一种用于单细胞检测的高效进样系统和使用方法
阅读说明：本技术 一种用于单细胞检测的高效进样系统和使用方法 (Efficient sample introduction system for single cell detection and use method ) 是由 华道柱 王涛 方奕彪 吉海泉 张立琛 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于单细胞检测的高效进样系统,包括对注射器输出的待测样品进行雾化而形成气溶胶的雾化器、用于降低超大粒径的样品细胞表面的溶剂的雾化室及具有内、外两个独立的腔室浓缩器。本发明基于空气动力学原理,对细胞样品进行浓缩及去除检测样品细胞外的其它细胞或杂质,提高进入矩管的细胞数浓度及电离效率,增加细胞样品在矩管中心电离区域数量,进而提高仪器检测灵敏度；在相同的灵敏度下,降低ICP源RF线圈负载功率需求,减少用于冷却的气体消耗。(The invention discloses a high-efficiency sample introduction system for single cell detection, which comprises an atomizer for atomizing a sample to be detected output by an injector to form aerosol, an atomizing chamber for reducing a solvent on the surface of a sample cell with an ultra-large particle size and a concentrator with an inner cavity and an outer cavity which are independent. Based on the aerodynamic principle, the cell sample is concentrated, other cells or impurities outside the cells of the detected sample are removed, the cell number concentration and ionization efficiency entering the rectangular tube are improved, the number of ionization areas of the cell sample in the center of the rectangular tube is increased, and the detection sensitivity of an instrument is improved; at the same sensitivity, the power requirement of the load of the ICP source RF coil is reduced, and the gas consumption for cooling is reduced.)
技术领域
本发明属于分析与检测仪器技术领域，具体涉及一种用于单细胞检测的高效进样系统和使用方法。
背景技术
细胞是生物体结构和功能的基本单元，想要探索生命机体的工作机制，一般需要以细胞为研究对象，对细胞的生长、繁殖、凋亡、遗传以及进化等进行深入的研究。但是，由于条件的限制，传统方法通常以集群细胞为研究对象，获得细胞在平均水平上的信息。然而细胞之间往往存在巨大的差异，因此需要建立基于单细胞水平的分析方法更准确的解释细胞对生命活动的作用机理。目前，基于质谱技术的单细胞分析方法主要有单细胞ICP-MS（SC-ICP-MS）和质谱流式细胞术（Mass Cytometry），其中SC-ICP-MS可以直接分析单细胞中的元素种类和含量，Mass Cytometry可以对单细胞进行多参数检测。这两种技术均是基于ICP等离子体源，通过前端的进样系统产生单细胞待测样品，然后进入等离子体电离，最后通过质谱进行检测。但是存在两个问题：1）ICP检测细胞样品的灵敏度有待进一步提高，往往通过提高ICP射频功率的方式解决，但同时导致冷却气消耗大幅增加；2）样品细胞通过载气从雾化室进入炬管，整体束径较发散，影响ICP的电离效率。
针对上述存在的技术问题，目前主要的解决方法是通过改进炬管、雾化器或者雾室结构提高检测灵敏度。比如图1，Alexander等通过新设计的雾化系统，细胞的传输效率为75.0±4.7%。但进入ICP炬管的载气和雾化气较多，样品细胞的数浓度仍然较低。专利（US2017/0098532）设计了一种新的用于细胞进样的雾化室，结构如图2所示，分为减速区和加速区两部分，且带加热功能，可实现对样品细胞的去溶剂。该方式属于细胞进样中比较传统的方式，对检测灵敏度提高有限。又如图3，ALAVI等人（WO 2019/144220 A1）设计了一种锥形的炬管，可使冷却气氩气的消耗量减少70%，因此同等条件下可以提高施加到线圈的射频功率，即提高检测灵敏度。另外，还有学者设计了冷却氩气的回收系统，间接提高射频功率，但是设计上比较复杂，难以推广。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种用于单细胞检测的高效进样系统和使用方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的一种用于单细胞检测的高效进样系统，其特征在于包括雾化器、雾化室及浓缩器三部分；
