阅读说明：本技术 青光眼的新疗法 (Novel treatment for glaucoma ) 是由 陈璐 施萌 于 2020-01-29 设计创作，主要内容包括：通过向有其需要的眼睛局部给予Wnt5a受体抑制剂的制剂来治疗青光眼或致病性眼内压。(Glaucoma or pathogenic intraocular pressure is treated by topically administering to an eye in need thereof a formulation of a Wnt5a receptor inhibitor.)

具体实施方式

的描述

本文描述的实例和实施方案是出于说明性目的的，并且基于其的各种修改或改变对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并将被包括在本发明中。本领域技术人员将认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相似的结果。本发明可以排除本文未公开或要求的任何化合物、组分、要素或步骤，或在本文未公开或要求的任何化合物、组分、要素或步骤不存在的情况下实施。除非有相反指示或另外说明，否则在这些描述和整个说明书中，术语“一(a)”和“一(an)”表示一或多。出于所有目的将本文引用的所有出版物、专利和专利申请，包括其中的引文通过引用整体特此并入。

公开的Wnt5a受体/效应物抑制方法可以是基因操纵和/或给予小干扰RNA(siRNA)、抗体、小分子等，其中许多可从诸如Applied Biological Materials Inc.(ABM,Richmond BC)、Life Technologies(ThermoFisher Scientific)、Sigma-Aldrich等来源商购获得。该方法可单独使用以降低眼内压和预防或治疗青光眼，和/或与其他治疗方法，如滴眼剂、药物、激光、植入装置和手术等组合使用，以预防或治疗青光眼。

典型实施例

Wnt5a确定和靶向

我们在WO2019/040311中公开了Wnt5a的确定和靶向。

Wnt5a在培养物中的人原代SC细胞上表达和在小鼠SC上体内表达。如通过定量实时PCR分析所分析的，Wnt5a表达随剪切应力变化而受到调节。我们还证明了Wnt5a特异性siRNA可以下调人SC细胞中的Wnt5a表达，这也影响SC细胞功能。与对照同窝小鼠相比，在青光眼模型中诱导的SC特异性Wnt5a基因条件性敲除小鼠IOP升高显著降低。在敲除小鼠和对照同窝小鼠之间未发现基线IOP的显著差异。与在研究的所有时间点均具有IOP升高的对照同窝小鼠相比，Wnt5a敲除小鼠仅在早期(24小时内)显示出IOP升高，而在后来的时间点没有显示IOP升高，表明Wnt5a干预下IOP升高是不可持续的。我们还证明了wnt5a干预有效保护视网膜神经纤维层并增加SC渗透性，这是增强通过常规流出系统的房水运动来管理眼内高压的靶标(例如Tam等人,Scientific Reports 7:40717,DOI:10.1038/srep40717)。这些实验表明，Wnt5a是用于青光眼管理的有效治疗靶标。使用Huang等人的方法(NatureCommunications,2017；8(1)DOI:10.1038/s41467-017-00140-3)，通过CRISPR基因编辑对Wnt5a的选择性抑制进一步证明了这些结果。

接下来，我们开发了实验方案来证明Wnt5a siRNA抑制剂治疗降低IOP的功效。对于这些方案，可商业获得Wnt5a特异性siRNA(人WNT5A siRNA,Life Technologies；Anastas等人，J.Clin.Investig.2014,124,2877-2890)。在一个方案中，如Yuen等人(2014,InvestOphthalmol Vis Sci.2014；55:3320-3327)所述进行siRNA的结膜下注射。随机选择小鼠接受5uL(0.2lg/uL)siRNA或对照的结膜下注射，每周两次，持续2周。在第二个方案中，如Tam等人(2017,Scientific Reports 7,40717)所述进行siRNA的前房内注射。通过腹膜内注射麻醉小鼠，并扩大瞳孔。首先使用牵引的钝头微玻璃针刺穿角膜，以抽出房水。穿刺后，立即将连接到10μl注射器的牵引的钝头微玻璃针通过穿孔插入，并将1.5μl含有1μg siRNA的PBS给予到前房中。对侧眼睛接受1.5μl包含相同浓度的乱序siRNA的相同注射。这些实验证明，通过结膜下注射或前房内注射局部递送的Wnt5a特异性抑制剂siRNA是用于致病性IOP的有效疗法。

