具体实施方式

已知巨噬细胞是局部存在于体内的各种组织，并引起对异物、病原体的免疫应答的细胞，也参与炎症。巨噬细胞从未分化状态的M0巨噬细胞(以下有时简写为M0)分化为M1型和M2型。M1巨噬细胞(以下有时简写为M1)作为炎症型、M2巨噬细胞(以下有时简写M2)作为修复型(抗炎症型)是已知的。报告了M1巨噬细胞与M2巨噬细胞的平衡的不均衡与肥胖、2型糖尿病、动脉硬化这样的疾病相关(专利文献4～6，非专利文献1～5)。然而，关于皮肤光老化、色素沉着与M1/M2平衡的关系，不清楚。

本发明者们发现在接触光的皮肤、色素沉着发生的部位特异性地这些M1巨噬细胞与M2巨噬细胞的平衡(M1/M2平衡)紊乱，调整M1/M2平衡在光老化、色素沉着的预防改善中是特别重要的。进一步，本发明者们也发现如果以M1/M2平衡作为皮肤光老化、色素沉着的指标，向对象的皮肤施加特定的物理刺激则发挥令人满意的效果。更具体而言，可知即使是光老化了的皮肤、发生了色素沉着的皮肤，如果以特定的伸展率施加例如以1Hz以下、10Hz以下这样的60Hz以下的频率进行的物理刺激，则M1/M2平衡被调整/改善。此外，本发明者们以M1/M2平衡作为皮肤光老化、色素沉着的指标，筛选了各种物质，结果也发现，小连翘提取物、以氨甲环酸甲酰胺为代表的本发明的化合物、百里香提取物、黄檗、和桉树提取物具有调整/改善M1/M2平衡的效果，作为抗光老化剂、抗色素沉着剂发挥功能。小连翘提取物中被报告了I型胶原产生促进作用、育毛作用等(专利文献9、10)。以氨甲环酸甲酰胺为代表的本发明的化合物被报告了肌肤粗糙改善作用、美白作用、抗变态反应作用等(专利文献11、14等)。百里香提取物被报告了抗变态反应作用、抗菌作用等(专利文献12、13)。黄檗也作为止泻药、胃药、针对消化不良、食欲不振的内服药、或针对跌打损伤、扭伤的外用药而使用，也被报告了抗菌、抗氧化、皮肤屏障功能改善效果、色素细胞激活效果等(专利文献16、17)。桉树提取物被报告了抗菌、抗氧化作用等(专利文献18)。然而，这些物质具有调整/改善M1/M2平衡的作用对于本发明者们而言是这次首次发现的。

因此，本发明提供通过调整M1/M2平衡而用于预防和/或改善光老化和/或色素沉着的方法、装置、和抗光老化和/或色素沉着抑制剂。本发明的方法是以美容作为目的的方法，有时不是通过医生、医疗从业者进行的治疗。

在本说明书中，色素沉着是指真皮和表皮中的黑素等色素的沉着。本发明在真皮和表皮中都是有效的，特别是，在除了通过噬黑素细胞进行的吞噬以外改善方法被限制这样的含义下，作为针对真皮的色素沉着的对策而大受期待。通过本发明的制剂的应用，由色素沉着引起的斑、暗沉、黑眼圈等被改善。此外，对于由于向真皮层注入色素而一旦加入色素就难以消去的刺青、纹身等的消色也是有效的。

M1巨噬细胞可以用CD86、CD80、iNOS等标志物测定。M2巨噬细胞可以用CD206、CD163、Agr1等标志物测定。作为包含M1和M2的巨噬细胞全体的标志物，可举出CD11b、CD68等。补充或替代地，可以通过定量IL-1beta、TNF-alpha这样的M1特异性的细胞因子、IL-10这样的M2特异性的细胞因子来测定。然而，只要是能够测定M1/M2平衡的标志物，就不限定于上述标志物。

在本说明书中，所谓M1/M2平衡，可以是指M1巨噬细胞的数与M2巨噬细胞的数的比率，也可以是指M1巨噬细胞的标志物(例如，CD86、CD80、iNOS等)的mRNA量与M2巨噬细胞的标志物(例如，CD206、CD163、Agr1等)的mRNA量的比率。在光老化状态的皮肤中M1的比率高、M2的比率低，此外黑素吞噬作用高的是M2，因此M1/M2平衡的调整/改善可以是使M2相对于M1的比率(M2的数/M1的数、和/或M2标志物的mRNA量/M1标志物的mRNA量)上升。上升可以是例如具有将显著性水平设为5％的统计学上的显著性差异(例如学生t检验)的上升、和/或可以是例如1％以上、5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上的上升。或M1/M2平衡的调整/改善可以是使M2相对于M1的比率(M2的数/M1的数、和/或M2标志物的mRNA量/M1标志物的mRNA量)为一定的范围内，例如，约4/6～约9/1、约5/5～约8/2、约5/5～约7/3等，可以接近于上述范围，也可以维持在上述范围内，可以以上述范围为中心而保持稳态。

M1/M2平衡的调整/改善可以通过向皮肤施加伸展刺激、按下刺激、按摩等物理刺激来实现。M1/M2平衡的调整/改善包含对皮肤应用微弱的物理刺激的工序，本发明的装置是用于进行对皮肤应用微弱的物理刺激的工序的装置，其中该工序例如可以以60Hz以下的频率进行循环，上述循环包含下述步骤：(a)将皮肤伸展至0.1％～50.0％的伸展率；和(b)从伸展状态恢复。

伸展率通过上述式1计算出。物理刺激可以以0.001％～80.0％、0.01％～60.0％、0.1％～50.0％、优选为0.1％～50.0％的伸展率进行。可以采用例如0.1％～1.0％、0.1％～5.0％、0.1％～10.0％、0.1％～20.0％、0.1％～30.0％、1.0％～5.0％、1.0％～10.0％、1.0％～20.0％、1.0％～30.0％、1.0％～50.0％、10.0％～20.0％、10.0％～30.0％等任意范围的伸展率。

伸展速度是指在1循环中达到最大伸展率(％)为止的速度(％/s)。恢复速度是指从最大伸展率恢复到非伸展状态的速度(％/s)。伸展速度/恢复速度可以以0.010％/s～40％/s、0.05％/s～30％/s、0.10％/s～20％/s、0.2％/s～15％/s、0.3％/s～10％/s等任意速度进行。伸展速度与恢复速度可以相同也可以不同。

M1/M2平衡的调整/改善包含对皮肤应用微弱的物理刺激的工序，本发明的装置是用于进行对皮肤应用微弱的物理刺激的工序的装置，其中该工序例如可以以60Hz以下的频率进行循环，上述循环包含下述步骤：(a-1)将上述对象的皮肤按压1μm～1000μm；和(b-1)使上述对象的皮肤从按压状态恢复。

