具体实施方式

如上所述，本发明提供了与当前化妆品相关的问题的解决方案。在一些实施方案中，临床研究显示，有效量的迷迭香叶提取物、长茎葡萄蕨藻提取物、桑果提取物和/或紫球藻提取物的组合滋润皮肤并提供抗老化益处，例如改善皮肤松弛和皮肤厚度。还显示成分的组合增加了皮肤抗氧化能力(TEAC)、增加皮肤中胶原蛋白的表达、增加皮肤中弹性蛋白的表达、增加皮肤中层粘连蛋白的表达、抑制MMP-1、抑制MMP-3、抑制MMP-9、抑制促炎细胞因子(例如脂氧合酶、IL-6、Il-8、TNF-α或VEGF)、抑制皮肤中弹性蛋白酶的表达和/或增加皮肤中纤连蛋白的表达、或其组合。

显示迷迭香叶提取物使皮肤的抗氧化能力增加52％、抑制皮肤中的MMP-1达98％、MMP-3达40％、MMP-9达61％、抑制促炎细胞因子达54％、IL-6达83％、Il-8达98％、TNF-α达85％和VEGF达50％、以及抑制皮肤中的弹性蛋白酶表达达54％。显示长茎葡萄蕨藻提取物使皮肤中胶原蛋白的表达增加31％、使皮肤中弹性蛋白的表达增加38％并抑制皮肤中的MMP-9的表达达24％。显示桑果提取物使皮肤的抗氧化能力增加98％、使皮肤中胶原蛋白的表达增加27％、使皮肤中层粘连蛋白的表达增加14％、抑制皮肤中MMP-1达96％、MMP-3达29％和MMP-9达84％、抑制皮肤中弹性蛋白酶的表达达25％、以及使皮肤中纤连蛋白的表达增加13％。显示紫球藻提取物使皮肤中胶原蛋白的表达增加53％。

本发明的特定组合物设计为用作局部用组合物。组合物依赖于迷迭香叶提取物、长茎葡萄蕨藻提取物、桑果提取物和/或紫球藻提取物中任意一种、任意组合或全部的独特组合。这些组合可用于制造局部用组合物，其改善皮肤紧致度、改善皮肤光彩、改善肤色清晰度、改善皮肤亮度、改善肤色均匀度、减少皮肤干燥、减少光损伤、减少皮肤紧致度的损失、减少细纹、减少深纹、减少皱纹、减少皮肤暗沉、减少皮肤松弛、减少皮肤上老年斑的出现、增加皮肤的抗氧化能力(TEAC)、增加皮肤中胶原蛋白的表达、增加皮肤中弹性蛋白的表达、增加皮肤中层粘连蛋白的表达、抑制MMP-1、抑制MMP-3、抑制MMP-9抑制促炎细胞因子(例如脂氧合酶、IL-6、Il-8、TNF-α或VEGF)、抑制皮肤中弹性蛋白酶的表达和/或增加皮肤中纤连蛋白的表达。这些组合物的非限制性实例提供于下面实施例1的表1和实施例4的表3中。

本文公开的一些组合物可以施用至皮肤，并留在皮肤上一段时间(例如至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟或60分钟或多于60分钟)。之后，如果需要的话，可将组合物从皮肤上冲洗掉或揭掉。本文公开的一些组合物可以施用于皮肤并立即从皮肤上冲洗掉。本文公开的一些组合物可以施用于皮肤并至少部分地被皮肤吸收。

在以下章节中描述本发明的这些和其他非限制性方面。

A.活性成分

迷迭香叶提取物是来自迷迭香的叶中的提取物。迷迭香是原产于地中海地区，是多年生木本草本植物，具有芳香、常绿、针状的叶和白色、粉红色、紫色或蓝色的花。它是最高可达1.5米高度的灌木，叶子长度为约2cm至4cm，呈绿色(顶面)和白色(底面)。在一些方面，迷迭香叶提取物可以从迷迭香的叶中获得。使用包含甜菜碱或水合甜菜碱、氢键供体化合物(例如多元醇、有机酸等)和水的流体提取混合物对叶进行共熔提取过程。在一些情况下，可以将叶部分捣碎或浸渍，然后置于上述共熔流体提取混合物以获得共熔提取物。然后，共熔提取物可用于本发明的组合物中。在一些情况下，氢键供体是有机酸，优选乳酸。共熔体生成(Eutectigenesis)利用了共熔溶剂，所述共熔溶剂是熔点低于其单独成分熔点的化合物的混合物。在一些情况下，迷迭香可商购获得。在一些情况下，迷迭香可以以商品名Rosemary EUTECTYS^TM由Naturex(法国)提供。已确定有效量的迷迭香叶提取物可用于增强皮肤的抗氧化能力、抑制皮肤中的MMP-1、MMP-3和/或MMP-9、抑制促炎细胞因子脂氧合酶、IL-6、Il-8、TNF-α和/或VEGF、和/或抑制皮肤中弹性蛋白酶的表达。

长茎葡萄蕨藻提取物是来自干燥的长茎葡萄蕨藻的提取物。长茎葡萄蕨藻原产于印度太平洋，是绿藻的一种。长茎葡萄蕨藻还被称为“提子草”或“海葡萄”，因为它类似于一串闪亮的小球体。在菲律宾、马来西亚、日本、越南和印度尼西亚都有食用。在一些情况下，长茎葡萄蕨藻提取物可从Biosil Technologies商购获得，其以商品名提供长茎葡萄蕨藻提取物。在一些情况下，该提取物是含水提取物。在一些情况下，长茎葡萄蕨藻提取物是水提取物。在一些情况下，长茎葡萄蕨藻提取物是干燥的长茎葡萄蕨藻的含水提取物。已确定这种成分可用于增加皮肤中胶原蛋白的表达、增加皮肤中弹性蛋白的表达并抑制皮肤中MMP-9的表达。

桑果提取物是原产于中国北方的白桑果的提取物。在一些情况下，桑果提取物可从Rahn商购获得，其以商品名ENLIGHT提供桑果提取物。在一些情况下，该提取物是甘油/水提取物。可以通过使用甘油/水混合物作为提取溶剂，不使用醇的有机环境下获得桑的果实的提取。已确定这种成分可用于增加皮肤的抗氧化能力、增加皮肤中胶原蛋白的表达、增加皮肤中层粘连蛋白的表达、抑制皮肤中的MMP-1、MMP-3和/或MMP-9、抑制皮肤中弹性蛋白酶的表达和/或增加皮肤中纤连蛋白的表达。

紫球藻提取物是来自紫球藻的提取物。紫球藻是红藻的一种。在一些情况下，该提取物是二醇提取物。在一些情况下，紫球藻提取物可从Rahn USA Corp.商购获得，其以商品名-XPRESS提供紫球藻提取物。在一些方面，该提取物是一种红藻的含水提取物。已确定这种成分可用于增加皮肤中胶原蛋白的表达。

这些成分的组合可以以不同的产品形式使用以处理各种皮肤状况。作为非限制性实例，成分的组合可以配制成乳液(例如，水包油、油包水)、凝胶、精华、凝胶乳液、凝胶精华、润肤露、面膜、磨砂膏、洗剂、霜或身体乳。

本文描述的提取物可以是通过本领域已知的提取方法及其组合而制备的提取物。提取方法的非限制性实例包括使用液-液萃取、固相萃取、水萃取、乙酸乙酯萃取、醇萃取、丙酮萃取、油萃取、超临界二氧化碳萃取、加热萃取、压力萃取、压降萃取、超声提取等。提取物可以是液体、固体、干燥液体、再悬浮固体等。

B.成分的量

预期本发明的组合物可以包含任意量的本说明书所讨论的成分。组合物还可以包含任意数目的在本说明书全文中所描述的附加成分的组合(例如，颜料或附加的化妆品或药物成分)。在该组合物中任意成分的浓度可以改变。例如，在非限制性实施方案中，该组合物在其最终形式中可以包含、主要由以下组分组成或由以下组分组成：例如至少约0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0200％、0.0250％、0.0275％、0.0300％、0.0325％、0.0350％、0.0375％、0.0400％、0.0425％、0.0450％、0.0475％、0.0500％、0.0525％、0.0550％、0.0575％、0.0600％、0.0625％、0.0650％、0.0675％、0.0700％、0.0725％、0.0750％、0.0775％、0.0800％、0.0825％、0.0850％、0.0875％、0.0900％、0.0925％、0.0950％、0.0975％、0.1000％、0.1250％、0.1500％、0.1750％、0.2000％、0.2250％、0.2500％、0.2750％、0.3000％、0.3250％、0.3500％、0.3750％、0.4000％、0.4250％、0.4500％、0.4750％、0.5000％、0.5250％、0.0550％、0.5750％、0.6000％、0.6250％、0.6500％、0.6750％、0.7000％、0.7250％、0.7500％、0.7750％、0.8000％、0.8250％、0.8500％、0.8750％、0.9000％、0.9250％、0.9500％、0.9750％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或其间可导的任意范围的至少一种在本说明书的全文和权利要求所提及的成分。在非限制性方面，该百分比可以按整个组合物的重量或体积进行计算。本领域普通技术人员会理解，给定组合物中的浓度可以根据成分的添加、替换和/或减少而改变。

C.载体

本发明的组合物可以包含或被并入到所有类型的载体和载剂中。载体或载剂可以是药学上或皮肤病学上可接受的载体和载剂。载体和载剂的非限制性实例包括水、甘油、醇、油、含硅化合物、含硅酮的化合物和蜡。变体和其它合适的载体对于熟练技术人员是明显的，并且适用于本发明。在某些方面，挑选化合物、成分和试剂的浓度和组合，使得组合物是化学相容的并且不形成从完成的产物中沉淀出来的复合物。

D.结构

本发明的组合物可以被构造或配制成各种不同的形式。非限制性实例包括乳液(例如，油包水、水包油包水、水包油、水包硅酮、硅酮包水、油包水包油、硅酮包水包油的乳液)、霜、润肤露、溶液(水溶液或者水-醇溶液)、无水基底(例如口红和散粉)、凝胶、面膜、磨砂膏、身体乳、撕拉式面膜和软膏。变体和其它结构对于熟练技术人员是明显的，并且适用于本发明。

