一种枸杞高光效种质的筛选方法
阅读说明：本技术 一种枸杞高光效种质的筛选方法 (Method for screening high-light-efficiency germplasm of Chinese wolfberry ) 是由 何昕孺 戴国礼 曹有龙 王玉静 黄婷 张波 何军 尹跃 段淋渊 米佳 王亚军 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种枸杞高光效种质的筛选方法,涉及枸杞育种技术领域。本发明提供的高光效枸杞种质的筛选方法,以待评价枸杞种质材料的叶片作为待测样本,测定其光合作用参数指标和物理性状参数指标,通过聚类分析将待评价的枸杞种质材料分为若干类群,从而筛选出高光效枸杞种质材料。本发明还可以进一步利用判别分析的方法对待鉴别枸杞种质材料进行分类,相应地获得其种质类型。本发明建立了一种枸杞高光效种质筛选的方法,该方法可初步评定枸杞品种的光合能力,筛选出高光效种质,为进行枸杞育种提供有力的保障和理论依据。(The invention provides a method for screening high-photosynthetic-efficiency germplasm of Chinese wolfberry, and relates to the technical field of Chinese wolfberry breeding. The method for screening the high-light-efficiency wolfberry germplasm takes the leaves of a wolfberry germplasm material to be evaluated as a sample to be tested, measures the photosynthesis parameter index and the physical character parameter index of the sample, and divides the wolfberry germplasm material to be evaluated into a plurality of groups through cluster analysis, thereby screening the high-light-efficiency wolfberry germplasm material. The invention can further classify the wolfberry germplasm materials to be identified by using a discriminant analysis method, and correspondingly obtain the germplasm types of the wolfberry germplasm materials. The invention establishes a method for screening high-photosynthetic-efficiency germplasm of medlar, which can preliminarily evaluate the photosynthetic capacity of a medlar variety, screen out the high photosynthetic-efficiency germplasm and provide powerful guarantee and theoretical basis for breeding the medlar.)
技术领域
本发明涉及枸杞育种技术领域，具体涉及一种枸杞高光效种质的筛选方法。
背景技术
枸杞是“药食两用”植物资源，具有巨大的药用和经济价值。随着人们对枸杞的营养保健功效的不断认识和认可，枸杞的市场需求日益旺盛。目前不同枸杞产区根据自然条件、气候特点已形成了适合不同产区的种植管理模式，围绕枸杞提质增效、机械化栽培等方面也进行了大量研究，但目前栽培技术的改进对枸杞单株产量及种植效益提升效果还不明显。而品种是产业发展的源头保障，‘宁杞1号’、‘宁杞4号’等传统主栽品种高产潜力大，适应性广，由于长期栽培，繁殖代数的增加，抗性、产量等优良性状面临退化、产量降低，新品种少且推广速度缓慢。因此挖掘枸杞种质资源产量潜力，培育高产优质品种是枸杞新品种选育的目标，也是枸杞产业持续发展的关键。