所谓“将皮肤按压1μm～1000μm”，是指将皮肤按压直到距皮肤的最表面1μm～1000μm的深度。按压的深度能够任意设定为距皮肤的最表面1μm～1000μm、10μm～1000μm、10μm～300μm、10μm～100μm等。

频率是指将从伸展或按压开始起恢复到非伸展或非按压状态的循环设为1循环的情况下的每1秒的循环数。在1循环中，可以包含维持一定时间的伸展或按压状态和/或在非伸展或非按压状态下中止。例如，在1循环中，可以进一步包含：(a’)在(a)之后并且(b)之前、或(a-1)之后并且(b-1)之前，保持0秒～30分钟、1秒～20分钟、5秒～10分钟、或10秒～5分钟伸展或按压状态；和/或(b’)在(b)之后并且下个循环的(a)之前、或(a-1)之后并且(b-1)之前，在非伸展或非按压状态下中止0秒～30秒、0秒～20秒、0秒～10秒、1秒～10秒、1秒～20秒、1秒～10秒。频率可以为例如0.0000001Hz～10kHz、0.000001Hz～1kHz、0.00001Hz～100Hz、优选为0.0001Hz～60Hz、0.0001Hz～10Hz。可以采用例如0.001Hz～60Hz、0.01Hz～60Hz、0.001Hz～10Hz、0.01Hz～10Hz、0.1Hz～60Hz、0.1Hz～10Hz、0.5Hz～60Hz、0.5Hz～50Hz、0.5Hz～10Hz、0.5Hz～5Hz、0.5Hz～1Hz、0.001Hz～0.01Hz、0.001Hz～0.1Hz、0.001Hz～1Hz、0.01Hz～1Hz、0.1Hz～1Hz、1Hz～60Hz、1Hz～10Hz、1Hz～5Hz等任意范围的频率。

在市售的美颜器、按摩设备等中，有使用RF波这样的具有0.3～300MHz左右的频率的电磁波的、使用具有1MHz～7MHz左右的频率的超声波的等。与这些频率相比，本发明的方法/装置所采用的频率极其低。如果如以往的美颜器等那样对皮肤施加强的频率则有给皮肤带来发红、压痕、伤、疼痛、炎症这样的不良影响的风险，但如果采用本发明这样的频率则上述风险低，能够进行非侵袭性的物理刺激。这是因为本发明者们发现，如果伸展率和频率过高则刺激过强，因此通过将这些值调节为适当值，从而温和地刺激皮肤更加令人满意。

此外，以往，对于在该领域中一般利用的利用电动机等构件的美容设备类，基于该电动机的机械构件，只能选择超过60Hz的频率是本领域技术人员的技术常识。在采用作为现有技术中的美容设备类的限度的“60Hz”以下的频率例如60Hz以下、10Hz以下、1Hz以下这样的本发明这样的频率时，要求制作特别的机械的必要性。进一步，对于这样的低频率，在发挥本发明的效果时也有“过弱”这样的固定概念，迄今为止几乎没有研究。然而，本发明者们尝试使用从以往的技术常识考虑非常低的频率而实际上向皮肤施加物理刺激，结果令人惊讶的是，即使是这样的低频率的温和的刺激也发挥良好的效果。

虽然在EMS设备等中低中频的装置也被市售，但是它们特别是以在肌肉、皮下脂肪等的深层作用的方式设计的，对本申请发明这样的皮肤表层的影响是不明确的。此外，这样的装置即使频率低也有时在流过电流时伴有麻酥酥的刺激，与向皮肤施加温和的刺激的本申请发明不同。另一方面，本发明可以是通过不施加超声波、电流、磁场这样的能量，而直接向皮肤施加伸展刺激这样的简便的方法进行的美容法。进一步，具有这样的频率的伸展刺激是温和的刺激，并且如实施例所记载那样发挥M1/M2平衡的调整/改善作用。因此，如果使用本发明的方法/装置，则不对皮肤带来不良影响，而可期待光老化和/或色素沉着的预防和/或改善效果。

物理刺激可以是由美颜器等器具、实验的装置、使用了人手、器具的按摩、面部的运动产生的物理刺激，也可以是通过接触或非接触而实现的物理刺激。在一方案中，可以使用具备产生物理刺激的刺激产生部、和通过接触或非接触而施加物理刺激的刺激施加部的器械，对皮肤施加机械地产生的物理刺激。物理刺激例如可以通过对皮肤进行拉伸、按压、敲打、揉搓、吸引这样的接触来实现，和/或例如可以通过用超声波、空气压或水压等而向皮肤施加冲击波从而使其变位这样的非接触来实现。作为面部的运动，可以进行使面颊鼓起、睁眼睛等。作为按摩，可举出通过受施术的对象本身或美容成员等施术者进行的使用了手、滚轮等器具的按摩。然而，只要是本发明的物理刺激的范围内就没有限定。

作为本发明的装置，可举出例如，具备与使用者的皮肤接触而施加本发明的物理刺激的皮肤接触部的美容装置。例如，可以是由把持部和皮肤伸展部或皮肤按压部构成的装置。例如，图14左所记载的装置以通过皮肤接触部与皮肤接触，从而将皮肤以特定的频率和伸展率进行伸展的方式设计。

此外，例如，本发明的装置具备电源、刺激产生部、和皮肤刺激部，电源产生电信号，刺激产生部将来自电源的电信号转换成物理性刺激而产生物理刺激，皮肤刺激部可以接收由刺激产生部产生的物理刺激，向使用者的皮肤施加物理刺激。

例如，图14左所示的装置具备把持部、电源、控制物理性刺激的控制部、刺激产生部、和包含皮肤刺激部和皮肤固定部的皮肤接触部。以如下方式设计：使用者拿着把持部而将皮肤接触部放在皮肤上，通过皮肤固定部而将皮肤固定，通过操作控制部，从而来自电源的电信号被刺激产生部转换为物理性刺激，物理刺激传到皮肤刺激部，皮肤被固定于皮肤固定部同时通过皮肤刺激部而以特定的频率和伸展率被伸展。例如，刺激产生部可以是被电动机等驱动而将电信号转换为物理刺激的部分。此外，图14左所记载的皮肤刺激部是向皮肤施加伸展刺激的，例如，可以是向皮肤施加按压刺激的。

或者，本发明的装置可以是具备电源、控制物理性刺激的控制部、刺激产生部、和包含由片状材料形成的皮肤接触面的皮肤接触部的美容装置。作为例子，在图14右显示这样的美容装置的皮肤接触部。片状材料可以是能够流过电流，并将来自电源的电信号转换为物理性刺激的材料。作为这样的片状材料，可举出介电弹性体致动器(DEA)、导电聚合物、IPMC、PVC凝胶、Mckinnen型等。