E.附加成分

除了发明人所公开的成分的组合之外，组合物还可以包含附加成分，例如化妆品成分和药物活性成分。这些附加成分的非限制性实例在以下子章节中进行描述。

1.化妆品成分

CTFA国际化妆品成分词典和手册(2004和2008)描述了多种可以在本发明的上下文中使用的非限制性化妆品成分。这些成分种类的实例包括：芳香剂(人造的和天然的；例如葡糖酸、苯氧乙醇和三乙醇胺)、染料和着色成分(例如Blue 1、Blue 1Lake、Red 40、二氧化钛、D&C蓝色4号、D&C绿色5号、D&C橙色4号、D&C红色17号、D&C红色33号、D&C紫色2号、D&C黄色10号和D&C黄色11号)、调味剂/香味剂(甜叶菊(Stevia rebaudiana)提取物和薄荷醇)、吸附剂、润滑剂、溶剂、保湿剂(包括例如润肤剂、湿润剂、成膜剂、闭塞剂和影响皮肤天然保湿机制的试剂)、拒水剂、UV吸收剂(物理和化学吸收剂，例如对氨基苯甲酸(“PABA”)和相应的PABA衍生物、二氧化钛、氧化锌等)、精油、维生素(例如A、B、C、D、E和K)、微量金属(例如锌、钙和硒)、抗刺激物(例如类固醇和非固醇类抗炎药)、植物提取物(例如芦荟(Aloevera)、柑橘、黄瓜提取物、银杏(Ginkgo biloba)、人参和迷迭香)、抗菌剂、抗氧化剂(例如BHT和生育酚)、螯合剂(例如EDTA二钠和EDTA四钠)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、pH调节剂(例如氢氧化钠和柠檬酸)、吸收剂(例如淀粉辛烯琥珀酸铝、高岭土、玉米淀粉、燕麦淀粉、环糊精、滑石和沸石)、皮肤漂白和提亮剂(例如氢醌和烟酰胺乳酸盐)、湿润剂(例如山梨醇、脲、甲基葡糖醇聚醚-20、异构糖和甘露醇)、去角质剂、阻水剂(例如氢氧化钠镁/铝硬脂酸盐)、皮肤调节剂(例如芦荟提取物、尿囊素、红没药醇、神经酰胺、聚二甲基硅氧烷、透明质酸、生物糖胶-1、乙基己基甘油、戊二醇、氢化聚癸烯、辛基十二醇油酸酯、葡糖酸内酯、环己硅氧烷和甘草酸二钾)。这些成分中一些的非限制性实例在以下子章节中提供。

a.UV吸收剂和/或反射剂

可以与本发明的组合物组合使用的UV吸收剂和/或反射剂包括化学和物理防晒霜。可以使用的化学防晒霜的非限制性实例包括对氨基苯甲酸(PABA)、PABA酯(甘油PABA酯、戊基二甲醇PABA酯和辛基二甲醇PABA酯)、PABA丁酯、PABA乙酯、乙基二羟基丙醇PABA酯、二苯甲酮(羟苯甲酮、磺异苯酮、二苯甲酮和二苯甲酮-1到二苯甲酮-12)、肉桂酸酯(甲氧基肉桂酸辛酯(桂皮酸酯))、对-甲氧基肉桂酸异戊酯、肉桂酸辛基甲氧基酯、西诺沙酯、肉桂酸二异丙基甲酯、甲氧基肉桂酸DEA盐、二异丙基肉桂酸乙酯、甘油辛酸酯二甲氧基酯和甲氧基肉桂酸乙酯)、肉桂酸酯、水杨酸酯(均甲基水杨酸酯、水杨酸苄酯、乙二醇水杨酸酯、异丙基苄醇水杨酸酯等)、邻氨基苯甲酸酯、尿刊酸乙酯、胡莫柳酯、水杨酸辛酯、二苯甲酰基甲烷衍生物(例如阿伏苯宗)、奥克立林、辛基三嗪酮、棓酰棓酸三油酸酯、氨基苯甲酸甘油酯、含二羟基丙酮的指甲花醌、乙基己基三嗪酮、二辛基丁酰胺基三嗪酮、苯亚甲基丙二酸脂聚二甲基硅氧烷、对苯二亚甲基二莰酮磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠、二乙氨基羟基苯甲酰基苯甲酸己酯、双二乙氨基羟基苯甲酰基苯甲酸酯、双苯并恶唑基苯基乙基己基亚氨基三嗪、甲酚曲唑三硅氧烷、亚甲基双苯并三唑基四甲基丁基苯酚和双乙基己基氧苯酚甲氧苯基三嗪、4-甲基苯亚甲基莰酮和4-甲氧基肉桂酸异戊酯。-物理防晒霜的非限制性实例包括高岭土、滑石、矿脂和金属氧化物(例如二氧化钛和氧化锌)。

b.保湿剂

可以与本发明的组合物一起使用的保湿剂的非限制性实例包括氨基酸、硫酸软骨素、双甘油、赤藓糖醇、果糖、葡萄糖、甘油、甘油聚合物、乙二醇、1,2,6-己三醇、蜂蜜、透明质酸、氢化蜂蜜、氢化淀粉水解物、肌醇、乳糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖、甘露醇、天然保湿因子、PEG-15丁二醇、聚甘油山梨醇、糖类同分异构体、吡咯烷酮羧酸的盐、PCA钾、丙二醇、异构寡糖、葡糖醛酸钠、PCA钠、山梨醇、蔗糖、海藻糖、脲和木糖醇。

其他实例包括乙酰化羊毛脂、乙酰化羊毛脂醇、丙氨酸、藻类提取物、翠叶芦荟(Aloe barbadensis)、翠叶芦荟提取物、翠叶芦荟凝胶、药蜀葵(Althea officinalis)提取物、杏子(杏，Prunus armeniaca)仁油、精氨酸、精氨酸天冬氨酸酯、山金车(Arnicamontana)提取物、天冬氨酸、鳄梨(酪梨，Persea gratissima)油、屏障鞘脂、丁醇、蜂蜡、山萮醇、β-谷甾醇、白桦(垂枝桦，Betula alba)树皮提取物、琉璃苣(Borago officinalis)提取物、假叶树(Ruscus aculeatus)提取物、丁二醇、金盏花(Calendula officinalis)提取物、金盏花油、小烛树(Euphorbia cerifera)蜡、菜籽油、辛酸/癸酸甘油三酯、小豆蔻(Elettaria cardamomum)油、巴西棕榈(Copernicia cerifera)蜡、胡萝卜(Daucus carotasativa)油、蓖麻(Ricinus communis)油、神经酰胺、地蜡、鲸蜡硬脂醇聚醚-5、鲸蜡硬脂醇聚醚-12、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇辛酸酯、鲸蜡醇聚醚-20、鲸蜡醇聚醚-24、鲸蜡醇乙酸酯、鲸蜡醇辛酸酯、鲸蜡醇棕榈酸酯、洋甘菊(白花春黄菊，Anthemis nobilis)油、胆固醇、胆固醇酯、胆甾醇羟基硬脂酸酯、柠檬酸、鼠尾草(欧丹参，Salvia sclarea)油、可可(Theobroma cacao)脂、椰油醇-辛酸酯/癸酸酯、椰子(Cocos nucifera)油、胶原蛋白、胶原蛋白氨基酸、玉米(Zea mays)油、脂肪酸、油酸癸酯、聚二甲基硅氧烷共聚醇、聚二甲基硅氧烷醇、己二酸二辛酯、琥珀酸二辛酯、二聚季戊四醇六辛酸酯/六癸酸酯、DNA、赤藓糖醇、乙氧基二乙二醇、亚油酸乙酯、蓝桉(Eucalyptus globulus)油、夜来香(月见草，Oenotherabiennis)油、脂肪酸、斑点老鹳草(Geranium maculatum)油、葡萄糖胺、葡糖谷氨酸酯、谷氨酸、甘油聚醚-26、甘油、丙三醇、二硬脂酸甘油酯、羟基硬脂酸甘油酯、月桂酸甘油酯、亚油酸甘油酯、豆蔻酸甘油酯、油酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯SE、甘氨酸、乙二醇硬酯酸酯、乙二醇硬酯酸酯SE、葡糖氨基葡聚糖、葡萄(Vitis vinifera)籽油、榛子(美洲榛，Corylus americana)坚果油、榛子(欧洲榛，Corylus avellana)坚果油、己二醇、透明质酸、混合红花(Carthamus tinctorius)油、氢化蓖麻油、氢化椰油甘油酯、氢化椰子油、氢化羊毛脂、氢化卵磷脂、氢化棕榈油甘油酯、氢化棕榈仁油、氢化大豆油、氢化牛脂酸甘油酯、氢化植物油、水解胶原蛋白、水解弹性蛋白、水解葡糖氨基葡聚糖、水解角蛋白、水解大豆蛋白、羟基化羊毛脂、羟基脯氨酸、异鲸蜡醇硬脂酸酯、异鲸蜡醇硬脂酰氧基硬脂酸酯、油酸异癸酯、异硬脂酸异丙酯、羊毛脂酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、异硬脂酰胺DEA、异硬脂酸、异硬脂醇乳酸酯、异硬脂醇新戊酸酯、茉莉(素方花，Jasminumofficinale)油、霍霍巴(Buxus chinensis)油、巨藻、石栗(Aleurites moluccana)坚果油、乳酰胺MEA、羊毛脂醇聚醚-16、羊毛脂醇聚醚-10乙酸酯、羊毛脂、羊毛脂酸、羊毛脂醇、羊毛脂油、羊毛脂蜡、薰衣草(Lavandula angustifolia)油、卵磷脂、柠檬(Citrus medicalimonum)油、亚油酸、亚麻酸、澳洲坚果(Macadamia ternifolia)油、麦芽糖醇、母菊(Chamomilla recutita)油、甲基葡糖倍半硬脂酸酯、甲基硅烷醇PCA酯、矿物油、貂油、黄褐色被孢霉油、肉豆蔻醇乳酸酯、肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯、肉豆蔻醇丙酸酯、新戊二醇二辛酸酯/二癸酸酯、辛基十二醇、肉豆蔻酸辛基十二醇酯、硬脂酰氧基硬脂酸辛基十二醇酯、羟基硬脂酸辛酯、棕榈酸辛酯、水杨酸辛酯、硬脂酸辛酯、油酸、橄榄(Olea europaea)油、橙(Citrus aurantium dulcis)油、棕榈(Elaeis guineensis)油、棕榈酸、泛硫乙胺、泛醇、泛醇基乙基醚、石蜡、PCA、桃(Prunus persica)仁油、花生(Arachis hypogaea)油、PEG-8C12-18酸酯、PEG-15椰油胺、PEG-150二硬脂酸酯、PEG-60甘油异硬脂酸酯、PEG-5甘油硬脂酸酯、PEG-30甘油硬脂酸酯、PEG-7氢化蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯、PEG-40失水山梨醇全油酸酯、PEG-5大豆甾醇、PEG-10大豆甾醇、PEG-2硬脂酸酯、PEG-8硬脂酸酯、PEG-20硬脂酸酯、PEG-32硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-50硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-150硬脂酸酯、十五内酯、胡椒薄荷(辣薄荷，Mentha piperita)油、矿脂、磷脂、浮游生物提取物、多氨基酸多糖缩合物、聚甘油二异硬脂酸酯-3、聚季铵盐-24、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、肉豆蔻酸钾、棕榈酸钾、丙二醇、丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯、丙二醇二辛酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇月桂酸酯、丙二醇硬脂酸酯、丙二醇硬脂酸酯SE、PVP、吡哆素二棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇棕榈酸酯、米(稻，Oryza sativa)糠油、RNA、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)油、玫瑰油、红花(Carthamus tinctorius)油、鼠尾草(Salvia officinalis)油、檀香(Santalum album)油、丝氨酸、血清蛋白、芝麻(Sesamum indicum)油、牛油果(Butyrospermum parkii)脂、蚕丝粉、软骨素硫酸钠、透明质酸钠、乳酸钠、棕榈酸钠、PCA钠、聚谷氨酸钠、可溶性胶原、山梨坦月桂酸酯、山梨坦油酸酯、山梨坦棕榈酸酯、山梨坦倍半油酸酯、山梨醇硬脂酸酯、山梨醇、大豆(Glycine soja)油、鞘脂、角鲨烷、角鲨烯、硬脂酰胺MEA-硬脂酸酯、硬脂酸、硬脂氧基聚二甲硅氧烷、硬脂氧基三甲基硅烷、硬脂醇、硬脂醇甘草亭酸酯、硬脂醇庚酸酯、硬脂醇硬脂酸酯、向日葵(Helianthus annuus)籽油、甜扁桃(Prunus amygdalus dulcis)油、合成蜂蜡、生育酚、生育酚乙酸酯、生育酚亚油酸酯、三山嵛酸甘油酯、十三烷醇新戊酸酯、十三烷醇硬脂酸酯、三乙醇胺、三硬脂精、脲、植物油、水、蜡、小麦(Triticum vulgare)胚芽油和依兰(Cananga odorata)油。