雾化器，通过雾化毛细管连接至注射器，对注射器输出的待测样品进行雾化而形成气溶胶；
雾化室，其前端设置有雾化器接口、后端设置有尾端出口，靠近雾化器接口的侧壁上设置有载气支管，所述雾化器接口用于将雾化器沿雾化室轴向插入固定，从而将气溶胶通入雾化室，所述载气支管用于将载气通入雾化室，所述载气携带气溶胶从尾端出口输出；
浓缩器，其前端设置有雾化室连接口，用于雾化室的连接安装，所述浓缩器具有内、外两个独立的腔室，内腔室内同轴安装有加速孔和接收孔，所述接收孔的另一端与矩管相连，外腔室靠近出口端的侧壁上通过支管与外围流量计和泵相连。
进一步地，所述雾化器还包括与雾化毛细管同轴安装的雾化器外管及雾化器内管，所述雾化器外管靠近细胞悬液进样端设置有雾化气支管。雾化器主要用来产生单细胞样品，通过外围的进样管路注入细胞悬液，细胞悬液通过雾化毛细管注入，同时采用雾化气进行雾化。
细胞悬液通过雾化器作用后，得到不同粒径的细胞样品，同时雾化气也一同进入雾化室；雾化室中，一般有加热装置，用于降低一些超大粒径的样品细胞表面的溶剂；雾化室中的载气支管用于通入一定流量的载气，使产生的细胞样品进入下一级浓缩器。
浓缩器中，细胞样品与载气、雾化气组成的气体在加速孔中实现分离。样品细胞粒径相对较大，一般在微米量级，因此在加速孔的作用下，其运动惯性远大于气体。故通过外围的流量计与泵抽取一定流量的气体，使得进入下一级接收孔的气体流量降低，从而提高样品细胞的单位体积数浓度。
进一步地，所述加速孔上设置有延长管延伸到雾化室连接口，用于与雾化室的尾端出口相连。
进一步地，所述加速孔的孔径小于接收孔的孔径，且加速孔和接收孔之间留有间隙。加速孔孔径优化在0.5mm-1.5mm，加速孔与接收孔之间的间隙优化在1-2mm范围内。
进一步地，所述内腔室周壁上均布设置有内腔抽气孔，且内腔抽气孔对应加速孔和接收孔之间的间隙设置。外腔室通过内腔室壁上均匀分布的圆孔进行抽气，外围流量计与泵连接外腔室侧管进行抽气。
进一步地，所述加速孔呈锥形设置，可提高样品细胞惯性与气体扩散，接收孔呈反锥形设置，可使接收的样品细胞速度下降，提高样品细胞与等离子体源的接触时间，提高电离效率。
所述的一种用于单细胞检测的高效进样系统的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将配制好的待测细胞悬液通过泵送的方式从注射器中泵送至雾化毛细管，进而注射到雾化器中；
2）同步开启雾化气支管，通入雾化气，在雾化气的作用下，细胞悬液通过雾化器雾化后获得细胞样品，进入雾化室；
3）同步开启载气支管通入载气，样品细胞在雾化气和载气的共同作用下进入浓缩器，进行气粒分离，分离后的细胞样品快速通过加速孔后进入到接收孔中，在剩余气体的作用下进入矩管进行后续质谱检测，完成进样。
进一步地，雾化气支管和载气支管上均设置有流量计，雾化气流量为0.15-0.35L/min，雾化气＋载气的总流量为0.8-1.2L/min。
本发明由于采用上述技术方案，其具有以下优点：
1）通过对细胞样品进行浓缩，提高了进入矩管的细胞数浓度，增加细胞样品在矩管中心电离区域数量，进而提高仪器检测灵敏度；
2）通过设置的浓缩器，实现空气动力学分离去除检测样品细胞外的其它细胞或杂质，提高待测样品的电离效率，提升系统检测的灵敏度；
3）在相同的灵敏度下，降低ICP源RF线圈负载功率需求，减少用于冷却的气体消耗。
附图说明
图1为现有技术中的雾化系统图；
图2为现有技术中细胞进样的雾化室结构图；
图3为现有技术中锥形的炬管结构示意图；
图4为本发明进样系统的结构示意图；
图5为本发明浓缩器的剖面图；
图6为本发明基于CFD软件仿真的不同粒径细胞的轨迹图；
图7为本发明整体的流程图；
图中，1-雾化器，101-雾化毛细管，102-雾化器外管，103-雾化器内管，104-雾化气支管，2-雾化室，201-雾化器接口，202-尾端出口，203-载气支管，3-浓缩器，301-雾化室连接口，302-内腔室，303-加速孔，304-接收孔，305-外腔室，306-支管，307-延长管，308-间隙，309-内腔抽气孔，4-矩管，5-外围流量计，6-泵。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明做进一步说明，应当理解，以下所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
如图4所示，本发明一种用于单细胞检测的高效进样系统，包括雾化器1、雾化室2及浓缩器3三部分。
