注射仪将其注射到C57BL/6小鼠单细胞受精卵的胞浆中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，代孕鼠产出小鼠，即F0代小鼠。
4)F0代小鼠基因型鉴定
显微注射实验共出生21只F0代小鼠，使用酚-氯仿抽提法抽取小鼠脚趾的基因组DNA，稀释至20ng/μL备用。选取靶基因前后共约500bp序列进行PCR，PCR产物连入PMD-19T载体，转化并涂板，每个样品挑取6个克隆进行测序鉴定(表2)。测序结果显示#17小鼠的一条染色体在sgRNA靶点附近敲掉了10个碱基，并使GPR21基因发生移码突变(图3)。
表2：F0代小鼠基因型鉴定
编号
基因型
编号
基因型
1♂
KO 4bp(2/4)
12♀
WT
2♂
WT
13♀
WT
3♂
KO 2bp(2/5)
14♀
KO 3bp(2/4)
4♂
WT
15♀
WT
5♂
WT
16♀
KO 12bp(1/4)
6♂
WT
17♂
KO 10bp(6/6)
7♂
WT
18♀
WT
8♂
KO 12bp(4/5)
19♀
WT
9♂
WT
20♀
KO 7bp(2/5)
10♀
WT
21♀
WT
11♀
KO 4bp(3/5)
5)F1代小鼠配繁及基因型鉴定
待F0代#17雄性小鼠7周龄，与野生型异性小鼠交配获得杂合子小鼠F1代，小鼠出生后20天进行基因型鉴定(表3)，若有在sgRNA靶点附近敲掉了10个碱基小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞。
表3：F1代小鼠基因型鉴定
<110> 上海大学，中国科学院上海药物研究所
<120> GPR21基因敲除小鼠模型及其建立方法
<160> 3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 基因序列
<400> 1
GCTCTGATTACCATCCCAGG 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 基因序列
<400> 1
GGGATGGTAATCAGAGCAGC 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 基因序列
<400> 1
GTGCCAGAAGACAGAAAGGA 20
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：用于重组基因表达的截短的启动子