本发明的装置的电源可以是内部电源或外部电源，也可以是充电式。此外，本发明的装置例如可以使用被保存于手机、云等的数据，也可以通过无线被远程操作。

物理刺激可以是通过施加上述那样的通过接触或非接触进行的物理性刺激来实现皮肤的伸展的刺激。物理刺激可以相对于皮肤表面沿平行方向、即横向施加，也可以相对于皮肤表面沿垂直方向、即纵向施加，或可以采用倾斜方向、扭转方向等任意方向。

进行物理刺激的循环数没有限定。例如，可以进行10～500循环、20～400循环、30～300循环、40～200循环、50～100循环这样的任意数的循环。例如，如实施例所记载那样，有时进行27循环也是充分的。

进一步，将这些任意数的循环设为1组，可以将该组进行任意数的组例如1～100组、2～50组、或3～10组。

进行物理刺激的时间也没有限定。例如，可以设置或不设置中止时间而重复循环，进行5分钟～3小时、10分钟～2小时、30分钟～1小时这样的一定时间。

循环间或组间的时间间隔也没有限定。例如，伸展或按压刺激可以单独进行1组或多组，也可以将1个或多组每天、2天、3天、4天、5天、6天、7天进行1次，1、2、3、4周进行1次等，连续或断续地定期或不定期地进行。

然而，只要达到对于发挥皮肤抗光老化和/或色素沉着抑制作用而言充分的刺激，就不限定于上述那样的频率、伸展率、循环数、频度。进行物理刺激的波形也可以任意设定为矩形波、正弦波、三角波、锯齿波等。

或者，M1/M2平衡的调整/改善可以是施与M1/M2平衡调整/改善剂或含有其的组合物。本发明者们发现本发明的化合物、小连翘提取物、百里香提取物、黄檗、和/或桉树提取物作为这样的M1/M2平衡调整/改善剂发挥功能。因此，本发明也提供由本发明的化合物、小连翘提取物、百里香提取物、黄檗、和/或桉树提取物构成，或包含本发明的化合物、小连翘提取物、百里香提取物、黄檗、和/或桉树提取物作为有效成分的M1/M2平衡调整/改善剂、抗光老化剂、色素沉着抑制剂、和含有它们的组合物。

在本申请说明书中“本发明的化合物”是指下述通式(1)所示的化合物、或其盐。

{式中，R₁和R₂相同或不同，各自表示氢原子、碳原子数1～18的直链状或支链状烷基、碳原子数5～8的环烷基、苄基或下述通式(2)，

(其中，X表示低级烷基、低级烷氧基、羟基、氨基、卤原子，且n＝0～3)}

特别优选本发明的化合物是N-甲基-反式-4-(氨基甲基)环己烷甲酰胺(氨甲环酸甲酰胺(C₉H₁₉C₁N₂O))或其盐。上述化合物例如可以通过专利文献14所记载那样的方法合成，也可以使用市售品。

小连翘(Hypericum erectum)为藤黄科金丝桃属的多年生植物。作为本发明所使用的小连翘的提取物，优选为小连翘的地上部的提取物，但在种子、根等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任1种或2种以上的提取物。小连翘的提取物也可以使用市售品。

百里香(Thymus)为唇形科百里香属的多年生植物。在本发明中，可以使用普通百里香(T.vulgaris)、柠檬百里香(T.x citriodorus)、亚洲百里香(T.serpyllum)等各种百里香。作为本发明所使用的百里香提取物，优选为百里香的全植株的提取物，但在种子、花、根等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任1种或2种以上的提取物。百里香的提取物也可以使用市售品。

黄檗为使芸香科黄檗(Phellodendron amurense)或川黄檗(Phellodendronchinense)的树皮干燥而得的生药。黄檗或其提取物可以通过常规方法制造，也可以使用市售品。

桉树为桃金娘科桉属(Eucalyptus)的树木。作为本发明所使用的桉树提取物，优选为桉树的叶的提取物，但在种子、花、树皮、根等中也包含有效成分，因此也可以使用它们之中的任1种或2种以上的提取物。桉树提取物可以通过常规方法制造，也可以使用市售品。

在使用提取物的情况下，提取方法没有特别限定，但优选为使用了溶剂的提取法。在进行提取时，也可以直接使用植物体，但粉碎成颗粒状、粉末状而供于提取可以在温和的条件下在短时间以高提取效率进行有效成分的提取。提取温度没有特别限定，根据粉碎物的粒径、溶剂的种类等来适当设定即可。通常，在室温～溶剂的沸点的范围内设定。此外，提取时间也没有特别限定，根据粉碎物的粒径、溶剂的种类、提取温度等来适当设定即可。进一步，在提取时，可以进行搅拌，也可以不搅拌而静置，可以施加超声波。

溶剂的种类没有特别限定，但优选为水、含水乙醇、乙醇等低级醇、己烷等有机溶剂、或己烷/乙醇这样的它们的混合溶剂。提取可以在常温下进行，也可以在加热下(例如使用温水、热水等加热了的溶剂)进行。此外，可以在溶剂中加入酶进行提取处理。通过加入酶，可以使植物的细胞组织崩解，由此可以更加提高提取效率。作为酶，优选使用细胞组织浸解酶。作为这样的酶，可举出例如，果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、α-淀粉酶、肌醇六磷酸酶。这些酶可以单独使用1种，也可以混合使用2种以上。

通过这样的提取操作，有效成分被提取，溶入到溶剂。包含提取物的溶剂可以直接使用，也可以施加灭菌、洗涤、过滤、脱色、脱臭等惯用的纯化处理后使用。此外，可以根据需要浓缩或稀释后使用。进一步，可以使溶剂全部挥发而制成固体状(干燥物)后使用，也可以将该干燥物再溶解于任意的溶剂后使用。

此外，通过将原料植物进行压榨而获得的压榨液中也包含与提取物同样的有效成分，因此也可以使用压榨液代替提取物。

然而，M1/M2平衡调整/改善剂、组合物不限定于上述物质，可以使用任意物质，例如，专利文献4～7等所记载的物质这样的已知M1/M2平衡调整/改善的公知的物质。其施与途径也可以任意选择例如经皮施与、经口施与、皮下施与、经粘膜施与、肌肉内施与等，但光老化是在接触光的部分的皮肤特异性地观察到的现象，因此也有时优选可以在皮肤的特定位置施与的经皮施与。此外，对于在表皮、真皮发生的色素沉着有时优选以能够从皮肤到达表皮、真皮的方式经皮施与。此外，M1/M2平衡的调整/改善例如可以是分化诱导成M2巨噬细胞，也可以采用其它任意的M1/M2平衡调整/改善法。

例如，本发明的药剂或组合物调整/改善M1/M2平衡，其结果抑制皮肤的光老化和/或色素沉着。本发明的M1/M2平衡调整/改善剂、抗光老化剂、色素沉着抑制剂(以下有时将它们总称为“本发明的制剂”。)可以单独含有上述有效成分的任1种，也可以以任意的组合和比率含有2种以上。