光合作用是作物产量形成的生理基础，植物干物质90％-95％来自光合作用，光能利用率的强弱决定了植物产量的高低。高光效育种被视为作物遗传改良的重要内容和研究方向，我国水稻、小麦、大豆等作物上的高光效育种以叶片的形态结构、光合气体交换参数、生理酶活性等指标已选育出一批高光效品种(系)，实现了产量与光合效率的同步提高。因此高光效种质的筛选是挖掘光合增产潜力，高光效育种的基础和前提。但枸杞种质资源的挖掘以多糖、果实大小、抗性等性状为主，枸杞品种选育的丰产性指标以单果重、产量为主要指标，而枸杞种质资源光合特性的研究尚未进行挖掘，缺乏合理的高光效种质筛选方法，不能有效的筛出适合的种质，培育出的枸杞新品种丰产性难以得到保证。因此开展高光效枸杞种质筛选方法研究，可以为枸杞新品种选育提供理论依据。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中缺乏枸杞高光效种质筛选方法的缺陷，从而提供一种基于枸杞叶片光合性状指标和物理性状指标的枸杞高光效种质的筛选方法。
本发明提供一种枸杞高光效种质的筛选方法，包括：
(1)选择待评价枸杞种质材料的叶片作为待测样本，分别测定所述待测样本的评价指标数据，所述评价指标包括净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重和比叶重；
(2)将步骤(1)得到的所述评价指标的数据进行聚类分析，得到若干类群；
(3)在步骤(2)得到的若干类群中选择评价指标数据最优的类群，该类群中的枸杞种质材料则为高光效种质。
进一步地，在步骤(2)中，将步骤(1)得到的所述评价指标的数据进行K-均值聚类分析，聚类数设定为3。
进一步地，所述的枸杞高光效种质的筛选方法，还包括：
对步骤(2)得到的聚类分析结果进行逐步判别分析，得到判别函数以及各类群的重心坐标；
将待鉴别枸杞种质材料测得的指标数据代入所述判别函数，得出所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标；
根据各类群的重心坐标与所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标，按照距离最小原则判定待鉴别枸杞种质材料所属的类群，若判定所述待鉴别枸杞种质材料属于高光效种质的类群，则所述待鉴别枸杞种质材料为高光效种质。
进一步地，按照距离最小原则判定待鉴别枸杞种质材料所属类群的方法包括：分别计算所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离，所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与哪一类群的重心坐标距离最小，则判定所述待鉴别枸杞种质材料属于该类群。
进一步地，计算所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离的公式如下：
式中，
Di代表待鉴别枸杞种质材料x对应的坐标与类群i的重心坐标之间的距离；
Y1x代表待鉴别枸杞种质材料x对应的第一维度的坐标；
Y1i代表类群i的重心对应的第一维度的坐标；
Y2x代表待鉴别枸杞种质材料x对应的第二维度的坐标；
Y2i代表类群i的重心对应的第二维度的坐标。
进一步地，所述判别函数如下：
Y1＝-2.971+0.010X1+7.146X2-12.624X3；
Y2＝-8.467+0.002X1+0.933X2+40.901X3，
其中，X1代表气孔导度、X2代表叶片鲜重、X3代表比叶重。
进一步地，各类群的重心坐标分别为(-2.235，2.944)、(-0.710，-0.505)、(2.613，0.427)，若所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与(2.613，0.427)之间的距离最小，则判定所述待鉴别枸杞种质材料为高光效种质。
进一步地，在步骤(1)中，
所述待测样本的选择方法包括：于枸杞树一年生春梢的抽生期进行田间标样，选取树体长势一致的若干棵枸杞树，选取生长在树体同一方向、同一高度、生长状态、枝条长度一致的一年生春梢，将其10-12节位的成熟叶片标记为待测样本；
测定所述待测样本的评价指标的时期为：枸杞树一年生春梢的始果期，晴朗无风的上午9:00-12:00。