为了评估通过滴眼剂递送的siRNA对IOP的作用，我们基于Martinez等人的方法(Mol Ther.2014Jan；22(l):81-91)开发了另外的方案，其中新西兰白兔在连续4天的期间内接受局部给予20nmol/天的siRNA或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。与溶媒处理组相比，处理的眼睛显示显著的IOP降低。第一次给予后2天可检测到siRNA对IOP的作用，直到最后一次给予后约2天，其值仍在基础水平以下。我们还调整了新西兰白兔的口服水过载模型，以评价Wnt5a siRNA在例如青光眼中观察到的病理状态下降低IOP的作用。最初给予四个不同剂量的siRNA(10nmol、20nmol、40nmol和60nmol/眼/天)，共三次：诱发高压前48、24和2小时。所有处理均在双眼中实施，并在诱发高压之前以及口服过载后每20分钟至最长120分钟测量IOP。结果分析表明，在所有测试剂量下，Wnt5a siRNA均提供显著的对抗IOP升高的保护。

为了证实Wnt5a siRNA对IOP的功效和特异性，在连续4天的期间内，以40nmol/眼/天的剂量处理更大一组动物；在第四天，通过水负载诱导眼内高压。对照结果证明，在用PBS处理的动物中，在诱发高压后的第一小时期间，水负载导致IOP升高。通过比较每个时间点的IOP值进行的分析表明，与PBS处理的动物相比，用siRNA处理在第一小时内显著降低了ΔΙΟΡ值。由于使用乱序siRNA的处理对IOP没有作用，所以该作用具有特异性。

我们接下来开发了实验方案以证明Wnt5a特异性抗体抑制剂治疗降低IOP的功效。这些方案使用两种不同的抗体：在兔纯化的免疫球蛋白缓冲水溶液中产生的抗人WNT5A抗体(Sigma-Aldrich SAB 1411396)和在小鼠克隆6F2腹水中产生的抗人WNT5A单克隆抗体(Sigma-Aldrich SAB5300183)，但也可以使用其他Wnt5a抗体，例如Hanaki等人,MolCancer Ther 11(2)Feb 2012；He等人，Oncogene.2005,24(18):3054-3058。这些实验使用小鼠和兔模型(同上)证明通过滴眼剂局部递送的Wnt5a特异性抗体抑制剂是用于致病性IOP的有效疗法。

在示例性模型系统中，在野生型正常小鼠的右眼(OD)中诱导眼内高压，并给予Wnt5a中和抗体以评估其对IOP和青光眼的其他参数的治疗作用，所述青光眼的其他参数包括角膜水肿、视网膜神经节细胞(RGC)死亡和RNFL变薄。与在小鼠右眼中IOP显著升高的对照组相比，在Wnt5a抗体处理的眼睛中，IOP显著更低并保持在基线水平。如通过OCT在体内由中央角膜厚度所测量的，Wnt5a干预减少了角膜水肿。在IOP升高之后，在对照组中观察到角膜厚度增加，但在Wnt5a抗体处理的眼睛中未观察到。Wnt5a干预减少了处理的眼睛中的RGC死亡以及RNFL变薄。这些分别通过免疫染色和OCT检测。这些结果证实，在青光眼小鼠模型中，局部Wnt5a抗体干预显著降低IOP并保护角膜和视网膜。

我们接下来设计实验方案以证明Wnt5a特异性拮抗剂肽和小分子抑制剂处理降低IOP的功效。这些方案采用了叔丁氧羰基修饰的Wnt5a衍生的六肽(Box5)，其充当Wnt5a的强效拮抗剂(Jenei等人,PNAS USA,106(46),19473-8)，和6,7-二氢-10α-羟基根赤壳菌素，其为一种强效WNT-5A表达抑制剂，具有相对低的毒性和优异的稳定性(Shinonaga等人，Bioorg Med Chem.2009Jul l；17(13):4622-35)。这些实验再次使用小鼠和兔模型两者(同上)证明，由滴眼剂局部递送的Wnt5a特异性修饰的肽抑制剂和Wnt5a表达的小分子抑制剂是用于致病性IOP的有效疗法。

下游效应物确定和靶向

我们接下来证明了FZD5(卷曲蛋白-5)、FZD2和ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)在SC上表达，其表达响应于剪切应力变化、Wnt5a刺激或干预而受到调节。此外，其调节可以调节SC功能，例如管形成。特别地，在压力(或增加的剪切应力)下培养的SC细胞中，我们观察到Wnt5a和Fzd5、Fzd2、RoR1的增加，当Wnt5a下调时，Fzd5、Fzd2和ROR1也下调，并且当我们用Wnt5a刺激人SC细胞时，Fzd5、Fzd2和ROR1相应增加。参见图1。

此外，我们证明了钙信号传导参与SC功能，并且几种相关分子，例如PLCB1(磷脂酶C，β1)、PPP3R1(蛋白磷酸酶3调节亚基B，α)、NFATC3(活化T细胞核因子3)、CAMK2D(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ)响应剪切应力变化、Wnt5a刺激或干预而受到调节。参见图2和图3。