本发明的制剂也可以制成将上述有效成分与1种或2种以上其它成分例如赋形剂、载体和/或稀释剂等组合而成的组合物。组合物的组成、形态是任意的，根据有效成分、用途等条件来适当选择即可。该组合物根据其剂型而可以以与赋形剂、载体和/或稀释剂等及其它成分适当组合的处方，使用常规方法来制造。

本发明的制剂可以混配于化妆品等而使用于人和动物，或作为医药制剂而向人和动物施与。此外，也可以混配于各种饮食品、饲料而使人和动物摄取。

在将本发明应用于化妆品、药品、准药品等皮肤外用剂的情况下，植物体或其提取物的混配量(干燥质量)可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等来适当确定。例如，在化妆料总量中，可以混配本发明的化合物、小连翘提取物、百里香提取物、黄檗提取物、和/或桉树提取物各0.00001％～50％(在提取物或生药的情况下，为干燥质量换算)。

除了上述成分以外，进一步根据需要，在不损害本发明的效果的范围内，可以根据需要适当混配通常化妆品、药品、准药品等皮肤外用剂所使用的成分，例如抗氧化剂、油分、紫外线防御剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色料、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。

本发明的皮肤外用剂可以作为应用于外皮的化妆料、准药品等应用，特别适合作为化妆料应用，其剂型也只要是能够应用于皮肤的剂型，就没有限定，可应用溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水-油二层系、水-油-粉末三层系、软膏、化妆水、凝胶、气雾剂等任意剂型。

在使用本发明的制剂作为化妆品的情况下，可以作为化妆水、乳液、粉底、口红、唇膏、清洁霜、按摩膏、面膜、护手霜、洗手粉、洗澡液、爽身水、润体霜、浴用化妆品等形态而使用。

然而，本发明的制剂和组合物的能够采用的形态不限定于上述剂型、形态。此外，本发明的制剂或组合物可以与本发明的装置或方法或其它装置或方法等联合使用。

应用本发明的方法、装置、制剂和组合物的对象可以是客观或主观地确认了皮肤光老化和/或色素沉着(例如，真皮色素沉着)的对象，也可以是希望想要预防皮肤光老化和/或色素沉着的对象。例如，可以是判断为M1/M2平衡崩溃的对象。在1实施方式中，可以是以皮肤中的M1/M2平衡作为指标而判断为皮肤光老化度和/或色素沉着度(例如，真皮色素沉着度)高的对象。或者，可以是担心皮肤的光老化特异性的表型，例如斑、皱纹、松弛等的对象，也可以是担心表皮、色素沉着例如斑、暗沉、胎记、刺青的痕迹等的对象。斑、皱纹、松弛、暗沉、胎记、刺青的痕迹等可以通过视觉判定、使用公知的指标来确定。

此外，通过本发明，也提供抗光老化剂的筛选方法，其包含下述步骤：向生物体试样施与候选药剂；测定施与候选药剂前后的生物体试样中的M1/M2平衡；在将施与了上述候选药剂的生物体试样中的M1/M2平衡与施与该药剂前相比而改善的情况下，评价为上述药剂具有抗光老化和/或色素沉着抑制作用。也提供抗光老化和/或色素沉着抑制美容处置的评价方法，其包含下述步骤：向皮肤试样实施美容处置；测定实施美容处置前后的皮肤试样中的M1/M2平衡；在实施了上述美容处置的皮肤试样中的M1/M2平衡与实施该处置前相比而改善的情况下，评价为上述处置具有抗光老化和/或色素沉着抑制作用。通过本发明的方法，能够进行关于候选药剂或美容处置是否具有抗光老化和/或色素沉着抑制效果的筛选，能够进行制品开发、新的肌肤护理的提出。即，通过本发明，提供通过调整M1/M2平衡而用于预防和/或改善光老化和/或色素沉着的抗光老化剂和/或色素沉着抑制剂和抗光老化和/或色素沉着抑制美容处置。色素沉着可以是真皮色素沉着。

生物体试样可以使用皮肤试样、免疫细胞试样这样的任意试样。皮肤试样可以是采取后的皮肤试样，例如，从人等动物采取后的离体状态的皮肤试样，也可以是培养皮肤细胞，例如，单层或多层培养细胞、培养角质形成细胞或培养成纤维细胞这样的体外状态。或者，可以是3D皮肤模型等人工皮肤试样。免疫细胞试样可以是在采取后的皮肤中存在的免疫细胞、采取了浸润于皮肤的血液后的血液中的免疫细胞、培养免疫细胞等。3D皮肤模型虽然没有限定，但例如可以通过专利文献8、非专利文献10～12所记载的方法来制作，也可以为了易于测定M1/M2平衡而改变这样的方法来制作。生物体试样只要可以测定M1/M2平衡就没有限定。

例如，抗光老化和/或色素沉着抑制剂的筛选法可以通过使THP-1等免疫细胞分化为M0后，添加药剂培养一定时间，然后回收培养上清液，利用ELISA等测定法而定量IL-10这样的M2特异性的细胞因子等的量来实现。在这样的筛选法中，作为阳性对照，可以使用添加IL-4、IL-13等使其分化成了M2的细胞，进一步，可以将在IL-4、IL-13中加入了候选药剂的实验进行比较。即，M2由于IL-10产生能力高，因此如果上清液中的IL-10在M0分化后，与仅用培养基培养了的对照(control)比较而增加，则可以说向M2分化了，可以将这样的药剂设为“改善剂”，其中，可以在IL-4、IL-13等的存在下将药剂的有无进行比较而评价IL-10的量是否产生差异。

在本说明书中所谓候选药剂，是指对于抗光老化和/或色素沉着抑制效果进行调查的药剂，除了作为制品已经销售的药剂以外，也包含开发阶段的药剂，进一步可以是在化妆料的开发中被选择为化妆料用的药剂。

作为美容处置，没有特别限定，包含例如包含本发明的制剂或其它成分的化妆料的涂布等被认为对光老化和/或色素沉着抑制有效的任意处置。所谓化妆料，是指应用于皮肤的化妆料，是指例如化妆水、乳液、美容液、霜、粉底等，但不限定于此，意指包含即使不是以皮肤状态的改善作为直接的目的，但涂布于皮肤的全部物质，例如，也包含防晒剂等。或者，美容处置例如可以是向皮肤施加伸展刺激、按下刺激、按摩等物理刺激。美容处置可以是一次处置，也可以是从几天到几周进行的连续处置。美容处置可以个人进行，也可以在美容室、化妆品的销售店、美容沙龙等进行。