进一步地，在步骤(1)中，净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率的测定方法包括：利用便携式光合仪进行测定，设置气体流速750μmol·s-1，气体混匀器的风扇速度为7，叶室温度为30℃，相对湿度为60％，利用外置光源将PAR(Photosynthetically ActiveRadiation，光合有效辐射)设定为1200μmol·m-2·s-1，测定时从叶片基部夹样，使叶片填满叶室，闭合叶室，靠叶室上下的海绵密封整个叶室，防止叶室漏气。
进一步地，在步骤(1)中，叶面积利用紫光扫描仪测定；叶片鲜重利用电子分析天平测定；比叶重按照叶片干重与叶面积的比值计算，叶片干重是将鲜叶片在70℃烘干至恒重后利用电子分析天平测定。
进一步地，所述的枸杞高光效种质的筛选方法，还包括：验证聚类分析结果的可靠性，其方法包括：
对步骤(2)得到的聚类分析结果进行逐步判别分析，得到判别函数以及各类群的重心坐标；
根据所述判别函数对所述待评价枸杞种质材料重新进行分类，与步骤(2)得到的聚类分析结果进行对比，若分类结果不一致，则判定为误判，根据误判率确定聚类分析结果的可靠性。
进一步地，根据所述判别函数对所述待评价枸杞种质材料重新进行分类的方法包括：
将所述待评价枸杞种质材料测得的指标数据代入所述判别函数，得出所述待评价枸杞种质材料对应的坐标；
根据各类群的重心坐标与所述待评价枸杞种质材料对应的坐标，按照距离最小原则判定待评价枸杞种质材料所属的类群。
进一步地，按照距离最小原则判定待评价枸杞种质材料所属的类群的方法包括：分别计算待评价枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离，所述待评价枸杞种质材料对应的坐标与哪一类群的重心坐标距离最小，则判定所述待评价枸杞种质材料属于该类群。
本发明提供一种枸杞高光效种质的筛选方法，包括：
(1)选取待鉴别枸杞种质材料的叶片，测定气孔导度、比叶重和叶片鲜重；
(2)根据判别函数计算待鉴别枸杞种质材料对应的坐标，所述判别函数如下：
Y1＝-2.971+0.010X1+7.146X2-12.624X3；
Y2＝-8.467+0.002X1+0.933X2+40.901X3，
其中，X1代表气孔导度、X2代表叶片鲜重、X3代表比叶重；
(3)计算所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离，比较计算得到的各距离之间的大小，其中，各类群的重心坐标分别为(-2.235,2.944)、(-0.710，-0.505)、(2.613，0.427)；
(4)若所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与(-2.235，2.944)之间的距离最小，则判定所述待鉴别枸杞种质材料为低光效种质；
若所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与(-0.710，-0.505)之间的距离最小，则判定所述待鉴别枸杞种质材料为中光效种质；
若所述待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与(2.613，0.427)之间的距离最小，则判定所述待鉴别枸杞种质材料为高光效种质。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供的高光效枸杞种质的筛选方法，以待评价枸杞种质材料的叶片作为待测样本，测定其光合作用参数指标和物理性状参数指标，通过聚类分析将待评价的枸杞种质材料分为若干类群，从而筛选出高光效枸杞种质材料。本发明还可以进一步利用判别分析的方法对待鉴别枸杞种质材料进行分类，相应地获得其种质类型。本发明建立了一种枸杞高光效种质筛选的方法，该方法可初步评定枸杞品种的光合能力，筛选出高光效种质，为进行枸杞育种提供有力的保障和理论依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中各类群枸杞种质材料的典型判别得分图；
图2是本发明实施例1中各类群枸杞种质材料的领域图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，包括但不限于本申请实施例中采用的原料或仪器。
实施例1
本实施例提供一种高光效枸杞种质的筛选方法，具体步骤如下：
1.待测样本选择
1.1枸杞种质材料
以宁夏银川市芦花台宁夏农林科学院现代农业综合试验基地枸杞种质资源圃的76种枸杞种质材料作为供试材料。
