具体实施方式

为了使本发明的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

I.定义

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。

虽然用以限定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％的内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差的内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，应当可以理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与权利要求书的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。

“施予”(administer或administration)在本发明是指一递送模式，其包含，但不限于，静脉内、肌肉内、腹腔内、动脉内、颅内或皮下递送本发明的药剂(例如，涂覆了DHLA的金纳米团簇)。

在本发明中，“治疗”(treat)一词包含部份或完全预防、改善、减轻及/或处理与高胆固醇血症相关或由高胆固醇血症造成的相关病征(symptom)、次要病征(secondarydisorder)或症状(condition)，其中降低高胆固醇血症的含量可对罹患或疑似罹患这些病征、症状或疾病的个体产生帮助。“治疗”(treat)一词于本说明书中亦指对一个体应用或施予一或多本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇，该个体是罹患与高胆固醇血症相关或由高胆固醇血症造成的相关病征、次要病征或症状，以达到部份或完全减轻、减缓、治愈疾病、延迟发病、抑制病程发展、降低疾病严重性，及/或降低一种或多种与高胆固醇血症相关或由高胆固醇血症造成的相关病征、次要病征或症状的发生。与高胆固醇血症相关或由高胆固醇血症造成的相关病征、次要病征或症状包含，但不限于，冠状动脉心脏病、狭心症、心脏病、中风、TIA及PAD。在此“治疗”(treat)亦可指施予至患有早期这些病征或症状的个体，以降低该个体发展与高胆固醇血症相关或由高胆固醇血症造成的相关病征、次要病征或症状的风险。当一治疗可减少一种或多种病症或临床标记时，则该治疗为“有效的”(effective)。或者是，当一治疗可降低、减缓或终止疾病病程、病征或症状的发展时，则该治疗为“有效的”(effective)。

“有效量”(effective amount)在此处是指一药物的用量足以产生需要的疗效反应。有效量亦指一种化合物或组合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。具体的有效量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将有效量表示成药物的总重量(譬如以克、毫克或微克为单位)或表示成药物重量与体重的比例(其单位为毫克/公斤(mg/kg))。或者是，可将有效量表示成活性成分(例如，本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇)的浓度，例如摩尔浓度、重量浓度、体积浓度、重量摩尔浓度、摩尔分数、重量分数及混合比值。本领域技术人员可依据动物模式的剂量来计算药物(如本发明的涂覆了DHLA的金纳米团簇)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说，本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所公告的“估算成人健康志愿者在初始临床治疗测试的最大安全起始剂量”(Estimating the Maximum Safe Starting Dosein Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。

在本发明中，“高胆固醇血症”(hypercholesterolemia)是指任何因血液中胆固醇含量高于临床建议含量所造成的疾病。举例来说，当以低密度脂蛋白(low densitylipoprotein,LDL)来测量血胆固醇含量时，若测得的LDL含量高于每分升(deciliter,dl)约75毫克，则个体即可能患有高胆固醇血症。或者是，当以无血浆胆固醇来测量血胆固醇含量时，若测得的无血浆高于每分升约200-220毫克，则个体即可能患有高胆固醇血症。

“与高胆固醇血症相关的疾病”(hypercholesterolemia-associated disease)在本发明是指一源自血胆固醇异常升高或因血胆固醇异常升高而恶化的疾病、状况或病征；举例来说，动脉粥状硬化(包含不同的动脉粥状硬化心血管疾病(variousatherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD))、高脂血症、胰脏炎、胆结石、胆管癌，或是VTE。

在本发明中，一“药学上可接受的”(pharmaceutically acceptable)成分是指一可用于人体及/或动物体，而不会产生不良的副作用(例如，毒性、刺激及/或过敏反应)的成分，且具有合理的利益/风险比。

“赋形剂”(excipient)一词在本发明是指任何的惰性物质(例如，粉末或液体)，其可形成本发明的涂覆了DHLA的金纳米团簇的载体或媒介物。赋形剂可以是任何商品化的赋形剂，只要其对于个体通常是安全且无毒性的。

“个体”(subject)一词是指包含人类的动物，其可接受本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇、药物、药学组合物或方法的治疗。除非特定指出，否则“个体”(subject)一词同时意指男性及女性。

II.发明说明

本发明至少部分是基于发明人首次发现可通过涂覆了DHLA的金纳米团簇来降低胆固醇、氧化压力及血管发炎的含量/程度，进而治疗动脉粥状硬化。因此，本发明是关于涂覆了DHLA的金纳米团簇于治疗高胆固醇血症或与高胆固醇血症相关疾病的用途。