我们公开了这些Wnt受体(即FZD5、FZD2、ROR1)和钙信号传导途径的相关分子(即PLCB1、PPP3R1、NFATC3、CAMK2D)提供了调节SC功能和治疗青光眼的靶标。

接下来，我们开发了实验方案以证明Wnt5a受体siRNA抑制剂治疗降低IOP的功效。对于这些方案，可商业获得FZD5、FZD2和ROR1特异性siRNA(例如ThermoFisherScientific)。在一个方案中，如Yuen等人(2014,Invest Ophthalmol Vis Sci.2014；55:3320–3327)所述进行siRNA的结膜下注射。随机选择小鼠接受5uL(0.2lg/uL)FZD5 siRNA、FZD2 siRNA或ROR1 siRNA或对照的结膜下注射，每周两次，持续2周。在第二个方案中，如Tam等人(2017,Scientific Reports 7,40717)所述进行FZD5 siRNA、FZD2 siRNA或ROR1siRNA的前房内注射。通过腹腔内注射麻醉小鼠，并扩大瞳孔。首先使用牵引的钝头微玻璃针刺穿角膜，以抽出房水。穿刺后，立即将连接到10μl注射器的牵引的钝头微玻璃针通过穿孔插入，并将1.5μl含有1μg siRNA的PBS给予到前房中。对侧眼睛接受1.5μl包含相同浓度的乱序siRNA的相同注射。这些实验证明，通过结膜下注射或前房内注射局部递送的FZD5、FZD2和ROR1特异性抑制剂siRNA是用于致病性IOP的有效疗法。

为了评估由滴眼剂递送的siRNA对IOP的作用，我们基于Martinez等人的方法(MolTher.2014Jan；22(1):81-91)开发了另外的方案，其中新西兰白兔在连续4天的期间内接受局部给予20nmol/天的FZD5 siRNA或FZD2 siRNA或ROR1 siRNA或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。与溶媒处理组相比，处理的眼睛显示显著的IOP降低。第一次给予后2天可检测到FZD5 siRNA、FZD2 siRNA和ROR1 siRNA对IOP的作用，直到最后一次给予后约2天，其值仍在基础水平以下。我们还调整了新西兰白兔的口服水过载模型，以评价FZD5 siRNA、FZD2 siRNA和ROR1siRNA在例如青光眼中观察到的病理状态下降低IOP的作用。最初给予四个不同剂量的每种siRNA(10nmol、20nmol、40nmol和60nmol/眼/天)，共三次：诱发高压前48、24和2小时。所有处理均在双眼中实施，并在诱发高压之前以及口服过载后每20分钟至最长120分钟测量IOP。结果分析表明，在所有测试剂量下，FZD5 siRNA、FZD2 siRNA和ROR1 siRNA均提供显著的对抗IOP升高的保护。

为了证实FZD5 siRNA、FZD2 siRNA和ROR1 siRNA对IOP的功效和特异性，在连续4天的期间内，以40nmol/眼/天的剂量处理更大一组动物；在第四天，通过水负荷诱导眼内高压。对照结果表明，在用PBS处理的动物中，在诱发高压后的第一小时期间，水负荷导致IOP升高。通过比较每个时间点的IOP值进行的分析表明，与PBS处理的动物相比，用FZD5siRNA、FZD2 siRNA或ROR1 siRNA处理在第一小时内显著降低了ΔIOP值。该作用是特异性的，因为用乱序siRNA处理对IOP没有作用。

我们接下来开发了实验方案以证明FZD5、FZD2和ROR1特异性抗体抑制剂治疗降低IOP的功效。这些方案使用OMP18R5(一种结合FZD5的人源化单克隆抗体)、Abcam ab52565(一种结合FZD2的单克隆抗体)和西妥珠单抗(一种人源化IgG1抗ROR1单克隆抗体)，但是抗人FZD5、FZD2 siRNA和ROR1多克隆抗体和单克隆抗体可以从多个来源商购获得，例如ThermoFisher Scientific、Abcam、SigmaAldrich等)；关于针对人FZD5的抗体，还参见US9573998。这些实验使用小鼠和兔模型(同上)证明通过滴眼剂局部递送的FZD5、FZD2siRNA和ROR1特异性抗体抑制剂是用于致病性IOP的有效疗法。