1.2待测样本
于枸杞树一年生春梢的抽生期进行田间标样，每个种质材料各选取树体长势一致的3棵枸杞树，选取生长在树体同一方向、同一高度、生长状态、枝条长度一致的一年生春梢，为了使叶龄一致，将10-12节位的成熟叶片标记为待测样本。
2.指标测定
2.1指标选择
初选指标包括叶片的光合作用参数指标和叶片的物理性状参数指标：
叶片的光合作用参数指标：净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)和瞬时水分利用效率(WUE)；
叶片的物理性状参数指标：叶面积、叶片鲜重、叶片干重和比叶重。
2.2测定时期
枸杞树一年生春梢的始果期，晴朗无风的上午9:00-12:00。
因光合作用参数指标数据受其自身的遗传特性、植物学特征及外界生理生态环境的影响较大，于2019年和2020年连续测两年。
2.3测定方法
净光合速率(μmol·m-2·s-1)、气孔导度(μmol·m-2·s-1)、胞间CO2浓度(μmol·mol-1)、蒸腾速率(mmol·m-2·s-1)的测定方法：
利用德国GFS-3000便携式光合仪进行测定，设置气体流速750μmol·s-1，气体混匀器的风扇速度为7，叶室温度为30℃，相对湿度为60％，利用外置光源将PAR设定为1200μmol·m-2·s-1，测定时从叶片基部夹样，使叶片填满叶室，闭合叶室，靠叶室上下的海绵密封整个叶室，防止叶室漏气；每次测定记录3次数据，不同枸杞种质材料的供试材料采用轮测的方法，每次每材料测定1片叶子，共测定3次。
瞬时水分利用效率(μmol·mmol-1)按照净光合速率与蒸腾速率的比值计算，即瞬时水分利用效率＝净光合速率/蒸腾速率。
测定上述光合作用参数指标后，采集与其相对应的叶片，利用Uniscan M1紫光扫描仪测定叶面积(mm2)；电子分析天平称量叶片鲜重(g)；将鲜叶片在70℃烘干至恒重，利用电子分析天平测定叶片干重(g)。
比叶重(mg·mm-2)按照叶片干重与叶面积的比值计算，即比叶重＝叶片干重/叶面积。
3.确定评价指标
3.1统计工具
采用Microsoft Excel 2007进行数据整理，使用SPSS 21进行相关性分析、主成分分析、聚类分析、判别分析。
3.2相关性分析
将得到的光合作用参数指标和物理性状参数指标的数据进行相关性分析，得到各初选指标的相关性结果如表1所示。
表1各初选指标的相关性结果
指标
Pn
Gs
Ci
Tr
WUE
叶面积
鲜重
干重
比叶重
Pn
1
Gs
0.898**
1
Ci
0.328**
0.568**
1
Tr
0.932**
0.950**
0.558**
1
WUE
0.133
-0.140
-0.774**
-0.185
1
叶面积
0.594**
0.600**
0.200
0.570**
0.059
1
鲜重
0.630**
0.615**
0.221
0.591**
0.062
0.893**
1
干重
0.567**
0.580**
0.205
0.584**
0.064
0.893**
0.864**
1
比叶重
-0.068
-0.016
0.084
-0.038
-0.055
-0.075
-0.017
0.320**
1
注：**P＜0.01，*P＜0.05。
如表2所示(表中Pn代表净光合速率、Gs代表气孔导度、Ci代表胞间CO2浓度、Tr代表蒸腾速率、WUE代表瞬时水分利用效率)，净光合速率与气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重、叶片干重呈极显著正相关；气孔导度与胞间CO2浓度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重、叶片干重呈极显著正相关；胞间CO2浓度与蒸腾速率呈极显著正相关，与瞬时水分利用效率呈极显著负相关；蒸腾速率与叶面积、叶片鲜重、叶片干重呈极显著正相关；叶面积与叶片鲜重、叶片干重呈极显著正相关；叶片鲜重与叶片干重呈极显著正相关；叶片干重与比叶重呈极显著正相关。
3.3主成分分析
将得到的光合作用参数指标和物理性状参数指标的数据进行主成分分析，得到主成分分析结果如表2所示。
表2各项指标旋转后的因子载荷值
如表2所示，前3个因子的累计贡献率达86.88％，能够代表9项指标的大部分信息。其中：
因子1解释的指标为净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重、叶片干重，是光合作用参数指标和物理性状参数指标；