本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇是本领域已知的，其制程(Lin et al.,ACSNano(2009)；3:395-401)也是本领域已知的，因此，不需进一步解释其制备过程。涂覆有二氢硫辛酸的金纳米团簇，在激发波长约为420纳米的条件下，可发射出650纳米的偏振光，因此其发射波长范围为红色光至近红外线范围。每个金纳米团簇的粒径约为1到10纳米间，较佳范围约为1到5纳米间。在某些操作实施例中，金纳米团簇的粒径约为2纳米。以上所公开的金纳米团簇的粒径为干燥状态下的金纳米团簇，然而，如果用于本发明的金纳米团簇是水溶性的或至少可分散于液体培养基及/或水中，将会更好；由于与周边溶剂分子(例如，水)耦合，因此金纳米团簇的流体动力学粒径(hydrodynamic size)明显大于其干燥尺寸。于一实施例中，金纳米团簇的流体动力学粒径(hydrodynamic size)约相当于0.1至30千道尔顿(kDa)的聚乙二醇。

本发明一方面是利用涂覆了DHLA的金纳米团簇来制备药学组合物或药物，从而治疗高胆固醇血症或与高胆固醇血症相关的疾病。该药学组合物或药物包含涂覆了DHLA的金纳米团簇，以及非必要地，一药学上可接受的赋形剂.

涂覆了DHLA的金纳米团簇的重量约占药物或药学组合物总重量的0.01％到99.9％。在某些实施方式中，涂覆了DHLA的金纳米团簇的重量至少占药物或药学组合物总重量的0.1％。在某些实施方式中，涂覆了DHLA的金纳米团簇的重量至少占药物或药学组合物总重量的5％。在某些实施方式中，涂覆了DHLA的金纳米团簇的重量至少占药物或药学组合物总重量的10％。在某些实施方式中，涂覆了DHLA的金纳米团簇的重量至少占药物或药学组合物总重量的25％。

在应用上，可将本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇配制成不同剂型，例如锭剂、糖衣包覆锭剂、丸剂、颗粒、气雾、糖浆、悬浮液、溶液、软膏、乳膏、凝胶，或是任何实质上无毒且药学上可接受的赋形剂或载体，特别是利用惰性物质所制备的赋形剂或载体。

本发明亦提供用以治疗一个体的高胆固醇血症或与高胆固醇血症相关的疾病的方法。该方法包含对该个体施予一有效量的本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇，或包含该涂覆了DHLA的金纳米团簇的药物或药学组合物。

可全身性或局部性施予本发明的涂覆了DHLA的金纳米团簇、药物或药学组合物。可通过任何常规的施予路径来施予本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇。举例来说，可以口服、齿舌、舌下、颊部、直肠或肠胃外(即，静脉内、动脉内、心脏内、皮内、皮下、经皮、腹腔内或肌肉内)来进行施予。

依据本发明某些实施方式，该个体为一小鼠。为对小鼠产生治疗功效，是对该个体施予每日每公斤个体体重约0.01到150毫克的涂覆有DHLA的金纳米团簇；较佳地，每日每公斤个体体重约0.1到15毫克；更佳地，每日每公斤个体体重约0.1到1.5毫克。依据一操作实施例，是对该个体施予每日每公斤个体体重0.57毫克的涂覆有DHLA的金纳米团簇。

本领域技术人员可依据动物模式的使用剂量来计算本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇的人体等效剂量。据此，本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇的人体等效剂量为每日每公斤个体体重约0.001到10毫克；举例来说，每日每公斤个体体重约0.001.0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克。较佳地，是以每日每公斤个体体重约0.01到1毫克的本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇来治疗人类个体。更佳地，是以每日每公斤个体体重约0.01到0.1毫克的本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇来治疗人类个体。

或者是，可依据临床因素来调整本发明的涂覆了DHLA的金纳米团簇的有效量，例如欲治疗的疾病、疾病的严重程度、病患的生理参数(包含年龄、身体状况、体型、性别及体重)、治疗的持续时间、同时施予的治疗(若有)、施予路径，以及本领域技术人员或临床操作人员于知识或专业判断上的其他考虑因素。

本领域技术人员或临床操作人员可依据不同因素来调整涂覆了DHLA的金纳米团簇的施予疗程，例如年龄、性别、体重或其他治疗(若有)。举例来说，可每周对个体施予本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇1-7次(例如，每周1、2、3、4、5、6或7次)，连续施予1、2、3、4或更多周。或者是，可每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周对个体施予本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇1-10次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)；或是每个月1次、每2个月1次、每3个月1次或更久时间1次。较佳地，每日对个体施予本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇，且连续施予至少14天(即，2周)；举例来说，施予14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多天。更佳地，每日对个体施予本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇，且连续施予至少28天(即，4周)。依据本发明一操作实施例，每日对个体施予本发明涂覆了DHLA的金纳米团簇，且连续施予56天(即，8周)，以达到治疗功效。