c.抗氧化剂

可以与本发明的组合物一起使用的抗氧化剂的非限制性实例包括乙酰半胱氨酸、抗坏血酸多肽、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸甲基硅烷醇果胶酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、BHA、BHT、叔丁基氢醌、半胱氨酸、半胱氨酸HCI、二戊基氢醌、二叔丁基氢醌、二鲸蜡醇硫代二丙酸酯、二油基生育酚甲基硅烷醇、抗坏血酸硫酸酯二钠、二硬脂醇硫代二丙酸酯、双十三烷醇硫代二丙酸酯、十二醇棓酸酯、异抗坏血酸、抗坏血酸酯、阿魏酸乙酯、阿魏酸、没食子酸酯、氢醌、巯基乙酸异辛酯、曲酸、抗坏血酸镁、抗坏血酸磷酸酯镁、甲基硅烷醇抗坏血酸酯、天然植物抗氧化剂例如绿茶或葡萄籽提取物、去甲二氢愈创木酸、没食子酸辛酯、苯巯基乙酸、磷酸抗坏血酸酯生育酚酯钾、亚硫酸钾、没食子酸丙酯、醌、迷迭香酸、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、异抗坏血酸钠、焦亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、超氧化物歧化酶、巯基乙酸钠、山梨醇缩糠醛、硫二甘醇、亚硫基二乙酰胺、硫二乙酸、巯基乙酸、硫代乳酸、硫代水杨酸、生育酚聚醚-5、生育酚聚醚-10、生育酚聚醚-12、生育酚聚醚-18、生育酚聚醚-50、生育酚、托可索伦、生育酚乙酸酯、亚油酸生育酚酯、烟酸生育酚酯、琥珀酸生育酚酯和亚磷酸三(壬基苯酚)酯。

d.结构化剂

在其它非限制性方面，本发明的组合物可以包含结构化剂。在某些方面，结构化剂帮助向组合物提供流变学特征以促进组合物的稳定性。在其它方面，结构化剂还可以起乳化剂或表面活性剂的作用。结构化剂的非限制性实例包括椰油酰谷氨酸二钠、羟丙基环糊精、硬脂酸、棕榈酸、硬脂醇、鲸蜡醇、山嵛醇、硬脂酸、棕榈酸、具有平均约1个到约21个亚乙基氧单元的硬脂醇的聚乙二醇醚、具有平均约1个到约5个亚乙基氧单元的鲸蜡醇的聚乙二醇醚及其混合物。

e.乳化剂

在本发明的特定方面，组合物不包含乳化剂。然而，在其它方面，组合物可以包含一种或多于一种乳化剂。乳化剂可以降低相间界面张力并改善乳液的配制和稳定性。乳化剂可以是非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的乳化剂(参见美国专利第5011681号；第4421769号；第3755560号)。非限制性实例包括甘油酯、丙二醇酯、丙二醇的脂肪酸酯、聚丙二醇的脂肪酸酯、山梨醇的酯、失水山梨醇酐酯、羧酸共聚物、葡萄糖的酯和醚、乙氧基化的酯、乙氧基化的醇、磷酸烷基酯、聚氧乙烯脂肪醚磷酸酯、脂肪酸酰胺、乳酰乳酸酯、脂肪酸盐、TEA硬脂酸酯、DEA油醇聚氧乙烯醚-3磷酸酯、聚乙二醇20、失水山梨醇单月桂酸酯(聚山梨醇酯20)、聚乙二醇5大豆甾醇、硬脂醇聚氧乙烯醚-2、硬脂醇聚氧乙烯醚-20、硬脂醇聚氧乙烯醚-21、鲸蜡硬脂醇聚醚-20、鲸蜡硬脂基葡糖苷、鲸蜡硬脂醇、C12-13链烷醇聚醚-3、PPG-2甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯、PPG-5-鲸蜡硬脂醇聚醚-20、双-PEG/PPG-20/20二甲硅酮、鲸蜡醇聚氧乙烯醚-10、聚山梨醇酯80、鲸蜡醇磷酸酯、鲸蜡醇磷酸酯钾、二乙醇胺鲸蜡醇磷酸酯、聚山梨醇酯60、甘油硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、花生醇、花生醇葡糖苷及其混合物。

f.含硅酮的化合物

在非限制性方面，含硅酮的化合物包括分子主链由交替的硅和氧原子组成的聚合物产品家族中的任意成员，其中侧基连接在硅原子上。通过改变-Si-O-链的长度、侧基和交联，硅酮可以合成为各种各样的材料。它们的稠度可以从液体到凝胶到固体改变。

可以在本发明的环境下使用的含硅酮的化合物包含本说明书中所描述的或本领域普通技术人员已知的那些。非限制性实例包括硅油(例如挥发性和非挥发性油)、凝胶和固体。在一些方面，含硅化合物包括硅油，例如聚有机硅氧烷。聚有机硅氧烷的非限制性实例包括聚二甲基硅氧烷、环聚二甲基硅氧烷、环己硅氧烷、聚硅酮-11、苯基三甲基聚硅氧烷、聚三甲基硅氨基二甲基硅氧烷、硬脂氧基三甲基硅烷或这些的混合物和其它任何给定比例的有机硅氧烷材料，以根据预期的应用(例如，对特定区域例如皮肤、毛发或眼睛)达到期望的稠度和应用特征。“挥发性硅油”包括具有低气化热的硅油，即通常低于约50卡每克硅油。挥发性硅油的非限制性实例包括：环聚二甲基硅氧烷，例如Dow Corning 344Fluid、Dow Corning 345Fluid、Dow Corning 244Fluid和Dow Corning 245Fluid、VolatileSilicon 7207(康涅狄格州丹伯里的Union Carbide Corp.)；低黏度聚二甲基硅氧烷，即黏度大约为50cst或更低的聚二甲基硅氧烷(例如聚二甲基硅氧烷，例如Dow Corning 200-0.5cst Fluid)。Dow Corning Fluid可以从密歇根州米德兰的Dow Corning Corporation购得。在CTFA化妆品成分词典第三版中(通过引用并入)，环聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷分别被描述为环状二甲基聚硅氧烷化合物和用三甲基硅氧基单元封端的完全甲基化的线性硅氧烷混合物。可以在本发明的环境下使用的其它非限制性挥发性硅油包含从纽约州沃特福德的General Electric Co.，Silicone Products Div.和密歇根州艾德里安的Stauffer Chemical Co.的SWS Silicones Div.购得的那些。

g.去角质剂

去角质剂包含去除皮肤外表面死皮肤细胞的成分。这些试剂可以通过机械、化学和或其他方式起作用。机械去角质剂的非限制性实例包括磨料，例如浮石、二氧化硅、织物、纸、贝壳、珠、固体晶体、固体聚合物等。化学去角质剂的非限制性实例包括酸和酶去角质剂。可用作去角质剂的酸包括但不限于乙醇酸、乳酸、柠檬酸、α羟基酸、β羟基酸等。本领域技术人员已知的其他去角质剂也预期在本发明的上下文中有用。

h.精油

精油包括来自药草、花、树和其它植物的油。这些油一般以植物细胞间微小的液滴存在，并可以通过本领域技术人员已知的若干方法(例如，蒸气蒸馏、脂吸法(即通过使用脂肪萃取)、浸渍、溶剂萃取或机械压榨)进行提取。当这些类型的油暴露于空气时，其趋于挥发(即挥发性油)。因此，虽然许多精油是无色的，但是随着时间其被氧化并且颜色变得更深。精油不溶于水，但溶于醇、醚、非挥发油(植物油)和其他有机溶剂。在精油中发现的一般物理特征包括从约160℃到240℃变化的沸点和从约0.759到约1.096的密度。

精油一般通过油被发现的植物来命名。例如，玫瑰油或薄荷油分别来自玫瑰或薄荷植物。可以在本发明的环境下使用的精油的非限制性实例包括芝麻油、澳洲坚果油、茶树油、月见草油、西班牙鼠尾草油、西班牙迷迭香油、芫荽油、百里香油、多香果油、玫瑰油、茴香油、香脂花油、香柠檬油、玫瑰木油、香柏油、甘菊油、鼠尾草油、香紫苏油、丁香油、柏木油、桉油、茴香油、海茴香油、乳香油、香叶油、姜油、葡萄柚油、茉莉油、杜松子油、薰衣草油、柠檬油、柠檬草油、梨莓油、橘子油、甘牛至油、没药油、橙花油、橙油、广藿香油、胡椒油、黑胡椒油、苦橙叶油、松油、奥图玫瑰油、迷迭香油、檀香油、绿薄荷油、甘松油、香根草油、冬青油或依兰依兰。还预期本领域技术人员已知的其它精油在本发明的环境下有用。

i.增稠剂

包括增稠剂或凝胶剂在内的增稠剂，包括可以增加组合物黏度的物质。增稠剂包括可以增加组合物黏度而基本上不改变组合物内活性成分功效的那些。增稠剂还可以增加本发明的组合物的稳定性。在本发明的一些方面，增稠剂包含氢化聚异丁烯、三羟基硬脂酸甘油酯、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物或其混合物。