此外，本发明也提供包含例如能够测定M1、M2的数的检测CD86、CD206、CD163等任意标志物的抗体、测定这些标志物的mRNA量的药剂这样的用于测定M1/M2平衡的药剂的抗光老化和/或色素沉着抑制剂的筛选试剂盒。进一步本发明也提供以下方法、系统、装置。

通过1个或多个计算机而执行的对象的皮肤的光老化和/或色素沉着度的评价方法，其具有下述步骤：取得关于预先设定的皮肤的M1/M2平衡的基准值的数据的步骤；取得关于对象的皮肤的M1/M2平衡的数据的步骤；参照上述基准值，与上述关于对象的皮肤的M1/M2平衡的数据比较而进行计算的步骤；基于通过上述计算步骤而计算的结果来评价上述皮肤的光老化和/或色素沉着度的步骤；和显示通过上述评价步骤评价而得的结果的步骤。

对象的皮肤的光老化和/或色素沉着度的评价方法，其包含下述步骤：由服务器的分析部通过使用了利用神经网络进行的方法的机械学习，来分析皮肤的M1/M2平衡与光老化和/或色素沉着度的关系的步骤，所述利用神经网络进行的方法使用了基于被存储于存储部的关于皮肤的M1/M2平衡和光老化和/或色素沉着度的数据的教师数据；由上述服务器的接收部接收对象的皮肤的M1/M2平衡的数据的步骤；和由上述服务器的评价部基于上述分析出的关系，以上述接收到的对象的皮肤的M1/M2平衡作为输入，评价对象的皮肤的光老化和/或色素沉着度并输出的步骤。

评价对象的皮肤的光老化和/或色素沉着度的系统，其具有：存储关于预先设定的皮肤的M1/M2平衡的基准值的数据的数据库部；输入关于对象的皮肤的M1/M2平衡的数据的数据输入部；参照在上述数据库部被存储的基准值，与通过上述数据输入部被输入的上述关于对象的皮肤的M1/M2平衡的数据比较而进行计算的计算部；基于由上述计算部得到的计算结果来评价上述皮肤的光老化和/或色素沉着度的评价部；和显示通过上述评价部评价而得的结果的显示部。

光老化和/或色素沉着度算出装置，是使用关于对象的皮肤的M1/M2平衡的数据，算出对象的皮肤的光老化和/或色素沉着度的光老化和/或色素沉着度算出装置，上述装置具备如果输入关于对象的皮肤的M1/M2平衡的数据，则算出上述对象的光老化和/或色素沉着度的算出部，上述算出部具有实施了使用教师数据的机械学习处理的已学习的神经网络，以便在输入关于皮肤的M1/M2平衡的数据时，算出所推定的光老化和/或色素沉着度。

通过本发明的方法、系统、装置，能够测定基于M/M2平衡的客观的光老化和/或色素沉着度。

实施例

接下来通过实施例进一步详细地说明本发明。另外，本发明不受此限定。

实验1：组织染色

将图1a所示的年龄的低龄者(20多岁～30多岁)和发生了光老化的高龄者(60多岁～70多岁)的白色人种来源的眼梢的皮肤制成冷冻切片，切薄片后，用以下所示的巨噬细胞的标志物染色。

(1)M1巨噬细胞的染色：用山羊来源的抗人CD86抗体(R&D)和兔来源的抗人CD11b抗体(abcam)进行了双重染色(图1b)。

(2)M2巨噬细胞的染色：用小鼠来源的抗人CD206抗体(BD)或小鼠来源的抗人CD163抗体(Leica)和兔来源的抗人CD11b抗体(abcam)进行了双重染色(图1c)。

(3)总巨噬细胞的染色：用小鼠来源的抗人CD68抗体(abcam)和兔来源的抗人CD11b抗体(abcam)进行了双重染色。

将对直到表皮紧下方200μm的(1)～(3)的抗体双重为阳性的细胞作为各巨噬细胞而计数(图1d)。此外，为了研究M1、M2巨噬细胞与胶原产生的关系，用山羊来源的抗人CD86抗体(R&D)和大鼠来源的抗前胶原抗体(Millipore)、或小鼠来源的抗人CD206抗体(BD)和大鼠来源的抗前胶原抗体(Millipore)进行了双重染色(图1e左)。

将(1)～(3)的组织染色示于图1b、c中，将计数结果的图示于图1d中，将用M1、M2巨噬细胞抗体和抗前胶原抗体进行了双重染色的结果示于图1e左中。如图1b、c、d所示那样，对于发生了光老化的高龄者，大量观察到M1巨噬细胞，另一方面，M2巨噬细胞减少了。更具体而言，如图1b所示那样，M1巨噬细胞对于低龄者仅在血管周边存在，另一方面，对于高龄者在组织全体散在。此外，如图1c所示那样，M2巨噬细胞对于低龄者存在于组织全体，另一方面，对于高龄者其数减少了。进一步，如图1d所示那样，在低龄者与高龄者之间，巨噬细胞的总数(M1的数+M2的数)没有变化，仅M1/M2平衡变化了。对于低龄者，M2相对于M1的比率(M2的数/M1的数)在约5/5～约7/3的范围内，另一方面，对于高龄者，M2相对于M1的比率剧烈减少，M1/M2平衡大幅崩溃，与低龄者的值显著不同。

进一步，如图1e左上的2张照片那样，无论低龄者、高龄者，M1巨噬细胞与前胶原的位置都偏移，另一方面，如左下的2张照片那样对于M2巨噬细胞和前胶原，观察到位置的一致。因此，提示可能如图1e右图的示意图所示那样，以M1促进胶原的破坏、M2促进胶原生成的方式作用于成纤维细胞。

实验2：THP-1的M1、M2分化刺激实验

按照非专利文献1所记载的方法，使用作为人来源的确立细胞株的THP-1，向M1、M2巨噬细胞分化诱导。具体而言，通过图2a所示的方法，在RPMI1640(Nakalai)中添加1mM丙酮酸钠(Nakalai)、2mM L-谷氨酰胺(Nakalai)、10％FBS对THP-1进行了培养。然后，进一步加入100nM PMA(abcam)而刺激24小时，使其分化为巨噬细胞。在分化为M1时进一步加入100ng/mL LPS(sigma)和20ng/mL IFNγ(R&D)而刺激24小时，在分化为M2时进一步加入20ng/ml IL-4(R&D)和20ng/mL IL13(R&D)而刺激24小时。用显微镜观察，如图2b所示那样确认了形态变化了。

此外，提取各自的分化后或未分化的状态原样的细胞的mRNA，使用IL-1beta、TNF-alpha、IL-10的探针(Applied Biosystems)通过TaqMan基因表达测定系统进行实时PCR，定量了表达量(图2c上图)。进一步，使用与实验1相同的CD86抗体(R&D)、CD206抗体(BD)，同样地进行PCR而定量了表达量(图2c下图)。各自的值用GAPDH的mRNA表达量进行了校正。

