一种无钩状效应的免疫层析试纸条及制备方法
阅读说明：本技术 一种无钩状效应的免疫层析试纸条及制备方法 (Immunochromatography test strip without hook effect and preparation method thereof ) 是由 董涛 何国桢 杨朝初 图莉尔·伦宁达 阿若·布兰斯塔德 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种无钩状效应的免疫层析试纸条及制备方法,该免疫层析试纸条包括底板,所述底板的上方设置有硝化纤维膜、样品垫和吸收垫,所述硝化纤维膜位于所述样品垫和所述吸收垫之间,所述硝化纤维膜上方设置有过渡垫、测试线、控制线,所述测试线设置在所述过渡垫和所述控制线之间,所述过渡垫的上方设置有共轭垫,所述共轭垫的上方设置有标记抗体。在无需额外人工操作的情况下,低成本地解决了传统三明治法LFIA试纸条中出现的钩状效应,有效消除了测试结果中的假阴性,破除现有LFIA试纸条应用限制；新型免疫侧流层析试纸条针对分析物展现出极高的检测特异性。(The immunochromatographic test strip comprises a bottom plate, wherein a nitrocellulose membrane, a sample pad and an absorption pad are arranged above the bottom plate, the nitrocellulose membrane is positioned between the sample pad and the absorption pad, a transition pad, a test line and a control line are arranged above the nitrocellulose membrane, the test line is arranged between the transition pad and the control line, a conjugate pad is arranged above the transition pad, and a marker antibody is arranged above the conjugate pad. Under the condition of no need of additional manual operation, the hook effect in the LFIA test strip of the traditional three-Ming-and-technology method is solved at low cost, the false negative in the test result is effectively eliminated, and the application limit of the traditional LFIA test strip is broken; the novel immune lateral flow chromatography test strip shows extremely high detection specificity aiming at the analyte.)
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，特别是涉及一种无钩状效应的免疫层析试纸条及制备方法。
背景技术
基于三明治法的免疫侧流层析(LFIA)技术因其低成本、效应快、操作简便等优点，在体外检测领域得到了广泛的发展，可用于定性或定量分析。定性分析的LFIA技术多基于比色法，利用金纳米颗粒的表面等离子共振现象进行检测，适用于怀孕、药物滥用、传染性疾病检测等应用场景。定量分析的LFIA技术部分与定性LFIA的比色法类似，利用颜色深浅实现定量检测；近年来还开发出利用量子点或荧光微球作为标记的荧光法。定量LFIA可应用于诸如心脏病、慢阻肺、癌症等重大疾病的早期诊断。另一方面，不论定性或是定量，目前所有基于三明治法的免疫侧流层析试纸条在待测分析物浓度过高时都会出现钩状效应，测试结果呈现假阴性。
钩状效应极大地限制了LFIA的商业化应用，尚未有理想的解决方法。当前的解决方法有：1、稀释样品；2、漂洗；3、提升标记抗体浓度；4、加入第三条测试线或应用多个测试区；5、动态测量。稀释样品和漂洗法在LFIA测试中引入了额外的人工操作步骤。提升标记抗体浓度、加入第三条测试区和应用多个测试区这三种方法会显著增高LFIA试纸条加工成本。动态测量法虽然拜托了假阴性，但是依旧限制了定量时的检测范围。因此，这些方法都不能完全解决钩状效应带来的问题。
发明内容
本发明为了解决上述问题提供了一种无钩状效应的免疫层析试纸条及制备方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种无钩状效应的免疫层析试纸条，包括底板，所述底板的上方设置有硝化纤维膜、样品垫和吸收垫，所述硝化纤维膜位于所述样品垫和所述吸收垫之间，所述硝化纤维膜上方设置有过渡垫、测试线、控制线，所述测试线设置在所述过渡垫和所述控制线之间，所述过渡垫的上方设置有共轭垫，通过过渡垫隔离硝化纤维膜和共轭垫的直接接触，起到延缓共轭垫释放标记抗体的作用，所述共轭垫的上方设置有标记抗体。