可以在本发明的环境下使用的另外的增稠剂的非限制性实例包括羧酸聚合物、交联的聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖和胶。羧酸聚合物的实例包括含有衍生自丙烯酸的一种或多于一种单体的交联化合物、经取代的丙烯酸、以及这些丙烯酸和经取代的丙烯酸的盐和酯，其中所述交联剂含有两个或多于两个碳-碳双键，并衍生自多元醇(参见美国专利第5087445号；第4509949号；第2798053号；CTFA国际化妆品成分词典，第四版，1991，第12和80页)。市售羧酸聚合物的实例包括卡波姆，其为丙烯酸与蔗糖或季戊四醇的烯丙基醚交联的均聚物(例如，购自Lubrizol的Carbopol Ultrez 10)。

交联的聚丙烯酸酯聚合物的非限制性实例包括阳离子型和非离子型聚合物。实例描述于美国专利第5100660号、第4849484号、第4835206号、第4628078号、第4599379号。

聚丙烯酰胺聚合物(包括非离子的聚丙烯酰胺聚合物，其包含经取代的支化或未支化的聚合物)的非限制性实例包含聚丙烯酰胺、异构烷烃和月桂醇聚氧醚-7、丙烯酰胺和经取代的丙烯酰胺与丙烯酸和经取代的丙烯酸的多嵌段共聚物。

多糖的非限制性实例包括纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、乙酸丙酸羧酸纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、微晶纤维素、纤维素硫酸钠及其混合物。其他实例为烷基取代的纤维素，其中纤维素聚合物的羟基被羟烷基化(优选地羟乙基化或羟丙基化)以形成羟烷基化的纤维素，其然后用C10-C30直链或支链烷基基团通过醚键进行进行进一步改性。一般这些聚合物为C10-C30直链或带支链的醇与羟烷基纤维素的醚。其它有用的多糖包括硬葡聚糖，其包含每三个单元具有(1-6)个连接的葡萄糖的(1-3)连接的葡萄糖单元的直链。

本发明可以使用的胶的非限制性实例包括阿拉伯树胶、琼脂、藻胶、藻酸、藻酸铵、支链淀粉、藻酸钙、角叉菜胶钙、肉毒碱、角叉菜胶、糊精、明胶、结冷胶、瓜尔豆胶、瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵、锂蒙脱石、透明质酸、水合硅石、羟丙基壳聚糖、羟丙基瓜尔胶、卡拉亚胶、巨藻、刺槐角豆胶、纳豆胶、藻酸钾、角叉菜胶钾、藻酸丙二醇酯、菌核胶、羧甲基葡聚糖钠、角叉菜胶钠、黄蓍胶、黄原胶及其混合物。

j.防腐剂

可以在本发明的环境下使用的防腐剂的非限制性实例包括季铵盐防腐剂如聚季铵盐-1和苄烷铵卤化物(例如苯扎氯铵(“BAC”)和苯扎溴铵)、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、苯氧基乙醇、苄醇、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒或其组合。

2.药物成分

还预期药物活性剂对本发明的组合物是有用的。药物活性剂的非限制性实例包括抗粉刺剂、用于处理酒渣鼻的试剂、止痛剂、麻醉剂、肛门直肠药、抗组胺药、包括非甾族消炎药在内的消炎剂、抗生素、抗菌剂、抗病毒素、抗微生物剂、抗癌活性剂、抗疥螨剂、灭虱剂、抗肿瘤药、防汗药、止痒剂、抗牛皮癣药、抗脂溢剂、生物活性蛋白质和多肽、烧伤处理剂、烧灼剂、脱色剂、脱毛剂、尿布疹处理剂、酶、毛发生长刺激剂、包括DFMO及其盐和类似物在内的毛发生长抑制剂、止血剂、角质分离剂、口疮处理剂、唇疱疹处理剂、牙科或牙周处理剂、光敏感活性物、皮肤保护剂/屏障剂、包括激素和皮质激素的类固醇、晒伤处理剂、遮光剂、经皮活性剂、鼻活性剂、阴道活性剂、疣处理剂、创伤处理剂、创伤愈合剂等。

F.试剂盒

还预期了用于本发明的一些方面的试剂盒。例如，本发明的组合物可以包含在试剂盒内。试剂盒可以包括容器。容器可以包括瓶子、金属管、层压管、塑料管、分配器、高压容器、屏障容器、袋、分室、口红容器、压缩容器、能够保存化妆品组合物的化妆品盘或其它类型的容器如注射或吹塑成型的塑料容器，其中保存分散体或组合物或所需的瓶子、分配器或包装。试剂盒和/或容器在其表面上可包含标记。例如，标记可以是字词、短语、缩写、图片或符号。

所述容器可以分配预定量的组合物。在其他实施方案中，可以挤压容器(例如金属、层压或塑料管)以分配期望量的组合物。组合物可以分配为喷雾、气溶胶、液体、流体或半固体。容器可以具有喷雾、抽吸机构或挤压机构。试剂盒还可以包含使用试剂盒组分以及使用任何包含于容器内的组合物的说明书。说明书可以包括如何施用、使用和保存组合物的说明。

实施例

列出了以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并因此可以被认为为其实践建立优选的模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，在所公开的具体实施方案中可以做许多改变，并仍获得类似或相似的结果。

本文所公开和要求保护的所有组合物和方法根据本公开可以不需要过多实验即而做出和实现。尽管本发明的组合物和方法已经按照优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对所述组合物和方法以及在本文所描述方法的步骤或步骤的顺序中进行改变。更具体地，明显地，化学和生理两方面都相关的特定试剂可以替代本文所描述的试剂，同时会实现相同或相似的结果。所有对本领域技术人员明显的这类相似的替代和改变都被视为在如由所附权利要求限定的本发明的构思、范围和概念内。

实施例1

(使用的材料)

表1中的活性成分用于获得下面提到的体外数据。

表1

实施例2

(临床功效研究)

出人意料地确定使用迷迭香叶提取物、长茎葡萄蕨藻提取物、桑果提取物和紫球藻提取物的组合在临床测试例如由超声测量的皮肤厚度、由专家临床评分和2-D摄影测量的皮肤松弛的减少、以及皮肤水分的改善方面是有效的。该数据表明成分的组合可以协同作用。

A.皮肤厚度和皮肤松弛

进行临床对照研究以评估面部乳液处理产品为皮肤提供抗衰老益处的功效。该研究在九(9)周内进行，其中第一周可以是“清洗期”，以确保参与者先前的产品使用不会影响本研究，接下来的八(8)周可以包括测试产品使用。在处理的基线、第2周、第4周和第8周进行皮肤厚度和皮肤松弛的评估。用于评估的方法包括用于皮肤厚度的超声、用于皮肤松弛评估的专家临床评分和2D摄影皮肤松弛评估。

参与者是健康的亚洲女性志愿者，年龄为36岁至65岁。参与者在面部具有皮肤松弛的可视迹象。指导参与者在研究期间的每个早上和每个晚上都施用测试面部乳液产品以清洁皮肤，施用至整个面部和前额。

使用超声测量皮肤厚度并与基线的测量比较。对于皮肤厚度，参与者在第2周和第4周表现出明显的改善，并且在第8周维持该改善。测试产品相对于基线的皮肤厚度的改善平均百分比在第2周为6％，在第4周为8％，在第8周为8％。还记录了显示出改善的参与者的百分比。皮肤厚度经改善的参与者的百分比在第2周为70％，在第4周为80％，并且在第8周为83％。使用2-D摄影和可视的专家临床评分测量松弛的皮肤。对于皮肤松弛的可视的改善，参与者在第8周显示出明显的改善。松弛皮肤的改善的平均百分比相对于基线在第8周为5％。显示出松弛皮肤的可视改善的参与者的百分比相对于基线在第2周为8％，在第4周为25％，并且在第8周为42％。

B.皮肤水分

还进行了水分研究。进行受控的临床研究以评估面部乳液处理产品为皮肤提供抗水分益处的功效。该研究在五(5)周内进行，其中前三天是“清洗期”，以确保参与者先前的产品使用不会影响本研究，接下来的两天包括测试产品的使用。在基线进行皮肤水分的研究。施用产品之后紧接着是第6小时和第8小时的处理。评估的方法包括使用NovameterDPM9003仪器测试水分水平。

参与者是二十六(26)岁的健康志愿者。通过对干燥皮肤的自我评估和用Novameter DPM9003读数小于130确认干燥皮肤来选择参与者。研究人员将20μL测试面部乳液产品施用至每个志愿者前臂的手掌表面预确认的36mm位点，剂量密度为2μL/cm²。参与者在基线、在施用后立刻、处理后六(6)小时和处理后八(8)小时自我评估皮肤水分的水平。所有参与者均报告在使用测试产品后立即改善了皮肤水分。所有参与者均报告在施用测试产品后的第6时和第8时也显示出水分的改善。

实施例3

(成分的体外功效)

已确定迷迭香叶提取物、长茎葡萄蕨藻提取物、桑果提取物和紫球藻提取物可以增加皮肤抗氧化能力(TEAC)、增加皮肤中胶原蛋白的表达、增加皮肤中弹性蛋白的表达、增加皮肤中层粘连蛋白的表达、抑制MMP-1、抑制MMP-3、抑制MMP-9、抑制促炎细胞因子(例如脂氧合酶、IL-6、Il-8、TNF-α或VEGF)、抑制皮肤中弹性蛋白酶的表达和/或增加皮肤中纤连蛋白的表达。结果的总结在表2至表9中示出，并在以下提供用于确定成分性能的方法。

表2

(活性表达的变化)

抗氧化(AO)分析：显示迷迭香叶提取物和桑果提取物通过抑制(2,2'-叠氮基二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐])氧化为+来提供抗氧化能力(TEAC)。活生物体的抗氧化系统包含酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶；高分子，例如白蛋白、血浆铜蓝蛋白和铁蛋白；和大量小分子，包括抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素、还原型谷胱甘肽、尿酸和胆红素。內源的和源自食物的抗氧化剂的总量表示细胞外液的总抗氧化能力。所有不同抗氧化剂的协作提供比单独的任何单个化合物更强的对抗反应性氧或氮自由基侵袭的保护。因此，与测量单独组分获得的抗氧化能力相比，总的抗氧化能力可以给出更相关的生物信息，因为其考虑了血浆和体液中存在的所有抗氧化剂的累积效应。迷迭香叶提取物和桑果提取物预防ABTS氧化的能力与水溶性生育酚类似物Trolox进行比较，并以Trolox的摩尔当量进行定量。使用来自Cayman Chemical(美国密歇根安娜堡)的抗氧化能力试剂盒#709001来测量总的抗氧化能力。测定了与Trolox对氧化的抑制相比，迷迭香叶提取物抑制ABTS被正铁肌红蛋白氧化为ABTS·+达52％，桑果提取物抑制达98％。