如图2c所示那样，显示出通过实验2所记载的方法进行了分化的巨噬细胞分别产生对M1特征性的炎性细胞因子(IL-1beta、TNF-alpha)和对M2特征性的抗炎性细胞因子(IL-10)。进一步，这些分化诱导巨噬细胞分别显示出作为M1、M2巨噬细胞的表面标志物的CD86、CD206表达的增加。由这些结果确认了分化诱导成功了。因此，将通过实验2的方法进行了分化的M1、M2巨噬细胞和未分化的M0巨噬细胞在以下实验3、4中使用。

实验3：M1、M2巨噬细胞上清液的对成纤维细胞的添加实验

如图3a所示那样，通过与实验2同样的方法将THP-1分化成M1、M2后或以M0的未分化的状态下原样，除去上清液，用PBS洗涤1次后，加入培养基培养48小时。将包含炎性/抗炎性细胞因子这样的M1、M2的分泌物的这些上清液添加于新生儿来源的成纤维细胞。作为对照(control)，使用了添加了RPMI1640(Nakalai)的细胞。在上清液的添加后，将成纤维细胞培养72小时，将上清液中的前胶原量用PIP ELISA kit(TAKARA)定量(图3b)。细胞流分用兔来源的抗人胶原抗体(CEDERLANE)和生物素化透明质酸结合蛋白(HOKUDO)进行了染色(图3c)。进一步，使用β-gal作为老化指标，将细胞的核用DAPI染色后，将细胞内的β-gal使用Senescence Detection Kit(衰老检测试剂盒，abcam)进行染色(图3d)，计数β-gal阳性细胞和DAPI阳性细胞的数(图3e)。

进一步，为了研究M1巨噬细胞、M2巨噬细胞对黑素产生的贡献度，与上述同样地将各个巨噬细胞的上清液添加于成纤维细胞进行培养。然后，回收成纤维细胞并回收mRNA，使用HGF、ET1、bFGF、IL-1alpha、SCF、簇集素的探针进行实时PCR而定量了各自的mRNA表达量(图3f)。

将结果示于图3b～3f中。图3b显示将各巨噬细胞(M1、M2)的上清液添加于成纤维细胞而培养了72小时后的前胶原量。图3c显示添加各巨噬细胞(M1、M2)的上清液而培养了72小时后的成纤维细胞中的胶原和透明质酸的局部存在。由图3b、c可知，M1显著地抑制胶原产生。图3d显示添加各巨噬细胞(M1、M2)的上清液而培养了72小时后的成纤维细胞中的细胞内β-gal。由图3d提示，对于M1，β-gal阳性细胞增加，促进老化，另一方面，M2抑制老化。图3e显示计数了β-gal阳性细胞和DAPI阳性细胞的数的图。右图显示每孔的DAPI阳性细胞的总数。由图3e右图提示，M2不仅抑制细胞的老化，而且促进细胞的增殖。图3e左图显示β-gal阳性细胞的数相对于DAPI阳性细胞总数的比例(％)，提示M1具有老化和细胞死亡促进作用，另一方面，M2具有老化抑制和细胞增殖作用。进一步，如图3f所示那样，也可知黑素生成相关因子的mRNA表达通过M1而向增加黑素产生的方向作用，另一方面，通过M2而向抑制黑素产生的方向作用。如非专利文献6所报告的那样，已知成纤维细胞通过UV等的光刺激而分泌SCF、HGF等因子，引起细胞死亡。此外，如非专利文献7～9所报告的那样，成纤维细胞通过光刺激而分泌HGF、ET1、bFGF、SCF、簇集素等因子，从而与黑素细胞直接或间接地作用而产生黑素。因此，提示由光刺激引起的细胞死亡、黑素产生是由M1/M2的平衡的崩溃引起的。

实验4：M1、M2巨噬细胞上清液对低龄和老龄成纤维细胞的添加实验

接下来，为了确认M2巨噬细胞的抗老化效果是否对于老化了的成纤维细胞也有用，即，是否具有返老还童效果，将M1、M2巨噬细胞上清液添加于低龄和老龄细胞，研究了成纤维细胞的由年龄的不同引起的巨噬细胞上清液的效果的不同。

具体而言，将通过与实验3相同的方法收集的各个巨噬细胞上清液添加于新生儿人包皮来源的成纤维细胞(低龄来源的成纤维细胞)和68岁人来源的成纤维细胞(老龄来源的成纤维细胞)，培养72小时。然后，通过与实验3同样的方法进行β-gal和DAPI染色，计数了β-gal阳性细胞和DAPI阳性细胞的数(图4a、4b)。进一步，与实验3同样地将M1、M2的上清液添加于低龄和老龄来源的成纤维细胞，将成纤维细胞培养72小时，将上清液中的前胶原量用PIP ELISA试剂盒(TAKARA)定量(图4c)，用兔来源的抗人胶原抗体(CEDERLANE)和DAPI染色(图4d)。

图4a显示β-gal的染色图。图4b显示将低龄来源的成纤维细胞和老龄来源的成纤维细胞的β-gal阳性细胞数和每孔的细胞总数的结果进行作图而得的图。由图4a下图可知，即使是老龄细胞，通过添加M2上清液β-gal阳性细胞也显著减少，老化被抑制。此外，由图4b也可知，无论年龄，都通过M1而老化被促进，通过M2而老化被抑制。这如图4c、d所示那样，无论年龄，添加了M1上清液的细胞都与M2上清液相比胶原产生量显著低这样的结果也支持了上述结论。

实验5：M1巨噬细胞、M2巨噬细胞与新生儿包皮来源的成纤维细胞的共培养实验

对于将新生儿包皮来源的芽细胞与数量相同的M1或M2巨噬细胞(通过实验2的方法制作)用RPMI1640(Nakalai)培养时、和将新生儿包皮来源的成纤维细胞和其半数的M1或M2巨噬细胞用RPMI培养时产生的胶原量，用兔来源的抗人胶原抗体(CEDERLANE)染色而进行了比较。同时也用小鼠来源的抗人CD68抗体(abcam)染色，将巨噬细胞可视化。

将结果示于图5中。对于新生儿包皮来源的芽细胞，也是如果添加M1上清液则胶原减少，另一方面，如果添加M2则大量观察到胶原。即，可知即使是低龄细胞，如果M1/M2平衡崩溃则，也影响胶原。

实验6：使用了3D皮肤模型的由M1/M2平衡的崩溃带来的影响

为了研究M1/M2巨噬细胞对表皮细胞、成纤维细胞的影响，制作出以下表所记载那样的由3层结构形成的三种3D皮肤模型。

表1

3D皮肤模型的制作如下进行。在细胞培养插入物(φ12mm，多孔膜的平均孔径：0.4μm)中接种人真皮成纤维细胞(0.2×10⁶个)，使用200μM抗坏血酸-2-磷酸镁(APM)、10％FBS-DMEM，2天1次交换培养基而培养了1周。在其上，在对照模型中分注包含人真皮成纤维细胞的0.5％I型胶原-10％FBS-DMEM溶液，在M1模型、M2模型中分注分别进一步添加了30,000个细胞的通过实验2的方法进行了分化的M1巨噬细胞、M2巨噬细胞的上述溶液，在人真皮成纤维细胞上制作胶原凝胶，培养了1～5天。