在示例性模型系统中，在野生型正常小鼠的右眼(OD)中诱导眼内高压，并给予FZD5、FZD2或ROR1中和抗体以评估它们对IOP和青光眼的其他参数的治疗作用，所述青光眼的其他参数包括角膜水肿、视网膜神经节细胞(RGC)死亡和RNFL变薄。与小鼠右眼中IOP显著升高的对照组相比，FZD5、FZD2和ROR1抗体处理的眼睛中的IOP显著更低。如通过OCT在体内由中央角膜厚度所测量的，FZD5、FZD2和ROR1干预减少角膜水肿。在IOP增加之后，在对照组中观察到角膜厚度增加，但在FZD5、FZD2和ROR1抗体处理的眼睛中未观察到。FZD5、FZD2和ROR1干预减少了处理的眼睛中的RGC死亡以及RNFL变薄。这些可分别通过免疫染色和/或OCT检测。这些结果证实，在青光眼小鼠模型中，局部FZD5、FZD2和ROR1抗体干预显著降低IOP并保护角膜和视网膜。

我们接下来设计实验方案以证明FZD5、FZD2和ROR1特异性拮抗剂肽和小分子抑制剂处理降低IOP的功效。这些方案采用了突变的FZD5片段，其充当强效的拮抗剂(例如Liu等人,Hum Mol Genet.2016Apr 1；25(7):1382–1391)，和ROR1的口服小分子抑制剂(KAN0439834；Hojjat-Farsangi等人,Leukemia 32,p2291–2295,2018)。这些实验再次使用小鼠和兔模型两者(同上)证明，由滴眼剂局部递送的FZD5、FZD2和ROR1特异性修饰的肽抑制剂和小分子抑制剂是用于致病性IOP的有效疗法。

在示例性模型中，使用建立已久的具有激光诱导的巩膜上静脉闭塞的青光眼小鼠模型获得了体内数据(Zhang L,等人Establishment and Characterization of an AcuteModel of Ocular Hypertension by Laser-Induced Occlusion of EpiscleralVeins.Invest Ophthalmol Vis Sci.2017Aug 1；58(10):3879-3886)。在小鼠右眼(OD)中诱导眼内高压，左眼(OS)作为对照。在这些实施例中，从在小鼠右眼内诱导眼内高压后的第1天开始，每天通过结膜下注射的局部给予将抑制剂或其对照递送到右眼。左眼用作对照。分别在第3天或第7天通过体内OCT测量中央角膜厚度和RNFL。所有体外数据均收集自培养物中的人施莱姆氏细胞。

ROR1抑制剂

1)西妥珠单抗

2)KAN0439834；Hojjat-Farsang等人,Leukemia.2018Oct；32(10):2291-2295.doi:10.1038/s41375-018-0113-1；还参见相关的抑制剂类别：US2018/0002329，通过引用并入本文。

3)ROR1 siRNAs，Thermofisher

4)ROR1抗体，R&D Systems，目录号AF2000

5)ROR1小分子，DB03208，Medkoo Biosciences，Inc.目录号：564580

6)ROR1小分子，strictinin；参见：Fultang N.等人Strictinin,a novel ROR1-inhibitor,represses triple negative breast cancer survival and migration viamodulation of PI3K/AKT/GSK3βactivity.PLoS One.2019年5月31日；14(5):e0217789。

7)ROR1阻断肽；参见：https://www.mybiosource.com/blocking-peptide/ror1/544396。

8)ARI-1，定义为ROR1抑制剂；参见：Liu X.等人Novel ROR1 inhibitor ARI-1suppresses the development of non-small cell lung cancer.Cancer Lett.2019年8月28日；458:76-85。

9)ROR1-cFab(嵌合抗ROR1 Fab抗体)；参见：Yin Z.等人Antitumor activity ofnewly developed monoclonal antibody against ROR1 in ovarian cancercells.Oncotarget.2017年10月7日；8(55):94210-94222)。

FZD2抑制剂

FZD2 siRNA，Thermofisher

FZD2抗体，Abcam ab52565

FZD5抑制剂

FZD5 siRNA，Thermofisher

FZD5抗体，R&D Systems AF1617

CAMK2D抑制剂

CAMK2D siRNA，Thermofisher

PLCB1抑制剂

PLCB1 siRNA，Thermofisher

PPP3R1抑制剂

PPP3R1 siRNA，Thermofisher

NFATC3抑制剂

1)NFATC3 siRNA，Thermofisher

重组抗人抗体和变体：

2)Creativebiolabs重组抗人NFATC3抗体10188

3)Creativebiolabs重组抗人NFATC3抗体Fab片段10189

4)Creativebiolabs重组抗人NFATC3抗体scFv片段10190

人siRNA序列

*ThermoFisher Scientific siRNA基因名称