胶原蛋白刺激分析：已显示桑果提取物、长茎葡萄蕨藻提取物和紫球藻提取物增加了胶原蛋白前体1型前胶原的表达。可以合成胶原蛋白(I型、II型、III型、IV型和V型)，作为称为前胶原的前体分子。这些前体分子在氨基末端和羧基末端含有另外的肽序列，通常称为“前肽”。在细胞表达和分泌过程中，前胶原以三聚体形式组装，然后通过特异性肽链内切酶在特异性N末端和C末端位点裂解，生成三个片段：1型前胶原N末端前肽(PINP)、I型胶原蛋白和1型前胶原羧基末端前肽(PICP)。

前肽的功能是促进前胶原分子在内质网内缠绕成三螺旋构象。前肽在其分泌过程中从胶原三螺旋分子上切下，之后，三螺旋胶原聚合成细胞外胶原原纤维。因此，游离前肽的量在化学计量上反映了合成的胶原分子的量(类似于胰岛素原的羧基末端肽与内源性胰岛素之间的关系)。胶原蛋白是对皮肤结构关键的细胞外基质蛋白。增加的胶原蛋白合成帮助改善皮肤紧致度和弹性。

成纤维细胞提取物和培养上清液中PICP的定量检测用酶免疫测定试剂盒(例如Takara#MK101)进行，以评估这些成分对皮肤中PICP合成的影响。使用该生物分析检验人表皮成纤维细胞对前胶原肽(胶原蛋白前体)生成的影响。该分析的终点是反映前胶原肽的存在和细胞活力的分光光度测量。测定采用定量夹心酶免疫测定技术，由此将对胶原蛋白肽特异的单克隆抗体预先包被在微板上。将标准品和样品移液到孔中，存在的任何前胶原肽被固定化的抗体结合。洗去所有未结合的物质后，向孔中添加对前胶原肽特异的酶联多克隆抗体。冲洗以去除所有未结合的抗体-酶试剂之后，添加底物溶液到孔中，颜色显现与最初步骤中结合的原胶原蛋白肽的量成比例。停止显色，并使用酶标仪测量450nm处的颜色强度。测定了桑果提取物使1型前胶原表达增加了27％，长茎葡萄蕨藻使1型前胶原表达增加了31％，紫球藻提取物使1型前胶原表达增加了53％。

为了产生样品和对照，在含10％胎牛血清(Mediatech)的标准DMEM生长培养基中，于37℃、10％CO₂中培养亚汇合的正常成人表皮成纤维细胞(Cascade Biologics)。用每种测试成分和对照处理细胞3天。孵育后，收集细胞培养基，并如上所述使用Takara(#MK101)的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)定量I型前胶原肽分泌量。

层粘连蛋白刺激试验：层粘连蛋白是真皮-表皮连接处(DEJ)(也称为基膜)的主要蛋白质。DEJ位于真皮和表皮之间，连结形成指状突起，称为表皮突。表皮细胞从真皮的血管中吸收其养分。表皮突增加了接触到这些血管和所需营养的表皮的表面积。DEJ提供两个组织隔室的黏附力，并控制皮肤的结构完整性。层粘连蛋白是位于DEJ中的结构糖蛋白。层粘连蛋白与纤连蛋白一起被认为是将细胞保持在一起的胶，两者均由真皮成纤维细胞分泌，以帮助促进表皮细胞与DEJ的细胞内和细胞间黏附。

层粘连蛋白的分泌通过对培养人成纤维细胞的细胞上清液中的层粘连蛋白进行定量来监测，所述培养人成纤维细胞用含或不含1.0％的测试成分最终浓度的培养基处理3天。孵育后，使用针对每种蛋白质的免疫荧光抗体在酶联免疫吸附测定(ELISA)中测量层粘连蛋白含量。测定了桑果提取物使层粘连蛋白表达增加了14％。

基质金属蛋白酶1的酶活性(MMP-1)分析：显示迷迭香叶提取物和桑果提取物抑制MMP-1的表达。MMP是胞外蛋白酶，凭借其广泛的底物特异性在许多正常和疾病状态中发挥作用。MMP-1底物包括IV型胶原蛋白。分子探针Enz/Chek明胶酶/胶原酶检测试剂盒(#E12055)用于检测MMP-1蛋白酶活性，该试剂盒利用荧光明胶底物，并通过纯化的MMP-1酶检测底物的溶蛋白性裂解。在底物的蛋白性裂解后，显示出亮绿色的荧光，并使用荧光酶标仪对其进行监测以测量酶活性。

在纯净的酶和底物存在或不存在的条件下孵育测试材料，以确定其蛋白酶抑制剂的能力。测定了迷迭香叶提取物和桑果提取物分别抑制MMP-1达98％和96％。

基质金属蛋白酶3和9酶活性(MMP-3；MMP-9)测定：显示迷迭香叶提取物、桑果提取物和长茎葡萄蕨藻提取物抑制MMP-3和/或MMP-9的表达。MMP是胞外蛋白酶，凭借其广泛的底物特异性在许多正常和疾病状态中发挥作用。MMP-3底物包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白；MMP9底物包括VII型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。使用BioMolInternational用于MMP3(AK-400)和MMP-9(AK-410)的比色药物发现试剂盒，以测定使用硫肽作为发色底物(Ac-PLG-[2-巯基-4-甲基戊酰基]-LG-OC2H5)5,6的MMP蛋白酶活性。MMP裂解位点的肽键由含硫多肽中的硫酯键替代。MMP对该键的水解产生了巯基，该巯基与DTNB[5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，埃尔曼试剂]反应形成2-硝基-5-硫代苯甲酸，这可通过在412nm(ε＝13600M^-1cm^-1在pH 6.0及7以上)处的吸光度进行检测。测定了迷迭香叶提取物抑制MMP-3达40％，桑果提取物抑制达29％。测定了迷迭香叶提取物抑制MMP-9达61％，桑果提取物抑制达84％，长茎葡萄蕨藻提取物抑制MMP-9的表达达24％。

脂氧合酶(LO)分析：已显示迷迭香叶提取物抑制脂氧合酶(LO)的表达。LO是非血红素的含铁双加氧酶，其催化分子氧加成到脂肪酸中。亚油酸酯和花生四烯酸酯是植物和动物中LO的主要底物。然后可以将花生四烯酸转化为羟基二十碳四烯酸(HETE)酸衍生物，随后将其转化为有效的炎症介质白三烯。通过测定脂氧合酶(5-LO、12-LO或15-LO)与花生四烯酸孵育产生的氢过氧化物，实现准确、方便的筛选脂氧合酶抑制剂的方法。比色法LO抑制剂筛选试剂盒(#760700，Cayman Chemical)用于测定迷迭香叶提取物抑制酶活性的能力。

可以将纯化的15-脂氧合酶和测试成分在测定缓冲液中混合，并在室温下摇晃孵育10分钟。孵育后，加入花生四烯酸以引发反应，并将混合物在室温下再孵育10分钟。加入比色底物以终止催化作用，并通过在490nm处读取荧光板评估颜色进展。与未经处理的对照相比，可以计算出脂氧甘酶活性的抑制百分数，以确定迷迭香叶提取物抑制纯化的酶的活性的能力。测定了迷迭香叶提取物抑制脂氧合酶的活性达54％。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)测定：迷迭香叶提取物抑制TNF-α的活性。TNF超家族的原型配体，TNF-α，是多效性细胞因子，在炎症中起着核心作用。其表达的增加与促炎活性上调有关。使用该生物测定分析迷迭香叶提取物对人类表皮角质细胞的TNF-α产生的效果。该分析的终点是反映TNF-α的存在和细胞活力的分光光度测量。该测定采用定量的三明治酶免疫分析技术，由此将对TNF-α特异的单克隆抗体预先涂覆在微孔板上。

将标准品和样品移入微孔板的孔中，并且存在的任何TNF-α都被固定的抗体结合。洗掉所有未结合的物质后，将对TNF-α特异的酶联多克隆抗体添加到孔中。洗涤以去除所有未结合的抗体-酶试剂之后，添加底物溶液到孔中，并使用酶标仪在450nm处进行检测，显色与初始步骤中结合的TNF-α的量成比例。可以终止显色并可以测量颜色的强度。在37℃、5％CO₂下在EPILIFE^TM标准生长培养基(Cascade Biologics)中培养的亚汇合正常成人角质形成细胞(Cascade Biologics)用佛波12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，10ng/ml，SigmaChemical，#P1585-1MG)和迷迭香叶提取物或无测试成分(用于阴性对照)处理6小时。显示PMA引起TNF-α分泌的急剧增加，并在处理后6小时达到峰值。孵育之后，收集细胞培养基，并使用来自R&D Systems(#DTA00C)的三明治酶联免疫吸附分析(ELISA)定量TNF-α的分泌量。迷迭香叶提取物抑制TNF-α的活性达85％。

弹性蛋白酶测定：来自Molecular Probes(美国俄勒冈州尤金)的弹性蛋白酶测定(试剂盒#E-12056)用作体外酶抑制测定，用于在迷迭香叶提取物和桑果提取物存在的情况下测量对弹性蛋白酶活性的抑制作用。EnzChek试剂盒包含用染料标记的可溶性牛颈韧带弹性蛋白，从而使结合物的荧光猝灭。非荧光的底物被弹性蛋白酶或其他蛋白酶消化以产生高度荧光的片段。使用荧光酶标仪监测得到的荧光增加。来自弹性蛋白底物的消化产物在约505nm处具有最大吸收，在约515nm处具有最大荧光发射。当使用EnzChek弹性蛋白酶检测试剂盒筛选弹性蛋白酶抑制剂时，该肽N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮用作弹性蛋白酶的选择性集体抑制剂，用于阳性对照。测定了迷迭香叶提取物和桑果提取物分别抑制弹性蛋白酶达54％和25％。

弹性蛋白刺激分析：在皮肤细胞(例如表皮角质形成细胞、成纤维细胞和/或真皮内皮细胞)上进行弹性蛋白刺激分析，以测定本说明书公开的活性成分、成分的组合或具有所述组合的组合物中任意一种增加弹性蛋白的表达的能力。弹性蛋白是结缔组织蛋白，其帮助皮肤在伸展或收缩后恢复形状。弹性蛋白也是在需要储存机械能的位置使用的重要承重蛋白。弹性蛋白是通过在赖氨酰氧化酶催化的反应中连接许多可溶性原弹性蛋白蛋白分子而制得的。通过直接ELISA夹心法使用针对弹性蛋白的免疫荧光抗体对培养的人成纤维细胞进行染色，来对培养的人成纤维细胞中的弹性蛋白分泌和弹性蛋白纤维进行监测。使用Meso Scale Discovery系统SECTOR 2400成像系统分析结果。由活性成分、成分的组合或具有所述成分的组合引起的弹性蛋白分泌和弹性蛋白纤维的变化通过在用针对弹性蛋白的抗体探测细胞或其裂解物之前，将培养的人成纤维细胞与活性成分一起孵育一段时间来测定。测定了长茎葡萄蕨藻提取物使弹性蛋白表达增加了38％。