进一步将在Humedia-KG2(クラボウ)培养基中分散的表皮角质形成细胞以成为5×10⁵个/孔的方式在胶原凝胶上接种，在插入物外添加将Humedia-KG2和10％FBS-DMEM以1:1混合并添加了200μM APM的培养基直到与内侧相同的液面高度而培养了3天。

然后，将插入物或玻璃环内的培养基除去，在外侧在皮肤模型用培养基(将10％FBS-DMEM和Humedia-KG2 EGF(-)以1:1混合而调制为Ca 1.8mM)中添加200μM APM、10μM N-羟基-2-[[(4-甲氧基苯基)磺酰]3-皮考基)氨基]-3-甲基丁酰胺盐酸盐(CGS27023A(MMP抑制剂))、10μM BIPBIPU(乙酰肝素酶抑制剂)直到插入物的底面的高度，将插入物内部在暴露于空气的状态下进行了气液界面培养。2～3天1次交换培养基而培养了2周。

将结束了培养的皮肤模型用4％PFA/PBS(Nakarai)固定后，通过与实验1同样的方法用抗CD206抗体(abcam)、抗CD68抗体(abcam)、抗CD86抗体(abcam)染色，确认了M1、M2巨噬细胞的存在(图6)。然后，用抗p21抗体(abcam)、DAPI(VECTOR)染色，将在表皮细胞层和成纤维细胞层各自中用DAPI染色了的细胞的数设为总细胞数，将其中的也被抗p21抗体染色了的细胞的数作为p21阳性细胞数而计数。通过以下式子求出p21阳性细胞数相对于总细胞数的比例。

p21阳性细胞数相对于总细胞数的比例＝(p21阳性细胞数/总细胞数)×100(％)

将结果示于图7、8中。如这些图所示那样，在与中间层相接的上层的表皮细胞层和下层的成纤维细胞层中都相对于对照模型(cont)，p21阳性细胞在M1模型(M1)中增加，另一方面，在M2模型(M2)减少。该倾向与使用了单层培养物的实验3一致。因此，在与人皮肤更接近的3D皮肤模型中，也提示M1巨噬细胞具有老化和细胞死亡促进作用，另一方面，M2巨噬细胞具有老化和细胞死亡抑制作用。

实验7：对使用了人皮肤的离体模型的太阳光照射实验

将Genoskin社制NativeSkin(从38岁女性采取后的皮肤)用到达后附属的培养液培养1天。次日在Oriel社制1000W太阳模拟器中放入光学过滤器，仅将UVA和UVB进行11.5J/cm²照射，用附属的培养液继续培养(照射(+))。作为对照，使用了不进行照射的试样(照射(-))。在照射5天后回收样品，与实验1同样地将M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、总巨噬细胞染色，数出其数而作图。

将结果示于图9中。如果照射太阳模拟器，则M1数最增加。另一方面，M2数的增加与M1的情况下相比非常小。即，可知通过光刺激，M1/M2的平衡崩溃，M1的比率增加。

实验8：对使用了人皮肤的离体模型的伸展刺激实验

接下来，对于调整或改善M1/M2平衡的方法进行了研究。

试样：使用了Genoskin社制NativeSkin(从38岁女性采取后的皮肤)(6孔尺寸，直径约2～2.5cm)。

伸展条件：制作图11所示那样的具有把持孔内的皮肤的两端的把持部，通过将把持部拉伸从而使皮肤伸展的伸展器具。将加入了上述组织片的孔水平设置，操作把持部而从两端使皮肤伸展，如图10所示那样以10％/s的速度进行成为10％的伸展率的伸展，以10％/s的恢复速度将试样恢复到原来的非伸展状态。将其设为1循环，经30分钟进行合计90循环。将该90循环设为1组，在组间设置30分钟～1小时的中止时间而经3小时进行合计3组(合计270循环)。作为对照，使用了不进行伸展刺激的试样(对照)。

观察方法：对于施加或不施加伸展刺激的皮肤试样，将总巨噬细胞的染色仅用兔来源的抗人CD11b抗体(abcam)染色，除此以外，通过与实验1同样的方法，将M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、总巨噬细胞染色，将其数进行计数。求出各巨噬细胞(M1、M2)相对于全体巨噬细胞的总数的比例(％)而作图。

将结果示于图12中。与对照相比，对于施加了伸展刺激的试样，巨噬细胞的总数与M1的数不太有变化，但M2的数非常增加。即，可知通过伸展刺激，M1/M2的平衡改善。

实验9：通过调整或改善M1/M2平衡而预防和/或改善光老化和/或色素沉着的抗光老化和/或色素沉着剂的筛选

进行了调整或改善M1/M2平衡的药剂的筛选。

作为筛选对象药剂，对包括小连翘提取物、百里香提取物、氨甲环酸甲酰胺(N-甲基-反式-4-(氨基甲基)环己烷甲酰胺)在内的合计19种成分进行了研究。小连翘提取物为由一丸ファルコス购入的小连翘地上部的提取物。百里香提取物为由香荣兴业购入的亚洲百里香的全植株的提取物。氨甲环酸甲酰胺通过专利文献14所记载的方法合成。小连翘提取物溶解于50％乙醇，百里香提取物溶解于丁二醇，氨甲环酸甲酰胺溶解于PBS。

将与实验2相同的THP-1细胞在M0的未分化的状态下原样使用，在37℃下培养一晚。将上述各筛选对象药剂以相对于培养基，小连翘提取物成为0.1％，百里香提取物成为0.1％，氨甲环酸甲酰胺成为0.06％、0.03％的方式分别添加，在对照中添加等量的它们的溶剂，在37℃下培养二晚。回收细胞而提取RNA，将CD86和GAPDH的表达量用实时PCR定量，测定了CD86/GAPDH。将与对照(cont)相比具有再现性地CD86/GAPDH值降低的药剂作为M1分化抑制剂而进行了探索。

将结果示于图13中。由图13显示出，如果添加小连翘提取物、百里香提取物、氨甲环酸甲酰胺，则CD86/GAPDH值显著减少，具有M1分化抑制作用，提示可以作为M1/M2平衡调整/改善剂而使用。

