一种杀灭地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种杀灭地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂及其制备方法 (Beauveria bassiana microcapsule pesticide for killing underground insect pests and preparation method thereof ) 是由 陈宏伟 钱贞舟 吕海光 杨泰然 冯晶 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种杀灭地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂,包括：以真菌白僵菌为有效杀虫物质的核心；以及将核心包覆的壳聚糖壳体；其中,壳聚糖壳体中含有细菌所需的营养物质。该杀虫剂以壳聚糖包覆白僵菌,并在壳聚糖形成的壳体中加入营养物质,解决了真菌源杀虫剂的环境制约问题,能有效的提升真菌源杀虫剂的田间活性,从而提升杀虫效果。(The invention discloses a beauveria bassiana microcapsule pesticide for killing underground insect pests, which comprises the following components: the fungus white muscardine is taken as the core of the effective insecticidal substance; and a chitosan shell coating the core; wherein the chitosan shell contains nutrients required by bacteria. The pesticide is prepared by coating beauveria bassiana with chitosan, and adding nutrient substances into a shell formed by the chitosan, so that the problem of environmental restriction of the fungal insecticide is solved, the field activity of the fungal insecticide can be effectively improved, and the insecticidal effect is improved.)
技术领域
本发明涉及生物农药领域，特别涉及一种杀灭地下虫害的白僵菌微胶囊 杀虫剂及其制备方法。
背景技术
生物农药是利用生物活体或由生物产生的活性成分，以及化学合成的具 天然化合物结构的物质，制备出的可防治植物病虫害和杂草以及调节植物生 长的制剂。与传统化学农药相比，生物农药具有对人畜和非靶标生物安全。 环境兼容性好，不易产生抗性，易于保护生物多样性，来源广等优点。真菌 源农药是生物农药的一种，其通过真菌产生特异性的毒素破坏害虫的代谢平 衡，或者通过营养体在虫体内繁殖而引发流行病达到杀虫效果。尤其是白僵 菌，其在土壤中繁殖后能够杀灭潜伏于地下的病虫害，但是，真菌源农药的 生物活性需要适宜的环境条件，所以其在田间的活性保持是一个亟待解决的 问题。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种杀灭地下病 虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂及其制备方法，其能够有效保证细菌源农药的田 间生物活性，保证细菌源农药的杀虫效果。
为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，本发明的第一目的是提供 一种杀灭地下病虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂，包括：以真菌白僵菌为有效杀 虫物质的核心；
以及将核心包覆的壳聚糖壳体；
其中，所述壳聚糖壳体中含有细菌所需的营养物质。