纤连蛋白刺激测定：纤连蛋白是真皮-表皮连接处(DEJ)(也称为基膜)的主要蛋白质。DEJ位于真皮和表皮连结之间，连结形成指状突起，称为表皮突。表皮细胞从真皮的血管中吸收其养分。表皮突增加了接触到这些血管和所需营养的表皮的表面积。DEJ提供两个组织隔室的黏附力，并控制皮肤的结构完整性。纤连蛋白是位于DEJ中的结构糖蛋白。纤连蛋白与层粘连蛋白一起被认为是将细胞保持在一起的胶，两者均由真皮成纤维细胞分泌，以帮助促进表皮细胞与DEJ的细胞内和细胞间黏附。

纤连蛋白的分泌可通过定量培养人成纤维细胞的细胞上清液中的纤连蛋白来监测，所述培养人成纤维细胞用含或不含1.0％的最终测试成分浓度的培养基处理3天。孵育后，使用针对每种蛋白质的免疫荧光抗体在酶联免疫吸附测定(ELISA)中测量纤连蛋白含量。测定了桑果提取物使纤连蛋白表达增加了13％。

实施例4

(示例性制剂)

具有本文公开的成分的制剂被制备为局部皮肤用组合物。在一些情况下，局部皮肤用组合物可以制备为乳液、精华、凝胶、凝胶乳液或霜。表3中的制剂是作为精华制备的局部皮肤组合物的一个实施例。

表3^

^制剂可以通过在70℃至75℃加热下在烧杯中混合所述成分直到均匀来制备。然后，可以将所述制剂冷却到标准室温(20℃至25℃)。另外，如果希望的话，例如可以添加另外的成分来改变给皮肤提供益处的组合物或成分的流变特性。

*例如，可以添加赋形剂以改变组合物的流变性质。或者，水的量可以改变，只要组合物中水的量为至少40重量％，优选50重量％至80重量％。

实施例5

(附加分析)

分析可以通过本领域普通技术人员已知的方法进行确定，所述分析可以用于确定在本说明书全文和权利要求书中所公开的任意一种成分、或成分的任意组合、或具有所述成分的组合的组合物的功效。以下是可以在本发明的上下文中使用的非限制性分析。应认识到，可以使用其它测试过程，包括例如客观的和主观的过程。

赖氨酰氧化酶测试：可以在皮肤细胞(例如表皮角质形成细胞、成纤维细胞和/或真皮内皮细胞)上进行赖氨酰氧化酶测试，以测定本说明书公开的活性成分、成分的组合或具有所述组合的组合物中任意一种刺激皮肤中赖氨酰氧化酶表达的能力。赖氨酰氧化酶可以催化弹性蛋白和胶原蛋白的交联，从而为皮肤提供在结构上更坚固的基底。通过增加赖氨酰氧化酶的表达，会发生弹性蛋白和胶原蛋白的交联的增加，这可以有益于减少细纹、皱纹、皮肤松弛和/或无弹性皮肤的出现。

B16色素沉着分析：黑素生成是黑素细胞产生黑色素的过程，黑色素是一种天然产生的给予皮肤、毛发和眼睛颜色的色素。抑制黑色素生成对防止皮肤变黑和减轻与衰老相关的黑斑是有益的。该生物分析可以采用B16-F1黑素细胞(ATCC)，永生化的小鼠黑色素瘤细胞，以分析化合物对黑素生成的影响。该分析的终点可以是黑色素产生和细胞活力的分光光度测量。可以在37℃下10％的CO₂中,在含10％的胎牛血清(Mediatech)的标准DMEM生长培养基中培养B16-F1黑素细胞，然后用本说明书中所公开的活性成分、成分的组合或具有所述组合的组合物中的任意一种处理6天。孵育之后，通过在405nm处的吸收测量黑色素分泌，定量细胞活力。

ORAC分析：还可以通过测量这种成分或组合物的抗氧化活性来分析本说明书公开的活性成分、成分的组合或具有所述组合的组合物中任意一种的氧自由基吸收(或吸收率)能力(ORAC)。抗氧化活性说明减少氧化试剂(氧化剂)的能力。该分析定量抑制氧化剂，例如已知对细胞(例如皮肤细胞)造成损害的氧自由基的作用的程度及所需时长。可通过本领域普通技术人员已知的方法(参见美国专利公布第2004/0109905号和第2005/0163880号，以及可商购获得的试剂盒例如Zen-Bio ORAC抗氧化分析试剂盒(#AOX-2))来确定本说明书公开的活性成分、成分组合或具有所述组合的组合物中任意一种的ORAC值。Zen-Bio ORAC抗氧化分析试剂盒测定了由于AAPH(2,2'-偶氮双-2-甲基丙脒二盐酸盐)分解获得的过氧自由基的形成，荧光素荧光随时间的损失。Trolox(水溶性维生素E类似物)以剂量依赖的方式作为抑制荧光素衰变的阳性对照。

透明质酸的产生：可测定由于本说明书中所公开的活性成分、任意一种的成分组合或具有所述组合的组合物中每一种而导致的人真皮成纤维细胞中透明质酸(HA)产生的变化。HA是涉及基质结构的稳定性的多糖，其还涉及向组织和细胞提供膨压。作为一个非限制性实例，可以使用来自R&D Systems(DY3614)的Hyaluronan DuoSet ELISA试剂盒确定在经处理和未经处理的成人真皮成纤维(HDFa)细胞中的HA的产生。在该分析中，对于试样的产生，在处理之前，在37℃和10％CO₂下在饥饿培养基中(在Dulbecco改良Eagle培养基中的0.15％牛胎儿血清和1％青霉素链霉素溶液)孵育来自Cascade Biologics的亚融合的HDFa细胞(C-13-5C)72小时。然后用含有测试化合物、阳性对照(来自Sigma-Aldrich(P1585)的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯和衍生自来自Sigma-Aldrich(P3201)的生长因子的血小板)或无添加对照的新鲜饥饿培养基培养该细胞24小时。然后收集培养基并在-80℃下冷冻直至在ELISA测试中使用。

简而言之，该ELISA分析采用定量的夹心酶免疫测定技术，因此对HA特异的捕获抗体可以预先涂覆在微孔板上。将标准品、来自经处理和未经处理的细胞的培养基移液至微孔板中，以使存在的任意HA被固定化抗体结合。洗去所有未结合的物质后，向孔中添加对HA特异的酶联检测抗体。冲洗以去除所有未结合的抗体-酶试剂之后，向孔中添加底物溶液，使得颜色能够与最初步骤中结合的HA的量成比例的显现。在特定的时间终止颜色显现，可以使用酶标仪在450nm处测量颜色的强度。

闭合蛋白的产生：可测定由于本说明书中所公开的活性成分、任意一种成分的组合的或具有所述组合的组合物中的每一种而导致的在角质形成细胞中闭合蛋白产生的变化。闭合蛋白是对于紧密连结的形成和皮肤水分屏障功能重要的蛋白质。如何确定经处理和未经处理的角质形成细胞中的闭合蛋白产生的非限制性实例是通过使用生物测定法，该生物测定法分析了角质形成细胞裂解物中的闭合蛋白浓度。通过使用Simon^TM蛋白质免疫印迹法进行该生物分析。对于样品，在37℃和5％的CO₂下，将来自Life Technologies(C-005-5C)的成人表皮角质形成细胞(HEKa)在来自Life Technologies(M-EP-500-CA)的含有钙并补充有来自Life Technologies(S-101-5)的角质细胞生长补充剂(HKGS)的生长培养基中生长24小时。然后在用于阴性对照的含有测试化合物/提取物、无化合物/提取物的生长培养基、或用于阳性对照的含有1mM的CaCl₂的生长培养基中孵育HEKa 24小时至48小时。然后，洗涤HEKa细胞，收集并储存在冰上或更冷的地方，直到使用裂解缓冲液在冰上裂解并进行超声处理。可以测定样品的蛋白质浓度并用于使样品归一化。将裂解物存储在-80℃下直至用于生物测定。

Simon^TM蛋白质免疫印迹法生物分析使用定量的蛋白质免疫印迹法分析技术，该技术使用了对闭合蛋白特异的抗体来定量检测样品中的闭合蛋白。将细胞样品裂解并对蛋白质浓度进行归一化。然后加载归一化的样品和分子量标准品，并使用毛细管电泳在变性的蛋白质分离凝胶上运行。然后固定凝胶中的蛋白质并使用对闭合蛋白特异性的第一抗体进行免疫检测。用结合第一抗体的酶联检测抗体对固定的蛋白质进行免疫检测。然后，将化学发光底物溶液加入到固定的蛋白质中，以使化学发光显影与固定化中结合的闭合蛋白的量成比例。可以在特定的时间终止化学发光显影，测量化学发光信号的强度，并与阳性对照和阴性对照进行比较。

角质形成细胞单层渗透性：可测定由于本说明书中所公开的活性成分、任意一种成分的组合或具有该组合的组合物中的每一种而导致的角质形成细胞单层的渗透性变化。角质形成细胞单层的渗透性是皮肤屏障的完整性的量度。作为非限制性实例，可以使用Millipore(ECM642)的体外血管渗透性分析测定在经处理和未经处理的角质形成细胞中的角质形成细胞单层渗透性。该分析分析了内皮细胞吸附、输送和渗透。简略来说，来自LifeTechnologies的成人表皮角质形成细胞(C-005-5C)可被接种到在收集孔内的多孔胶原蛋白涂覆的膜上。-在37℃下和5％的CO₂中，角质形成细胞在来自Life Technologies的Epilife生长培养基(M-EP-500-CA)中培养24小时，Epilife生长培养基含有钙，并补充以来自Life Technologies(S-101-5)的Keratinocyte Growth Supplement(HKGS)。孵育时间使得细胞形成单层并封闭膜孔。然后将培养基替换成含有(测试样品)或不含有(未处理对照)测试化合物/提取物新鲜的培养基，并在37℃下和5％的CO₂中将角质形成细胞孵育另外48小时。在存在/不存在测试化合物/提取物的孵育之后，为了确定角质形成细胞单层的渗透性，培养基被替换成含有高分子量异硫氰酸荧光素(FITC)-Dextran的新鲜的培养基，并在37℃和5％的CO₂下将角质形成细胞孵育另外4小时。在4小时的孵育期间，FITC可以以与单层膜的渗透性成比例的速率穿过该角质形成细胞单层和多孔膜进入收集孔。在4小时的孵育后，可测定细胞活力和收集孔中FITC的含量。对于FITC含量，收集孔中的培养基被收集，并且在520nm处激发时在480nm(Em)处测定培养基的荧光。与未经处理的对照相比，渗透率百分比和变化百分比可以通过以下等式确定：渗透率百分比＝((测试样品的Ex/Em平均值)/未经处理的对照的Ex/Em平均值)×100；变化百分比＝测试样品的渗透率百分比-未经处理的对照的渗透率百分比。

