具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

需注意的是，在本发明中，母本花朵的开放挂牌时间定义为始开期，并且，在本发明中，栽培烟草为母本，花烟草为父本；其中，所述栽培烟草为栽培烟草Nicotiana tabacum‘K326’。

如图1-2所示，本发明提供了一种获得栽培烟草和花烟草杂交后代的方法，包括步骤：

S1，将栽培烟草按用途进行划分，分别为提供花粉的第一栽培烟草、提供柱头的第二栽培烟草、以及接受杂交授粉的第三栽培烟草。

上述将栽培烟草进行划分，主要是因为在后续的操作中，需要分别选取栽培烟草做不同的处理。

S2，取所述第一栽培烟草的花粉，然后用所述第一栽培烟草的花粉对所述第二栽培烟草的柱头进行诱导处理，得第一次处理后的柱头；其中，所述诱导处理中的诱导时长可以为0.5-2h。

所述诱导处理的主要是为了获得母本的花粉与柱头之间初步反应后所产生的诱导体系，从而将该诱导体系应用于后续的杂交过程中，以产生对杂交的亲和性诱导；需特别注意的是，所述诱导处理最好是对应所述第一栽培烟草的花粉与所述第二栽培烟草的柱头在初步反应后(如反应0.5-2h)所产生的诱导体系。

在进行所述诱导处理时，所述第一栽培烟草的花粉不宜过多，只需在所述第二栽培烟草的柱头上进行稍有粘附即可(即所述第一栽培烟草的花粉与所述第二栽培烟草的柱头之间不需用比例衡量，只需达到相互粘附的目的就可以在本发明中发挥相应的作用)，另外，诱导时间也不宜过长；控制所述第一栽培烟草的花粉量以及控制诱导时间，是以免诱导过大，降低了所述诱导体系中花粉与柱头在反应初期所产生的物质，使得所述诱导体系的在后续杂交过程中的亲和性诱导作用降低。

另外，所述诱导处理可以包括对所述第二栽培烟草的柱头进行活体诱导或者离体诱导。

所述活体诱导包括：直接在活体的所述第二栽培烟草上对柱头用所述第一栽培烟草的花粉进行诱导，并将诱导后的柱头剪取备用。所述活体处理的优点在于诱导效果好，能够获得真实的母本的诱导体系，适用于实验验证阶段的操作。

所述离体诱导包括：剪取所述第二栽培烟草的柱头，然后在预设的诱导条件下，用所述第一栽培烟草的花粉对剪取后得到的所述第二栽培烟草的柱头进行诱导。所述离体诱导的优点在于方便大规模进行诱导处理，避免了对每株所述第二栽培烟草的柱头分别进行诱导；

具体的，所述离体诱导的所述预设的诱导条件可以包括：在空气流通的情况下，使温度保持在25-35℃，湿度保持在45-70％，氧浓度保持在20-25％，以便于在离体的条件下，为所述诱导处理提供合适的环境。

在所述离体诱导中，可以直接将所述第一栽培烟草的花粉和所述第二栽培烟草的柱头进行混合，以实现快捷有效的诱导；而在所述活体诱导中，则需要对每个所述第二栽培烟草的柱头分别涂抹所述第一栽培烟草的花粉，操作难度和强度大。

S3，将所述第一次处理后的柱头依次进行细胞破碎处理、干燥处理和捣碎处理，得第二次处理后的柱头。所述干燥处理主要是为了去掉多余的水分，所述干燥处理的时长为24-48h，所述干燥处理的干燥温度为20-40℃；当然，也可直接在室温下进行晾干。另外，所述细胞破碎处理主要是为了将粘附在所述第二栽培烟草柱头上的所述第一栽培烟草的花粉细胞进行灭活，避免其对后期的授粉进行干扰，同时也能终止柱头与花粉的继续反应；所述捣碎处理主要是为了得到粉末状的所述第二次处理后的柱头，以便于后续相应的混合操作。

S4，取花烟草的花粉，并将所述花烟草的花粉与所述第二次处理后的柱头按预设比例混合，得待处理混合物；其中，所述预设比例可以为1:2-20的质量比，进一步地，所述预设比例可以为1:10的质量比，以达到加佳的混合比例。将所述花烟草的花粉与所述第二次处理后的柱头按预设比例混合，能够使得所述花烟草的花粉在进行授粉时，携带有栽培烟草的诱导体系，从而显著提高杂交的亲和性。