优选的，杀虫细菌与壳聚糖壳体的质量比为1:100。
优选的，营养物质在壳聚糖壳体中所占的质量百分比为10～20％。
优选的，营养物质由营养盐及有机糖类组成，所述营养盐及有机糖类的 质量比为1:25～35。
优选的，营养盐为磷酸盐或硫酸盐，有机糖类为单糖或双糖。具体的为 营养盐为磷酸盐或硫酸盐，更为优选的为磷酸氢二钾、硫酸铜、硫酸锌或硫 酸锰，有机糖类为葡糖糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖。
本发明的第二目的是提供一种上述的细菌微胶囊杀虫剂的制备方法，其 特征在于，包括如下步骤：
将白僵菌接种到SDAY斜面培养基中，温度20～35℃、培养8～16天， 得到斜面菌种；
将所述斜面菌种接种到SDY液体培养基中，摇床培养3～5天，得到白 僵菌菌浆。
将壳聚糖溶于乙酸溶液中，并调其pH值，制得壳聚糖乙酸溶液；
在壳聚糖乙酸溶液中，加入营养物质，搅拌均匀，形成预聚液；
将菌浆滴加入预聚液中，搅拌、超声处理，制得微胶囊悬浊液；
离心所述微胶囊悬浊液，清洗离心后制得杀灭地下虫害的白僵菌微胶囊 杀虫剂。
作为优选，乙酸溶液的质量浓度为2～3％，调节后的pH值为4～6，调节 pH采用NaOH溶液；壳聚乙酸溶液中壳聚糖的浓度为3mg/mL～4mg/mL。
作为优选，将菌浆滴加入预聚液中的方式为在1～3mL/min的速度将所 述菌浆滴加至预聚液中，搅拌速度为1000～1200r/min，超声处理时间为5～10min。
作为优选，离心清洗过程为经生理盐水及PBS缓冲液清洗后离心。
作为优选，SDAY斜面培养基的配方为50g葡萄糖、10g蛋白胨、15g酵 母浸粉和15g琼脂；SDY液体培养基为40g葡萄糖。20g蛋白胨、10g酵母 浸粉加1000mL无菌水。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：
本发明所提供的杀灭地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂，以白僵菌为有效 杀虫物质，具有无污染，无农药残留的优势。此外，该杀虫剂为微胶囊结 构，达到了药物缓释的效果；该杀虫剂将白僵菌包覆在微胶囊的中心，并在 微胶囊壁材中加入白僵菌生长生存时所需的营养物质，能够保证白僵菌在田 间的生物活性，保证杀虫细菌的杀虫效果。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下所述仅 为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围 的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等 同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所用的 材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的细菌源微胶囊杀虫剂通过如下所述的方法制备：
S1将白僵菌接种到SDAY斜面培养基中，温度20～35℃、培养8～16 天，得到斜面菌种；其中，SDAY斜面培养基的配方为50g葡萄糖、10g蛋 白胨、15g酵母浸粉和15g琼脂。
S2将所述斜面菌种接种到SDY液体培养基中，摇床培养3～5天，得到 白僵菌菌浆，其中，SDY液体培养基为40g葡萄糖。20g蛋白胨、10g酵母 浸粉加1000mL无菌水。
S3在壳聚糖乙酸溶液中，加入营养物质，搅拌均匀，形成预聚液，其 中，所添加的营养物质及壳聚糖的总质量份为100质量份，营养物质的质量 份为10～20质量份，营养物质由营养盐及有机糖类组成，营养盐为磷酸氢二 钾、硫酸铜、硫酸锌或硫酸锰；有机糖类为葡糖糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半 乳糖；营养盐及有机糖类的质量比为1:25～35
S4将菌浆以1～3mL/min的速度滴加至搅拌速度为1000r/min～1200r/min 的预混液中，其中，菌浆的质量组份为1份；之后超声处理5～10min，制得 微胶囊悬浊液。
S5离心微胶囊悬浊液，经生理盐水及PBS缓冲液清洗后离心制得杀灭 地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂。