蘑菇酪氨酸酶活性分析：在哺乳动物细胞中，酪氨酸酶在来自酪氨酸(和来自多巴色素聚合)的黑色素的多步生物合成中催化两个步骤。酪氨酸酶位于黑素细胞中，并产生给予皮肤、毛发和眼睛颜色的黑色素(芳香醌化合物)。在存在或不存在本说明书公开的活性成分、任意一种成分的组合或具有所述组合的组合物的每一种的情况下，纯化的蘑菇酪氨酸酶(Sigma)可以与其底物L-Dopa(Fisher)一起孵育。可以在490nm处通过比色板读数来评估色素形成。计算蘑菇酪氨酸酶活性的抑制百分比并将其与未处理的对照物进行比较，以确定测试成分或其组合抑制纯化酶活性的能力。测试提取物的抑制与曲酸(Sigma)的进行比较。

环氧合酶(COX)分析：体外环氧合酶-1和环氧合酶-2(COX-1、COX-2)抑制分析。COX是展现环氧合酶活性和过氧化物酶活性的双功能酶。环氧合酶活性将花生四烯酸转化为过氧化氢内过氧化物(前列腺素G2；PGG2)，过氧化物酶组分将内过氧化物(前列腺素H2；PGH2)还原为相应的醇，前列腺素、血栓素和环前列腺素的前体。该COX抑制剂筛选分析测量环氧合酶的过氧化物酶组分。过氧化物酶活性通过监测氧化的N,N,N',N'-四甲基-对苯二胺(TMPD)的出现比色地进行分析。该抑制筛选分析包含COX-1和COX-2酶两者，以筛选同工酶特异性抑制剂。比色的COX(绵羊)抑制剂筛选分析(#760111，Cayman Chemical)可以用于分析说明书中所公开的活性成分、任意一种成分的组合、或具有所述组合的组合物的每一种对纯化的环氧合酶(COX-1或COX-2)活性的影响。根据制造商的指示，纯化的酶、血红素和测试提取物可以在分析缓冲液中混合，并在室温下伴随摇动孵育15分钟。孵育之后，可以加入花生四烯酸和比色底物以开始反应。可以通过在590nm读取的比色板来评估颜色进展。COX-1或COX-2活性的抑制百分比可以通过与未处理的对照物比较来计算，以测定测试提取物抑制纯化酶活性的能力。

控油分析：用于测量皮脂腺中皮脂分泌的减少和/或皮脂腺中皮脂产生的减少的分析可以通过使用本领域普通技术人员已知的标准技术进行分析。在一种情况中，可以使用前额。可以将本说明书中所公开的活性成分、任一种成分的组合或具有所述组合的组合物中的每一种，每天一次或两次施用到前额的一部分设定天数(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或多于14天)，而前额的其他部分不用所述组合物处理。在设定天数期满后，皮脂分泌可以通过将细吸油纸施用到处理过的和未处理的前额皮肤上进行分析。这是通过首先用湿的和干的布从处理过的和未处理的区域去除所有皮脂完成的。然后可以将吸油纸施用到处理过的和未处理的前额区域，并且可以围绕前额放置橡皮筋以轻轻地将吸油纸压到皮肤上。2小时后，可以移去吸油纸，使其干燥，然后进行透照。颜色越深的吸油纸对应于越多的皮脂分泌(或颜色较浅的吸油纸对应于减少的皮脂分泌)。

红斑分析：测量皮肤发红减少的分析可以使用Minolta Chromometer进行评估。皮肤红斑可以通过在对象的前臂施用0.2％的十二烷基硫酸钠溶液来诱发。该区域用封闭的贴片保护24小时。24小时后，除去贴片，可以使用Minolta Chroma Meter的a^*值对刺激引发的发红进行评估。a^*值测量肤色在红色区域的变化。在读取后，立即用说明书中公开的活性成分、任意一种成分的组合、或具有所述组合的组合物中的每一种来处理该区域。可以定期进行重复测量以确定制剂减少发红和刺激的能力。

皮肤水分/水合分析：皮肤水分/水合的益处可以通过利用以Nova Dermal PhaseMeter进行的阻抗测量进行测量。阻抗计测量皮肤水分含量的变化。皮肤外层具有不同的电性质。当皮肤干燥时，其导电性很差。当其变得较为滋润时，产生增加的导电性。因此，皮肤阻抗(与导电性有关)的变化可以用于评价皮肤水合的变化。该仪器可以根据仪器说明对每个测试日进行校准。还可以对温度和相对湿度进行标记。对对象可以进行如下评估：测量前使样品可以在确定湿度(例如30％至50％)和温度(例如68℃至72℃)的室内进行平衡。在脸的每一侧获取三个单独阻抗读数，并对其进行记录并取平均分。阻抗计可以使用T5设定，其对施用到脸上每五秒的阻抗值取平均分。变化可以以统计学方差和显著性进行报告。根据该方法可以分析本说明书中公开的活性成分、任一种成分的组合或含有所述组合的组合物的每一种。

皮肤清晰度和雀斑与老年斑减少的分析：使用Minolta Chromometer评估皮肤清晰度和雀斑与老年斑的减少。可以使用Minolta Chroma Meter的a*值评估肤色变化，以确定由于产品处理引起刺激的可能性。a^*值测量肤色在红色区域的变化。这用于确定本说明书中公开的活性成分、任意一种成分组合或含有所述组合的组合物中的每一种是否诱导刺激。测量可以在脸的每一侧进行并取平均值，作为左边脸和右边脸的值。皮肤清晰度也可以使用Minolta Meter进行测量。测量是Minolta Meter的a*、b和L值的组合，并与皮肤的亮度有关，而且很好地对应皮肤的光滑度和水合。皮肤测定如上进行。在一个非限制性方面，皮肤清晰度可以描述为L/C，其中C是色度并定义为(a²+b²)^1/2。

皮肤干燥、表面细纹、皮肤光滑度和肤色分析：皮肤干燥、表面细纹、皮肤光滑度和肤色可以用临床评分技术进行评估。例如，皮肤干燥的临床评分可以通过五点标准Kligmanscale进行确定：(0)皮肤是柔软和湿润的；(1)皮肤呈现正常而没有可见的干燥；(2)皮肤触摸感觉轻微干燥而没有可见的剥落；(3)皮肤感觉干燥、粗糙并且具有有些鳞屑的发白的外观；以及(4)皮肤感觉非常干燥、粗糙并且具有有鳞屑的发白的外观。评估可以由两个临床医师独立进行并取平均分。

肤色临床评分分析：肤色的临床评分可以通过十点模拟数值量度来实施：(10)平滑均匀的皮肤、粉红棕的颜色。手持放大镜检查时没有暗的、发红的或有脱皮的斑块。皮肤的细微纹理摸上去非常均匀；(7)不用放大镜观察均匀的肤色。没有脱皮区域，但是有由于色素淀积或红斑引起的轻微变色。没有直径大于1cm的变色；(4)轻易地注意到皮肤变色和不均匀的纹理。少量脱皮。皮肤的某些区域摸上去粗糙；以及(1)不均匀的皮肤着色和纹理。多个区域的脱皮和变色，色素减退型、发红的或黑色的斑点。大面积的直径超过1cm的不均匀着色。评估由两个临床医师独立进行并取平均分。

皮肤平滑度的临床评分分析：皮肤光滑度的临床评分可以通过一个十点模拟数值量度进行分析：(10)光滑的，皮肤是湿润的和光亮的，手指划过表面时没有阻力；(7)一定程度光滑的，微小的阻力；(4)粗糙的、可见地改变的，摩擦时有摩擦力；和(1)粗糙的、片状的、不均匀的表面。评估由两个临床医师独立进行并取平均分。

用Packman等人(1978)公开的方法进行的皮肤平滑度和皱纹减少的分析：皮肤平滑度和皱纹的减少也可以通过使用Packman等人(1978)公开的方法进行可视化评估。例如，每个对象就诊时，对每个对象的外表面线(SFL)的深度、浅度和总数量都可以进行认真的评分和记录。通过将数量因子乘以深度/宽度/长度因子得到数字的分数。获得眼睛区域和嘴巴区域(左侧和右侧)的分数，加到一起作为总的皱纹分数。

用复制品进行的纹路和皱纹的显现分析：皮肤上纹路和皱纹的显现可以使用复制品进行评估，所述复制品是皮肤表面的印模。可以使用如硅橡胶的材料。复制品可以通过图像分析进行分析。纹路和皱纹可见性的变化可以通过利用硅复制品形成对象的脸并用计算机图像分析系统分析复制品图像进行客观地定量。复制品可以从眼睛区域和颈部区域获得，并用数码相机以低照明入射角进行拍摄。数字图像可以用图像处理程序进行分析并确定复制品被皱纹和细纹覆盖的区域。

用Hargens Ballistometer进行的皮肤紧致度分析：皮肤紧致度可以用HargensBallistometer来测量，其是通过使小物体落在皮肤上并记录前两个反弹峰来评估皮肤弹性和紧致度的装置。Ballistometry是使用相对钝的尖端(4平方毫米-接触面积)的小的轻量探针。探针轻轻地穿透进入皮肤，获得取决于皮肤外层性质的测量值，所述皮肤外层包括角质层和外表皮以及部分真皮层。

用Gas Bearing Electrodynamometer进行的皮肤柔软度/柔韧性分析：皮肤柔软度/柔韧性可以使用Gas Bearing Electrodynamometer进行评估，其为测量皮肤应力/应变性质的仪器。皮肤的黏弹性与皮肤保湿有关。可以通过用双面胶将探针黏附在皮肤表面实现对脸颊区域预设位点的测量。大约3.5gm的力平可以行施加于皮肤表面，精确地测量皮肤的位移。然后可以计算皮肤的柔韧性，并以DSR(动态弹簧刚度，以gm/mm计)表示。

用表面光度仪/记录针进行的皮肤表面轮廓分析：皮肤表面轮廓可以通过使用表面光度仪/记录针的方法进行测量。这包括穿过复制品表面闪光或拖动记录针穿过复制品表面。记录针的垂直位移通过距离传感器可以录入计算机，在扫描复制品的一定距离后，皮肤轮廓的截面分析可以以二维曲面产生。该扫描可以沿着固定的轴重复任意次数以产生模拟的皮肤3-D图像。使用记录针技术可以获得十个随机的复制品截面，并组合产生平均值。感兴趣的值包括Ra，其为通过积分相对于平均轮廓高度的轮廓高度计算得到的所有粗糙度(高度)值的算术平均数。Rt，其为最高峰和最低谷之间的最大垂直距离，以及Rz，其为平均峰振幅减去平均峰高度。数值以用mm为单位标定的数值给出。设备应在每次使用前通过扫描已知数值的金属标准品进行归一化。Ra值可以通过下式计算：R_a＝归一化粗糙度；l_m＝横向(扫描)长度；以及y＝轮廓位置相对于平均轮廓高度(x轴)的绝对值。