实验10：通过调整或改善M1/M2平衡而预防和/或改善光老化和/或色素沉着的抗光老化剂的筛选

为了对于更多的药剂进行筛选，对包含黄檗提取物、桉树提取物在内的合计8种各种成分通过与实验9同样的方法进行了研究。黄檗提取物使用了芸香科黄檗树皮的干燥物，桉树提取物使用了桉树叶的提取物。黄檗提取物以成为0.01％的方式溶解于丁二醇，桉树提取物以成为0.1％的方式溶解于50％乙醇。在对照中使用了它们的溶剂。

通过与实验9相同的方法，进行药剂的添加、细胞的回收、RNA的提取、CD86/GAPDH的测定，将与对照(cont)相比具有再现性地CD86/GAPDH值降低的药剂作为M1分化抑制剂而进行了探索。将结果示于图15中。由图15提示，除了实验9的药剂以外，黄檗、桉树提取物也可以作为M1/M2平衡调整/改善剂而使用。

实验11：M1、M2巨噬细胞上清液对胶原的影响

除了实验3以外，为了研究M1巨噬细胞、M2巨噬细胞对胶原分解的贡献度，通过与实验3同样的方法将各个巨噬细胞的上清液添加于成纤维细胞而进行培养，在72小时后回收mRNA。作为胶原分解的指标，使用MMP-1、MMP-2、和IL-1β的探针(Applied Bioosystems社制Taqman probe)进行实时PCR，定量了各自的mRNA表达量(图16a)。

进一步，为了研究M1巨噬细胞、M2巨噬细胞对胶原产生/成熟的贡献度，通过与实验3同样的方法将各个巨噬细胞的上清液添加于成纤维细胞而进行培养，在72小时后回收mRNA。作为胶原产生/成熟的指标，使用COL1A1、COL1A2、HSP47、和ADAMTS-2的探针(AppliedBioosystems社制Taqman probe)进行实时PCR，定量了各自的mRNA表达量(图16b)。

由图16a、b确认了M1有助于胶原分解，另一方面，M2有助于胶原产生/成熟。

实验12：使用了低龄和高龄者的人皮肤的离体模型中的胶原的分解和产生

将图17a所示的年龄的低龄者(20多岁～30多岁)和高龄者(60多岁～80多岁)的白色人种来源的鬓角的皮肤与实验1同样地制成冷冻切片，切薄片后，使用将3/4侧的胶原切断片段染色的抗前胶原抗体(millipore)、抗片段化胶原(AdipoGen)、和与实验1相同的CD68、CD11b、CD206、CD86抗体，通过与实验1同样的方法而计数了阳性细胞。

将结果示于图17b、c、d中。与低龄组相比对于高龄组，M1巨噬细胞的比例高，M2巨噬细胞的比例低。然而，无论年龄，都具有与显示3/4胶原阳性的成纤维细胞相比显示3/4胶原阳性的巨噬细胞的数多，进一步与显示3/4胶原阳性的M1巨噬细胞相比显示3/4胶原阳性的M2巨噬细胞数多的倾向。

实验13：显示真皮中的黑素的摄入能力的体外(in vitro)实验

通过与实验3同样的方法分化为使THP-1细胞分化而获得的M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。在分化了的各个M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、和成纤维细胞(クラボウ社制)中，将黑素溶液(Sigma社，Melanin-BioReagent,Synthetic,suitable for cell culture)溶解于PBS而调整为0.02％W/V进行添加。在24小时后将细胞用PBS洗涤后，用显微镜拍摄，回收细胞。将回收了的细胞的细胞数用阿尔玛蓝(Life Technologies)，如下述那样计测黑素量，进行了定量。

黑素的定量：

在添加用各个细胞的培养基(巨噬细胞：RPMI1640,成纤维细胞：1DMEM)调整为1:10的阿尔玛蓝后，在37℃下培养30分钟。然后，回收该上清液100ul/孔，在激发/发射:544nm/590nm用Ascent(Thermo社)计测荧光。在计测后，用PBS洗涤，添加1M NaOH后在室温下孵育3小时，完全溶解。将该细胞溶液以OD475使用POWERSCAN HT(DS PHARMABIOMEDICAL)计测。

将结果示于图18a～c中。图中的单位“黑素/阿尔玛蓝”是将培养细胞用阿尔玛蓝染色，对于上清液以544nm/590nm计测了荧光的强度((1))、与对于之后溶解细胞使黑素也溶解而得的溶液以吸光度475nm计测了的强度((2))的相对值((2)/(1))，显示每细胞的黑素含量。由这些图可知，M2吞噬非常多的黑素。该倾向在24小时后也已经观察到，但继续观察细胞的培养直到5天后，结果该差异变得更明确(图18c)。

实验14：显示真皮中的黑素的摄入能力的离体的实验

通过实验13可知M2巨噬细胞与成纤维细胞、M1巨噬细胞相比吞噬更多的黑素，因此将在实验13中计数了的人皮肤的真皮层使用LSM880(カールツァイス社制)以离体进行观察。可知高龄和低龄都在明视场中观察时M2巨噬细胞被黑素一起染黑，与此相对，M1巨噬细胞的附近不存在黑素。由此，通过离体可知，在真皮中M2巨噬细胞与成纤维细胞、M1巨噬细胞相比摄入更多的黑素，对于其数进行计数而作图(图19)。

根据图19，老龄和低龄都是摄入黑素的M2巨噬细胞的数多于M1巨噬细胞的数，在该倾向中不太观察到年龄差异。由该结果提示，摄入真皮的黑素的是M2巨噬细胞，因此如果增加M2巨噬细胞的比例而调整M1/M2平衡，则能够预防和/或改善真皮中的色素沉着。

显示出通过光老化从而M1的比例增加(实验7)，显示出M2的比例高时皮肤胶原量变多(实验11、12)，色素吞噬作用也变高(实验13、14)的倾向，因此提示作为M1分化抑制剂而被筛选出的氨甲环酸甲酰胺等本发明的化合物、百里香提取物、黄檗、和桉树提取物、和具有M1/M2平衡改善作用的本发明的物理刺激的抗光老化和/或色素沉着抑制效果高。

由以上结果提示，通过光刺激，M1/M2的平衡的不均衡发生，从而在接触光的皮肤引起光老化，或在真皮色素沉着，但通过调整或改善M1/M2的平衡，从而可以预防和/或改善光老化和/或真皮色素沉着。M1/M2的平衡的调整或改善通过施加伸展刺激、按压刺激，应用氨甲环酸甲酰胺等本发明的化合物、小连翘提取物、百里香提取物、黄檗、和/或桉树提取物等具有M1分化抑制作用的成分作为M1/M2平衡调整/改善剂来实现，进而期待光老化和/或真皮色素沉着的预防和/或改善。

产业可利用性

通过本发明，能够进行光老化和/或真皮色素沉着的预防和/或改善、光老化和/或真皮色素沉着度的评价、抗光老化和/或真皮色素沉着抑制剂和抗光老化和/或真皮色素沉着抑制美容处置的探索。