与高胆固醇血症相关的疾病可以是动脉粥状硬化、高脂血症、胰脏炎、胆结石(包含胆固醇胆结石及综合性胆结石)、胆管癌(亦或为胆道癌(cholangiocarcinoma)，包含胆囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)、肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCC)及肝外胆管癌extrahepatic cholangiocarcinoma,eCC))，或是VTE(包含深层静脉栓塞(deep vein thrombosis,DVT)及肺栓塞(pulmonary embolism,PE))。依据某些操作实施方式，与高胆固醇血症相关的疾病是动脉粥状硬化，其中施予涂覆了DHLA的金纳米团簇可有效降低动脉粥状硬化斑(atherosclerotic plaque)的形成，有助于治疗及/或预防不同ASCVD，包含冠状动脉心脏病、狭心症、心脏病、中风、TIA、周边动脉疾病，以及血管狭窄。

基本上，该个体是一哺乳动物；举例来说，人、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔子、狗、猫、牛、山羊、绵羊、猴子及马。较佳地，该个体是人类。

当可想见，本发明方法可单独施予或与其他治疗合并施予至个体体内，其中所述其他治疗对高胆固醇血症或动脉粥状硬化具有治疗帮助，举例来说，他汀类药物。依据使用需求的不同，本发明方法可于施予其他治疗之前、同时或之后，施予至个体体内。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本领域技术人员实施本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料及方法

制备涂覆了DHLA的金纳米团簇(FANC)

本发明的荧光金纳米团簇是以先前所述方法(参见Lin et al.,ACS Nano(2009)；3:395-401)。简言之，经由单相反应(single phase reaction)(参见Jana and Peng,J AmChem Soc(2003)；125:14280-14281)来合成6-纳米的与双十二烷基二甲基溴化铵(didodecyldimethylammonium)稳定结合的金纳米团簇([email protected])，其组成结构如图1所示。再逐渐滴加黄金前驱溶液(氯化金溶于双十二烷基二甲基溴化铵-甲苯溶液)使电浆吸收作用逐渐耗失，直至溶液转变成黄色透明状为止。接着，将先前制备的纳米团簇加入至还原态硫辛酸中以进行配位基置换；还原硫辛酸需新鲜制备，其是以硫辛酸与溴化四丁基铵(TBAB)摩尔比为4:1的比例混合。上述步骤生成深褐色纳米团簇凝块混合物，以紫外线灯照射(365纳米，30分钟)纳米团簇凝块使凝块凝集。去除上清液，加入甲醇至纳米团簇凝块以重新悬浮并分散纳米团簇凝块，接着加入氯仿沉淀去除游离的接口活性剂。此干燥的纳米团簇沉淀物可再次以硼酸缓冲液(pH 9)悬浮散开。接着进行超高速离心(110,000rpm)三次，去除多余的硫辛酸。为了收集金纳米团簇，加入PBS缓冲液至30千道耳顿分子量截断(MWCO)浓缩离心管，至纳米团簇透明溶液胶体稳定且不具电浆吸收波锋为止。该金纳米团簇的浓度，于波长420纳米下的吸光系数约为450,000M^-1cm^-1。

附着试验

将人类主动脉内皮细胞(HAEC)培养于内皮生长培养液中。以每平方厘米10000个细胞的密度，将细胞种植于以1％明胶涂覆的塑料器皿或2％明胶涂覆的玻璃盖玻片上，置于37℃的具有95％空气及5％CO₂气体的潮湿环境中培养。

将HAEC与特定浓度(即，0nM、50nM或100nM)的涂覆有DHLA的金纳米团簇混合3天，之后施予每毫升100纳克的脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)刺激24小时。将活化的HAEC与经钙黄绿素(Calcein AM)处理的单核球共同培养，进行附着试验。培养2小时后，移除未结合的单核球，并以荧光显微镜纪录细胞影像。

动物实验

以正常食物或粒状西式食物(包含0.21％胆固醇)喂食四周大的ApoE^-/-小鼠及野生型C57BL/6小鼠，并施予FANC(每日每公斤体重0.57毫克，共施予56天)或安慰剂(PBS)。将小鼠分为三组：第1组为以正常食物喂食的野生型小鼠；第2组为以正常食物喂食且施予PBS治疗的ApoE^-/-小鼠；第3组则为以西式食物喂食且施予FANC治疗的ApoE^-/-小鼠。

检测及定量分析动脉粥状硬化区域

依据上述动物实验，分别对ApoE缺陷及野生型小鼠施予特定治疗后，分离其主动脉，进行苏丹IV染色(Sudan IV staining)分析，其是一种红色β萘酚重氮染剂，用以分析细胞及组织中含有脂质的物质(例如，三酸甘油酯、脂质及脂蛋白)。以显微镜来观察经染色的主动脉的组织及病理形态，并以软件来决定动脉粥状硬化区域的面积。