MELANODERM^TM分析：在其它非限制性方面，可以通过使用皮肤类似物例如MELANODERMTM来评价说明书中公开的活性成分、任意一种成分的组合或具有所述组合的组合物中每一种的功效。黑素细胞，皮肤类似物中细胞的一种，当暴露于L-二羟苯基丙氨酸(L-DOPA)(黑色素的前体)时被明显地着色。皮肤类似物MELANODERM^TM可以如下处理：用包含说明书中公开的活性成分、任意一种成分的组合或具有所述组合的组合物中的每一种的各种基质来处理，或仅用基质来处理作为对照。或者，未处理的皮肤类似物样品可以用作对照物。

丝聚合蛋白的产生：可测定在角质形成细胞中由于本说明书中所公开的活性成分、任意一种成分组合或具有所述组合的组合物中每一种的丝聚合蛋白产生的变化。丝聚合蛋白是皮肤中天然保湿因子(NMF)的前体。增加的NMF提高了皮肤中的水分含量。使用分析角质形成细胞裂解物中的丝聚合蛋白浓度的生物测试来测定在经处理和未经处理的角质形成细胞中的丝聚合蛋白的产生。可用于量化丝聚合蛋白产生的生物分析的非限制性实例为Simon^TM蛋白质免疫印迹法。对于每个样品，使正常人表皮角质形成细胞(NHEK)在来自Life Technologies(M-EP-500-CA)的含钙的EPI-200–Mattek生长培养基中生长。在处理之前，在37℃下5％的CO₂中，使NHEK在生长培养基中孵育过夜。然后将NHEK在含有1％测试化合物/提取物的生长培养基或不含化合物/提取物(阴性对照)的生长培养基中孵育24小时至36小时。然后可将NHEK清洗、收集并于冰或更冷的物体上储存直至用裂解缓冲液和超声在冰上裂解。可确定样品的蛋白质浓度并用于使样品归一化。裂解物可在-80℃下存储直至在定量分析中使用。

Simon^TM蛋白质免疫印迹法生物分析使用定量的免疫印迹免疫分析技术，该技术使用了对丝聚合蛋白特异性的抗体来定量检测样品中的丝聚合蛋白。将细胞样品裂解并对蛋白质浓度进行归一化。然后可以加载归一化的样品和分子量标准品，并使用毛细管电泳在变性的蛋白质分离凝胶上运行。将凝胶中的蛋白质固定并使用对聚丝蛋白特异的初代抗体进行免疫杂交。然后可将固定的蛋白质和与初代抗体结合的酶联检测抗体免疫杂交。然后可向固定的蛋白质中添加化学发光底物溶液以使化学发光显色与在固定化中结合的丝聚合蛋白的量成比例。在特定的时间终止化学发光显色，可测定化学发光信号的强度并与阳性对照和阴性对照比对。

透明质酸酶活性的抑制：可测定由于本说明书中所公开的活性成分、任意一种成分的组合或具有该组合的组合物的每一种而导致的透明质酸酶活性的变化。透明质酸酶是分解HA的酶。HA是与基质结构的稳定性有关的多糖，并且与向组织和细胞提供膨压有关。作为非限制性实例，可以使用由Sigma-Aldrich方案#EC 3.2.1.35改良的体外方案测定透明质酸活性。简略来说，向含有测试化合物或对照的微孔板反应孔中添加来自Sigma-Aldrich的1-S型透明质酸(H3506)。可使用鞣酸作为阳性对照抑制剂，对照的酶不添加测试化合物，含有测试化合物或阳性对照但不含透明质酸酶的孔可以用作背景阴性对照。在添加底物(HA)之前，孔在37℃下孵育10分钟。添加底物，反应在37℃下孵育45分钟。然后，将每个反应溶液的一部分转移在乙酸钠和pH为3.75的乙酸的溶液中并轻轻混合，以终止该部分反应(终止孔)。在将一部分反应溶液加入到终止孔中之后，终止孔和反应孔应该都含有相同体积的溶液。反应孔和终止孔均在室温下孵育10分钟。然后测量反应孔和终止孔在600nm处的吸光度。抑制率可以使用以下公式来计算：抑制剂(或对照)活性＝(在600nm处的抑制剂停止的孔吸光度-在600nm处的抑制剂反应孔吸光度)；初始活性＝在600nm处的对照酶吸光度；抑制百分数＝[(初始活性/抑制剂活性)×100]-100。

过氧化物酶体增殖剂-激活受体γ(PPAR-γ)的活性：可测定由于本说明书中所公开的活性成分、成分组合的任一种或具有该组合的组合物的的每一种而导致的PPAR-γ活性变化。PPAR-γ是对皮脂产生来说重要的受体。作为非限制性实例，使用分析测试化合物或组合物抑制配体结合的能力的生物测试来测定PPAR-γ的活性。简略来说，使用购自LifeTechnologies的荧光小分子Pan-PPAR配体FLUORMONE^TM Pan-PPAR Green(PV4894)来确定测试的化合物或组合物是否能够抑制配体结合至PPAR-γ。样品孔包括PPAR-γ和荧光配体，以及测试化合物或组合物(测试)；参考抑制剂；罗格列酮(阳性对照)；或者无测试化合物(阴性对照)。孔被孵育设定的一段时间以使得配体有机会与PPAR-γ结合。然后可测量每个样品孔的荧光偏振，并与阴性对照孔比对以确定测试化合物或组合物的抑制百分比。

细胞因子阵列：人表皮角质形成细胞被培养至70％至80％的融合度。吸出平板中的培养基并添加0.025％胰蛋白酶/EDTA。当细胞变圆时，轻轻地敲打培养皿以释放细胞。包含胰蛋白酶/EDTA的细胞被从培养皿移出，并被平衡。将细胞在180xg下离心5分钟以形成细胞团粒。吸出上清液。在EPILIFE^TM培养基(Cascade Biologics)中再悬浮获得的球状物。在约10％至20％的融合度时将细胞接种至6孔板。在细胞变为约80％融合度之后吸出培养基，添加1.0ml的EpiLife^TM、佛波醇13-豆蔻酸12-乙酸酯(“PMA”)(已知的炎症诱导剂)和测试的组合物稀释物至两个重复的孔中(即1.0％(100X储备中的100μl)和0.1％(100X储备中的10μl)的测试组合物稀释为最终体积为1ml的EpiLife生长培养基)。轻轻地旋转培养基以确保充分混合。另外，在存在或不存在额外的PMA的情况下，向对照孔中添加1.0ml的EPILIFE^TM。然后，在定量给料之后，将板在37±1℃和5.0±1％CO₂中孵育约5小时。孵育5小时后，将所有培养基收集在圆锥管中并在-70℃下冷冻。

为了分析，将16-垫杂交腔室连接到16-垫FAST载玻片上，该载玻片一式三份，具有16种抗细胞因子抗体和实验对照(Whatman BioSciences)，并将载玻片置于FASTFrame(每帧4个载玻片)中进行处理。在室温下使用70mlS&S蛋白质阵列阻断缓冲剂(WhatmanSchleicher and Scheull)将阵列阻断15分钟。去除封闭缓冲液，并向每个阵列添加70ml各自的上清液试样。在轻微振动下，阵列在室温下培养3小时。用TBS-T洗涤阵列3次。用70ml抗体混合物处理阵列，所述抗体含有对应于每个阵列捕捉抗体的生物素化的抗体。在轻微振动下，阵列在室温下培养1小时。使用TBS-T将阵列清洗3次。在轻微振动下，在室温下使用70ml含有链霉亲和素-Cy5轭合物的溶液培养1小时。使用TBS-T将阵列清洗3次，在去离子水中快速冲洗并干燥。

载玻片可以在Perkin-Elmer ScanArray 4000共聚焦成像系统中成像。可以保存阵列图像，并用Imaging Research ArrayVision软件分析。简言之，通过去除背景信号确定斑点强度。可以对来自每个样品条件的重复斑点进行平均，然后和适当的对照比对。

内皮细胞管形成：内皮细胞管的形成和血管生成及毛细血管形成有关。毛细血管形成和血管形成可以导致皮肤发红和红斑痤疮。在存在或不存在测试提取物和化合物的情况下，在细胞培养系统中，使用具有预成型的初代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的毛细管破坏测试可以确定内皮细胞形成管的能力。

简略来说，将HUVEC在细胞外基质进行体外培养，其刺激连接物和内皮细胞的管状形态生成以形成毛细管状的内腔结构。这些体外形成的毛细血管在许多方面与人血管毛细血管相似。毛细管测试是基于该现象的，并用于评价潜在的脉管系统靶向试剂。

在5％CO₂、37℃下，HUVEC培养物在细胞恒温箱中生长。用于HUVEC的完整生长基为内皮管细胞基础培养基(EBM)，其补充有2％的牛胎儿血清(FBS)、12μg/ml的牛脑提取物、1μg/ml的皮质醇和1μg/ml的GA-1000(庆大霉素-两性霉素B)。在第3代至第8代之间的HUVEC培养物可以用于所有的分析测试。

用荧光试剂Calcein AM预标记HUVEC，并将其接种于使用其完全生长培养基的细胞外基质涂覆的96孔培养板中。在形态发生过程后约四小时，形成内皮毛细管。然后，作为处理条件，对形成的毛细管培养物施用50μl体积的设定剂量的测试试剂。可以向未处理对照组加入测试试剂的载剂。索坦(Sutent)是FDA认证的抗血管生成药物，可以包括其一个浓度作为测定性能的对照。在处理后约六小时，通过显微镜检查每个孔中的内皮小管形态、使其成像，可以定量分析处理条件下的毛细管破坏活性。每个测试条件可以在两个孔中进行，包括对照。

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本文所公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以根据本公开可以不需要过度实验即可做出和实施。尽管本发明的组合物和方法已经按照优选的实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所述组合物和/或方法以及在本文所描述方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不脱离本发明的构思、精神和范围。更具体地，明显地，化学和生理两方面都相关的特定试剂可以替代本文所描述的试剂，同时会实现相同或相似的结果。所有对本领域技术人员明显的这类相似的替代和改变都被视为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

以下参考文献在一定程度上提供示例性程序或对本文所陈述细节的其他补充细节，它们通过引用明确地并入本文。

Cosmetic Ingredient Dictionary，第三版，CTFA，1982。

International Cosmetic Ingredient Dictionary,第四版,CTFA,1991

International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook,第十版,CTFA,2004

International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook,第十二版,CTFA,2008