其中，所述过渡垫为化学法处理的薄膜或物理法加工而成、孔隙率成梯度分布的薄膜；通过化学法或物理法调节待测溶液样品在过渡垫中渗透性和浸润速度，使过渡垫成为抵挡溶液流动的屏障和释放标记抗体的开关，使共轭垫在特定时间开始浸润并释放标记抗体；延缓标记抗体的释放可有效分离待测分析物与固定抗体、标记抗体之间的竞争反应，从而在高分析物浓度时消除钩状效应。
本发明还提供了一种无钩状效应的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：在硝化纤维膜上固定测试线和控制线，在36℃下干燥2h或直至硝化纤维膜完全干燥；
步骤二：室温下使用含有2％w/v BSA和0.02％w./v.Tween-20的0.01MPBS缓冲溶液封闭硝化纤维膜，在36℃下干燥2h或直至硝化纤维膜完全干燥；
步骤三：在去离子水中加入过饱和量的蔗糖，室温下搅拌3天至4天，得到蔗糖的饱和水溶液；去除溶液中的蔗糖沉淀，再用去离子水将饱和蔗糖溶液稀释至理想浓度；
步骤四：将硝化纤维膜裁剪，将蔗糖溶液从硝化纤维膜边开始浸润硝化纤维膜，直至硝化纤维膜完全浸泡在蔗糖溶液中；硝化纤维膜上不能残留任何气泡；完全干燥硝化纤维膜；
步骤五：在共轭垫上固定已预先偶联的标记抗体，并在36℃下完全干燥；
步骤六：组装LFIA试纸条：先在底板上粘贴硝化纤维膜，再依次粘贴过渡垫、吸收垫、样品垫，在过渡垫上粘贴共轭垫。
其中，步骤二中0.01M PBS缓冲溶液的pH为7.2。
其中，标记抗体为荧光标记抗体或纳米金标记抗体。
本发明的优点如下：
1、在无需额外人工操作的情况下，低成本地解决了传统三明治法LFIA试纸条中出现的钩状效应，有效消除了测试结果中的假阴性，破除现有LFIA试纸条应用限制；新型免疫侧流层析试纸条针对分析物展现出极高的检测特异性；
2、在传统LFIA试纸条中，分析物同时与标记抗体、检测抗体结合。其中，分析物与溶液中标记抗体一般具有最高的亲和度。当分析物过量时(浓度过高)，大多数标记抗体会优先和分析物结合，达到反应平衡，形成标记抗体-分析物复合体。此时复合体与未被标记的检测物会同时与T线的检测抗体形成竞争反应，溶液样品中剩余的标记抗体不足以标记T线上的检测物，导致假阴性结果。通过引入具有可调浸润率的过渡垫，控制标记抗体的释放时间，有效规避传统试纸条中分析物、标记抗体和检测抗体之间的竞争反应。通过优化释放时间，先最大化未被标记的分析物与T线的结合，再释放标记抗体，标记T线上的分析物，从而解决钩状效应。此外，蔗糖溶液处理纤维素膜的方法简单、易实施。经化学法处理的过渡垫可有效阻碍溶液的流动，实现开关效果。经对比，在同一优化条件下，带有过渡垫的新型免疫侧流层析试纸条比传统试纸条的检测范围宽100倍。
附图说明
图1是本发明实施例提供的无钩状效应的免疫层析试纸条结构示意图。
图2是本发明实施例提供的带有过渡垫的新型LFIA试纸条以C反应蛋白为例进行检测的检测曲线(a和b)以及检测特异性测试结果(c和d)；
图3是本发明实施例提供的用作比较的传统LFIA试纸条以C反应蛋白为例进行检测的检测曲线；
图4是本发明实施例提供的经蔗糖溶液处理所得过渡垫的浸润速率测试。
附图标记说明如下：
1、底板；2、硝化纤维膜；3、样品垫；4、吸收垫；5、过渡垫；6、共轭垫。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但本发明并不局限于这些内容。
实施例
一种无钩状效应的免疫层析试纸条，包括底板1，底板1的上方设置有硝化纤维膜2、样品垫3和吸收垫4，硝化纤维膜2位于样品垫3和吸收垫4之间，硝化纤维膜2上方设置有过渡垫5、测试线、控制线，测试线设置在过渡垫5和控制线之间，过渡垫5的上方设置有共轭垫6，共轭垫6的上方设置有标记抗体。
其中，过渡垫5为化学法处理的薄膜或物理法加工而成、孔隙率成梯度分布的薄膜。
本发明还提供了一种无钩状效应的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：在硝化纤维膜2上固定测试线和控制线，在36℃下干燥2h或直至硝化纤维膜2完全干燥；
步骤二：室温下使用含有2％w/v BSA和0.02％w./v.Tween-20的0.01MPBS缓冲溶液pH7.2封闭硝化纤维膜2，在36℃下干燥2h或直至硝化纤维膜2完全干燥；
步骤三：在去离子水中加入过饱和量的蔗糖，室温下搅拌3天至4天，得到蔗糖的饱和水溶液；去除溶液中的蔗糖沉淀，再用去离子水将饱和蔗糖溶液稀释至理想浓度；
步骤四：将硝化纤维膜2裁剪，将蔗糖溶液从硝化纤维膜2边开始浸润硝化纤维膜2，直至硝化纤维膜2完全浸泡在蔗糖溶液中；硝化纤维膜2上不能残留任何气泡；完全干燥硝化纤维膜2；
步骤五：在共轭垫6上固定已预先偶联的荧光标记抗体或纳米金标记抗体，并在36℃下完全干燥；
步骤六：组装LFIA试纸条：先在底板1上粘贴硝化纤维膜2，再依次粘贴过渡垫5、吸收垫4、样品垫3，在过渡垫5上粘贴共轭垫6。
指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。