分析胆固醇、MDA及4-HNE

为评估本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇是否会影响胆固醇及氧化压力的含量，分别分离经处理56天后的ApoE缺陷小鼠的血清。以胆固醇检测套组来分析血清中的总胆固醇量，并利用酶连结免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)来检测MDA及4-HNE(二种氧化压力指标)的表现量。

实施例1涂覆了DHLA的金纳米团簇的抗动脉粥状硬化功效

本实施例将分析涂覆了DHLA的金纳米团簇对动脉粥状硬化的影响，其中是以正常食物(作为对照组)或西式食物(即高脂食物)喂食ApoE缺陷小鼠，并施予PBS或涂覆了DHLA的金纳米团簇处理。

相较于喂食正常食物的ApoE缺陷小鼠，其动脉粥状硬化斑约占管腔面积的2.57±0.5％，喂食高脂食物会显着增加ApoE缺陷小鼠体内动脉粥状硬化斑的面积，其中动脉粥状硬化斑约会增加6倍，占管腔面积的15.35±2.6％(图2)。值得注意的是，施予涂覆了DHLA的金纳米团簇(于图2中标示为“FANC”)可明显降低动脉粥状硬化斑的面积(图2)。在喂食正常食物且施予涂覆了DHLA的金纳米团簇的ApoE缺陷小鼠则无显着影响。喂食高脂食物的ApoE缺陷小鼠则具呈现相似结果，其中相较于PBS对照组，施予涂覆了DHLA的金纳米团簇会减少约43.3％的动脉粥状硬化斑，动脉粥状硬化斑的面积会降低至管腔面积的8.70±2.5％(图2)。

这些结果显示，本发明的涂覆了DHLA的金纳米团簇对动脉粥状硬化具有治疗功效，可用以治疗不同动脉粥状硬化心血管疾病。

实施例2涂覆了DHLA的金纳米团簇抑制血清胆固醇及氧化压力的功效

本实施例将分析本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇是会否影响胆固醇含量及氧化压力。图3及4图4分析阐述分析结果。

图3的数据指出，相较于喂食正常食物，喂食高脂食物会增加ApoE缺陷小鼠体内血清总胆固醇(正常食物：每分升567.7±32.5毫克；高脂食物：每分升1020.0±55.0毫克)。施予涂覆有DHLA的金纳米团簇(于图3中标示为“FANC”)会明显降低胆固醇含量，其中在喂食正常食物且施予涂覆了DHLA的金纳米团簇治疗的ApoE缺陷小鼠体内，血清总胆固醇会降低至每分升501.0±46.7毫克；而在喂食高脂食物且施予涂覆了DHLA的金纳米团簇治疗的缺陷小鼠体内，血清总胆固醇则会降低至每分升529.0±300.0毫克，约降低48.1％(图3)。

除了胆固醇，本实验亦检测涂覆了DHLA的金纳米团簇对MDA及4-HNE表现的抑制功效。图4A及图4B的结果分析指出，相较于喂食正常食物的野生型小鼠(ApoE^-+/+小鼠)，不论是喂食正常食物或高脂食物都会增加ApoE缺陷小鼠血清中MDA及4-HNE的含量。相较于喂食相同食物且施予PBS的小鼠，施予涂覆了DHLA的金纳米团簇(于图4A及图4B中标示为“FANC”)可显着降低血清中这些氧化压力指标的含量(图4A及图4B)。

这些结果证实，本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇可有效抑制个体体内的胆固醇含量及氧化压力。

实施例3涂覆了DHLA的金纳米团簇对附着分子的功效

基于发炎细胞(例如，巨噬细胞)附着至血管壁会造成血管发炎反应，进而导致动脉粥状硬化的生成及恶化，本实施例将以LPS刺激HAEC来评估本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇(于图5A到图5C标示为“FANC”)是否会影响血管发炎反应。图5A到图5C分别阐述分析结果。

如图5A及图5B所示，LPS会诱发HAEC表现附着分子(即，ICAM-1与VCAM-1，两种媒介血管发炎反应的附着分子)；施予涂覆了DHLA的金纳米团簇会显着降低由LPS所诱发的表现。此外，本发明的涂覆有DHLA的金纳米团簇亦可以剂量相关的方式，降低巨噬细胞附着至HAEC的数量(图5C)。

总结上述，本发明证实涂覆了DHLA的金纳米团簇可通过降低胆固醇、氧化压力及附着分子(例如，ICAM-1与VCAM-1)的含量或表现量来治疗动脉粥状硬化。因此，涂覆了DHLA的金纳米团簇可用以制备治疗不同ASCVD的药物。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，应当可以对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以权利要求书所限定者为准。