S5，通过所述待处理混合物对第三栽培烟草在始开期后的120h内进行多次重复授粉，得授粉后的栽培烟草；

具体地，所述通过所述待处理混合物依次对第三栽培烟草在始开期后的120h内进行多次重复授粉包括：用同一比例的所述待处理混合物对第三栽培烟草在始开期后的72h、108h、120h重复进行授粉。

S6，对所述授粉后的栽培烟草进行检测操作以及对得到的子代进行筛分操作，得具有抗逆性的烟草杂交品种。

其中，所述检测操作包括：通过胼胝质荧光统计生长进入子房的花粉管数目和结籽率；所述筛分操作包括：通过染色体含量进行品种筛选。

作为进一步说明，所述通过染色体含量进行品种筛选包括：

S61，对待测植株进行编号，然后从每个所述待测植株的叶片中分别取样，并对取样后的叶片分别进行切碎处理；

S62，向所述切碎处理后的叶片中分别加入预冷的细胞核提取缓冲液，并进行过滤处理，然后对所述过滤处理得到的滤液依次进行冰上孵育处理、离心处理，以及PI染色处理；

S63，将所述PI染色处理后的产物使用流式细胞仪分析细胞核DNA含量。

需注意的是，在进行所述PI染色处理的同时，加入预设体积的RNase以防止双链RNA同时着色。

为便于本领域技术人员对本发明有进一步的理解，现举例说明：

实施例1

1、取所述第一栽培烟草的成熟花粉，然后用所述第一栽培烟草的成熟花粉对所述第二栽培烟草的柱头进行1h的所述活体诱导处理，得第一次处理后的柱头；经所述诱导处理后，所述第一次处理后的柱头含有能增强杂交亲和性的诱导体系。

2、在所述诱导处理后，立刻将所述第一次处理后的柱头依次进行细胞的破碎处理、干燥处理(此处为室温晾干)和捣碎处理，得第二次处理后的柱头。

3、取花烟草的花粉，并将所述花烟草的成熟花粉与所述第二次处理后的柱头按1:10的质量比混合，得待处理混合物，所述待处理混合物中携带有栽培烟草的诱导体系，从而能显著提高杂交的亲和性。

4、通过所述待处理混合物对第三栽培烟草在始开期后的72h、108h、120h重复进行授粉，得授粉后的栽培烟草；

5、在最后一次授粉的48h后通过胼胝质荧光统计生长进入子房的花粉管数目和结籽率数据；然后通过染色体含量进行子代的品种筛选。

其中，经胼胝质荧光统计，子房中花粉管数目约达到234根花粉管/子房，结籽率达到11.5％。

另外，所述通过染色体含量进行子代的品种筛选的过程具体为：

对亲本和杂交后代进行编号，然后将亲本和杂交后代的每个植株取1cm²叶片，去离子水洗涤后用锋利的解剖刀进行切碎，再加入1mL预冷的细胞核提取缓冲液(Galbraith's Buffer：45mM MgCl₂，30mM柠檬酸钠，20mM MOPS，0.10％V/V Triton X，pH 7.0)，并用50μm的尼龙网过滤到1.5mL离心管中。

冰上孵育5min后，1100rpm(5min，4℃)低速离心，弃去大部分上清液，剩余50μL，对细胞核进行PI染色，同时加入1μL的RNase以防止双链RNA同时着色，将样品重新悬浮并在黑暗中孵育20min。

使用BD Accuri-C6流式细胞仪分析细胞核DNA含量，FL2-A通道以中等速度(60μL/min)运行样品，并使用BD FACS Suite软件获取和分析数据。

每个样品中评估的参数是PI着色细胞核的相对荧光强度(Fluorescenceintensities of PI-stained nuclei,FL)。

如图2所示，经流式检测后，母本DNA含量最高，父本DNA含量最低，杂交后代DNA含量是父本和母本DNA含量总合的一半，如果是母本自交结实的后代，其DNA含量与母本相同，而本实施例中获得真实杂交后代的几率为8％。

作为对上述实施例1的扩充，在其他条件相同的情况下，仅将所述花烟草的成熟花粉与所述第二次处理后的柱头改为按1:20的质量比混合；经染色体含量检测，其获得获得真实杂交后代的比率为5％。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。