本发明以上述方法制备的微胶囊杀虫剂，以白僵菌作为有效杀虫物质， 白僵菌通过在土壤中繁殖增生，之后寄生于地下虫体体内以杀死害虫，其在 杀灭地下虫害方面有着优异的杀虫效果，而且具有环境兼容性好，不易产生 抗性，易于保护生物多样性，来源广等优点；此外，本发明采用两步法培养 真菌，先将真菌活化，再扩大培养，有利于提升真菌的活性，且培养的真菌 量也会较大。
该微胶囊杀虫剂以壳聚糖为原料制备微胶囊壳体，是因为壳聚糖为一种 盐离子电解质，具有良好的生物相容性，而且原料易得，价格便宜，成本 低；此外，以微胶囊形式制成杀虫剂，一方面可以是杀虫剂中的有效成分缓 慢释放，可以减少药剂的使用量，而且，微胶囊结构，可以有效的避免细菌 受紫外线照射，有利于提升细菌活性，提高杀虫效果，使药效更持久。
最为重要的是，该微胶囊杀虫剂的微胶囊壳体中，含有真菌白僵菌所需 要的营养物质，提升了白僵菌的环境兼容能力，降低了白僵菌杀虫剂的环境 依赖性，提升了白僵菌的存活率，进而提升了杀虫剂的杀虫效果。
而且，该微胶囊杀虫剂中，营养物质为营养盐及有机糖类，营养盐为磷 酸盐或硫酸盐，具体的为磷酸氢二钾、硫酸铜、硫酸锌或硫酸锰，其不仅提 供了微生物生长所需的无机非金属元素磷及硫等，也提供了所需的无机金属 元素钾、铜等。有机糖类为单糖或双糖，其为细菌培养过程中碳源及能源的 基本成分，相比于多糖，其可直接被真菌利用或消耗较小的能量将双糖转化 为单糖被细菌利用，更有利于真菌的生长。
本发明的微胶囊杀虫剂制备方法中，在搅拌状态下，采用滴加的方式加 入菌浆，使形成的微胶囊大小均匀；在最后的清洗离心过程中，采用生理盐 水及PBS液进行清洗，与传统的乙醇及超纯水清洗相比，其对真菌无伤 害，不会因渗透压的问题使真菌死亡，降低真菌的活性，能够保障真菌的杀 虫效果。
实施例1
S11将白僵菌接种到SDAY斜面培养基中，温度20～35℃、培养8～16 天，得到斜面菌种；其中，SDAY斜面培养基的配方为50g葡萄糖、10g蛋 白胨、15g酵母浸粉和15g琼脂。
S12将所述斜面菌种接种到SDY液体培养基中，摇床培养3～5天，得 到白僵菌菌浆，其中，SDY液体培养基为40g葡萄糖。20g蛋白胨、10g酵 母浸粉加1000mL无菌水。
S13将壳聚糖溶于质量浓度为2％的乙酸溶液中，采用NaOH调节pH至 6，最终合成壳聚糖质量浓度为3mg/mL的壳聚糖乙酸溶液；
S14在壳聚糖乙酸溶液中，加入营养物质，搅拌均匀，形成预聚液，其 中，营养物质总量为10质量份，壳聚糖为90质量份；营养物质为磷酸氢二 钾与葡萄糖，磷酸氢二钾与葡萄糖的质量比为1:25。
S15将菌浆以1mL/min的速度滴加至搅拌速度为1000r/min的预混液 中，其中，菌浆的质量组份为1份；之后超声处理5min，制得微胶囊悬浊 液；
S16离心微胶囊悬浊液，经生理盐水及PBS缓冲液清洗后离心制得杀灭 地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂。
实施例2
S21将白僵菌接种到SDAY斜面培养基中，温度20～35℃、培养8～16 天，得到斜面菌种；其中，SDAY斜面培养基的配方为50g葡萄糖、10g蛋 白胨、15g酵母浸粉和15g琼脂。
S22将所述斜面菌种接种到SDY液体培养基中，摇床培养3～5天，得 到白僵菌菌浆，其中，SDY液体培养基为40g葡萄糖。20g蛋白胨、10g酵 母浸粉加1000mL无菌水。
S23将壳聚糖溶于质量浓度为2.5％的乙酸溶液中，采用NaOH调节pH 至5，最终合成壳聚糖质量浓度为3.5mg/mL的壳聚糖乙酸溶液；
S24在壳聚糖乙酸溶液中，加入营养物质，搅拌均匀，形成预聚液，其 中，营养物质总量为15质量份，壳聚糖为85质量份；营养物质为硫酸铜与 阿拉伯糖，硫酸铜与阿拉伯糖的质量比为1:30。
S25将菌浆以2mL/min的速度滴加至搅拌速度为1100r/min的预混液 中，其中，菌浆的质量组份为1份；之后超声处理8min，制得微胶囊悬浊 液；
S26离心微胶囊悬浊液，经生理盐水及PBS缓冲液清洗后离心制得杀灭 地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂。
实施例3
S31将白僵菌接种到SDAY斜面培养基中，温度20～35℃、培养8～16 天，得到斜面菌种；其中，SDAY斜面培养基的配方为50g葡萄糖、10g蛋 白胨、15g酵母浸粉和15g琼脂。