其中，雾化器1，通过雾化毛细管101连接至注射器，对注射器输出的待测样品进行雾化而形成气溶胶；包括同轴设置的雾化器外管102、雾化器内管103及雾化毛细管101，雾化器外管102靠近细胞悬液进样端设置有雾化气支管104，雾化气支管104用于通入雾化气，对待测的细胞悬液进行雾化，其上设置有流量计，用于定量通入雾化气。
雾化室2，其前端设置有雾化器接口201、后端设置有尾端出口202，靠近雾化器接口201的侧壁上设置有载气支管203，用于通入一定量的载气，使产生的细胞样品进入下一级浓缩器3，雾化器接口201用于将雾化器1沿雾化室2轴向插入固定，从而将气溶胶通入雾化室2。
浓缩器3，其前端设置有雾化室连接口301，用于雾化室2的连接安装，该浓缩器3具有内、外两个独立的腔室，内腔室302内同轴安装有锥形结构的加速孔303和反锥形结构的接收孔304，加速孔303上设置有延长管307延伸到雾化室连接口301，用于与雾化室2的尾端出口相连，接收孔304的另一端与矩管4相连，外腔室305靠近出口端的侧壁上通过支管306与外围流量计5和泵6相连。加速孔303的孔径小于接收孔304的孔径，且加速孔303和接收孔304之间留有间隙308，内腔室302的周壁上对应间隙308的环状位置上均布设置有内腔抽气孔309。
如图5所示，浓缩器3的半剖面图，可以看出结构的左边为加速孔303，通过一个延长管307与雾化室2连接。加速孔303孔径为0.8mm，接收孔304孔径为1mm，两个孔的端面相距1mm。浓缩器3结构中，内腔室302的壁上均匀分布六个内腔抽气孔309，外腔室305的出口侧边，一根支管306用于连接外围的流量计5和泵6。浓缩器3出口连接炬管4。
本发明进样系统的使用方法，具体步骤为：
1）通过蠕动泵或者注射泵或者其他方式，将配置好的待测细胞悬液导入雾化器1；
2）通过流量计经过雾化气支管104通入雾化气，对于细胞样品，雾化气流量一般比较低，以当前商品化的仪器为例，雾化气流量一般为0.15-0.35 L/min；
3）在雾化气的作用下，细胞悬液通过雾化器1雾化，进入雾化室2，一般样品细胞粒径在10μm以下，中心粒径在几个微米，但同时也有大于10μm的细胞和粒径较小的细胞；
4）通过流量计经过载气支管203通入载气进入雾化室2，将细胞样品带入下一级系统，一般流量在1 L/min左右。雾化室2可通过加热减少细胞样品表面的溶剂，降低细胞的粒径，同时防止细胞样品在雾化室2表面聚集成大团簇；雾化室2上设置的加热装置为现有技术，不做具体描述，参考现有技术即可；
5）细胞样品在雾化气和载气的作用下进入浓缩器3，由于气体（或者小粒径细胞样品）相对细胞样品（μm量级）的惯性小很多，因此，在加速孔处，气体发生膨胀而发散，而细胞样品能快速通过加速孔303，然后进入接收孔304。在气粒分离的过程中，采用外接泵和流量计配合对气体进行提取，最终通过外围排废系统排除。比如，雾化气+载气的总流速为1 L/min，通过泵抽取0.9 L/min，这样随细胞样品进入炬管的剩余气体流速为0.1L/min，即细胞数浓度提高了10倍，表现在质谱信号上，待测信号理论上会提高10倍；
6）细胞样品经过气粒分离，使得样品细胞浓度浓缩，在剩余气体的作用下进入炬管4，由于样品细胞数浓度提高，因此质谱信号会同步提高，整体仪器灵敏度有量级上的提高。同时，基于该方法，还有另外的优势，雾化气&载气进入ICP源的量大大减少，可有效降低气体对等离子体中心焰炬分布的影响，小粒径细胞样品由于弱惯性，随泵抽除，也可以降低其对ICP的消耗。另一方面，考虑到冷却氩气的消耗问题，我们可以在适当降低RF线圈负载功率的情况下，降低冷却氩气，而同时保持仪器检测灵敏度保持在相对较好的水平。
如图6所示，基于建立的浓缩器简单模型，通过CFD软件对该结构进行了样品细胞运动轨迹仿真。选择粒径Dp=0.1μm、0.5μm以及2μm等三种粒径细胞作为研究对象，进气总流量为1L/min，随样品细胞一起进入浓缩器，泵抽取流量为0.1L/min，通过CFD模块和粒子追踪模块耦合得到样品细胞的运动轨迹。可以发现，当Dp=0.1μm时，样品细胞通过接收孔的占比只有8%，绝大部分都随泵的抽取而被排除；当Dp=0.5μm时，样品细胞随惯性进入接收孔的占比有42%；当Dp=2μm时，样品细胞能够实现100%的提取，且整体束径得到约束。因此，基于该方法，能够实现样品细胞的高效提取。
本发明使用流程如图7所示,细胞悬液通过注射泵或者自动进样器导入，通过一根软管输入雾化器，雾化器中间的雾化毛细管将样品输出，在支路雾化气的作用下雾化。单细胞样品进入雾化室，雾化室外围包裹加热装置，用于超大粒径样品细胞的去溶剂。在载气和雾化气的作用下，样品细胞进入加速孔。此时，由于外围配置了流量计和泵，通过抽取一定的气体流量，实现样品细胞和气体的分离，即样品细胞实现了浓缩，然后穿过接收孔，在接收孔，样品细胞运动速度下降，然后随剩余的气体一同进入炬管，在炬管末端等离子体源处实现去溶剂、气化和电离。最后离子穿过真空接口进入质谱检测。
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