S32将所述斜面菌种接种到SDY液体培养基中，摇床培养3～5天，得 到白僵菌菌浆，其中，SDY液体培养基为40g葡萄糖。20g蛋白胨、10g酵 母浸粉加1000mL无菌水。
S33将壳聚糖溶于质量浓度为3％的乙酸溶液中，采用NaOH调节pH至 4，最终合成壳聚糖质量浓度为4mg/mL的壳聚糖乙酸溶液；
S34在壳聚糖乙酸溶液中，加入营养物质，搅拌均匀，形成预聚液，其 中，营养物质总量为20质量份，壳聚糖为80质量份；营养物质为硫酸锌与 鼠李糖，硫酸锌与鼠李糖的质量比为1:30。
S35将菌浆以2mL/min的速度滴加至搅拌速度为1100r/min的预混液 中，其中，菌浆的质量组份为1份；之后超声处理8min，制得微胶囊悬浊 液；
S36离心微胶囊悬浊液，经生理盐水及PBS缓冲液清洗后离心制得杀灭 地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂。
实施例4
S41将白僵菌接种到SDAY斜面培养基中，温度20～35℃、培养8～16 天，得到斜面菌种；其中，SDAY斜面培养基的配方为50g葡萄糖、10g蛋 白胨、15g酵母浸粉和15g琼脂。
S42将所述斜面菌种接种到SDY液体培养基中，摇床培养3～5天，得 到白僵菌菌浆，其中，SDY液体培养基为40g葡萄糖。20g蛋白胨、10g酵 母浸粉加1000mL无菌水。
S43将壳聚糖溶于质量浓度为3％的乙酸溶液中，采用NaOH调节pH至 4，最终合成壳聚糖质量浓度为4mg/mL的壳聚糖乙酸溶液；
S44在壳聚糖乙酸溶液中，加入营养物质，搅拌均匀，形成预聚液，其 中，营养物质总量为20质量份，壳聚糖为80质量份；营养物质为硫酸锌、 硫酸锰、鼠李糖与半乳糖，硫酸锌、硫酸锰、鼠李糖与半乳糖的质量比为 0.5：0.5：15：15。
S45将菌浆以2mL/min的速度滴加至搅拌速度为1100r/min的预混液 中，其中，菌浆的质量组份为1份；之后超声处理8min，制得微胶囊悬浊 液；
S46离心微胶囊悬浊液，经生理盐水及PBS缓冲液清洗后离心制得杀灭 地下虫害的白僵菌微胶囊杀虫剂。
测试方法
通过在有病虫害的植物中施加相同质量的杀虫剂测试杀虫驱虫效果，测 试了施加杀虫剂3天、7天及30天时的死虫数，通过死亡率来表征该发明 所述的杀虫剂的杀虫驱虫效果。
死亡率(％)＝死虫数/总虫数×100％
对比例1为不施任何农药的空白对照组，对比例2为常规真菌源生物农 药白僵菌，其施加量与实施例1中施加的白僵菌的质量相等。
通过对比实施例及对比例1、2，本发明提供的杀虫剂具有杀虫效果 好，起效快，药效长的优点，本发明所提供的细菌微胶囊杀虫剂与市场上常 规的白僵菌杀虫剂相比，其在施加三天后的杀虫效果提升了12.45％，7天后 的杀虫效果提升了22.9％，30天后的杀虫效果提升了34.33％。本发明所提 供的杀虫剂，在3天后就表现出了比传统白僵菌杀虫剂优秀的杀虫效果，表 明微胶囊及营养物质的存在，能够快速的调动真菌的活性，其杀虫起效的时 间较快。其次，在30天时，各实施例的杀虫效果依旧很好，而对比例2却 在7天后未见明显增长，表明本发明所提供的杀虫剂具有药效长的优点，最 后，实施例的虫死亡率整体高于对比例，表明在真菌农药外加入壳聚糖壳体 并在其中加入营养物质，能够有效的提升真菌的活性，能够有效的提升杀虫 效果。
以上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限 制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书所示和以上而顺畅地实施本发 明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用 以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本 发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任 何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围 之内。
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