因子2解释的指标为胞间CO2浓度、瞬时水分利用效率，是光合作用参数指标；
因子3解释的指标为比叶重，是物理性状参数指标。
3.4评价指标的确定
结合相关性分析和主成分分析结果在初选指标中剔除相关性大且信息重复的指标，得到枸杞高光效种质筛选的评价指标：
光合作用参数指标中瞬时水分利用效率为净光合速率与蒸腾速率的推导指标，瞬时水分利用效率与胞间CO2浓度呈极显著相关(R＝-0.774)，且胞间CO2浓度指标的权重高于瞬时水分利用效率，因此剔除掉瞬时水分利用效率指标；
物理性状参数指标中叶片干重与叶面积、叶片鲜重、比叶重呈极显著相关(R＝0.893、0.846、0.320)，且叶片干重指标的权重最低，因此剔除掉叶片干重指标。
因此，剔除相关性大且信息重复的指标后，得到枸杞高光效种质筛选的评价指标为：净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重、比叶重。
4.建立高光效种质筛选模型
4.1K-均值聚类分析
利用枸杞高光效种质筛选的评价指标对枸杞种质材料进行K-均值聚类分析，聚类数设定为3。聚类结果如表3所示。
表3枸杞种质材料的聚类结果
如表3所示，通过聚类分析将76份供试材料分为三大类群。
第一类群(低光效种质)：净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重低，比叶重高；
第二类群(中光效种质)：净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重中等，比叶重低；
第三类群(高光效种质)：净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率、叶面积、叶片鲜重高，比叶重中等。
4.2判别分析
利用聚类结果进行逐步判别分析以建立高光效种质筛选模型，有3个变量最终引入判别函数，剔除了4个变量，得到判别函数和各类群的重心坐标。各类群枸杞种质材料的典型判别得分图和各类群枸杞种质材料的领域图分别如图1和图2所示。
4.2.1判别函数
逐步判别分析得到的典型判别式函数系数如表4所示。
表4典型判别式函数系数
由表4得出判别函数如下：
Y1＝-2.971+0.010X1+7.146X2-12.624X3；
Y2＝-8.467+0.002X1+0.933X2+40.901X3，
其中，X1代表气孔导度、X2代表叶片鲜重、X3代表比叶重。
4.2.2各类群的重心坐标
逐步判别分析得到的组质心处的函数如表5所示。
表5组质心处的函数
由表5得出各类群的重心坐标分别为：
第一类群(-2.235，2.944)；
第二类群(-0.710，-0.505)；
第三类群(2.613，0.427)。
5.聚类分析结果的可靠性检验
根据判别函数对76个枸杞种质材料重新进行分类：
将气孔导度、比叶重、叶片鲜重的测定数据代入4.2.1给出的判别函数中，得到该枸杞种质材料的坐标，根据4.2.2提供的各类群的重心坐标，按照距离最小原则判定枸杞种质材料所属的类群，与表3中的聚类分析结果进行对比，若分类结果不一致，则判定为误判。
判定枸杞种质材料所属的类群的方法：分别计算该枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离，该枸杞种质材料对应的坐标与哪一类群的重心坐标距离最小，则枸杞种质材料归为该类群。
计算枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离Di的公式如下：
式中，
Di代表枸杞种质材料x对应的坐标与类群i的重心坐标之间的距离；
Y1x代表枸杞种质材料x对应的第一维度的坐标；
Y1i代表类群i的重心对应的第一维度的坐标；
Y2x代表枸杞种质材料x对应的第二维度的坐标；
Y2i代表类群i的重心对应的第二维度的坐标。
若枸杞种质材料对应的坐标与(-2.235，2.944)之间的距离最小，则归为第一类群；若枸杞种质材料对应的坐标与(-0.710，-0.505)之间的距离最小，则归为第二类群；若枸杞种质材料对应的坐标与(2.613，0.427)之间的距离最小，则归为第三类群。
采用上述方法重新分类后，结果只有1个种质材料被误判，宁杞7号由原来的第三类群误判为第二类群，总误判率为1.32％，判对的概率为98.68％。因此认为聚类分析的结果是可靠的。
此外，由图1和图2同样可以看出，判别函数可将3个类群明显地区分开。
6.筛选结果
经过上述方法在76个枸杞种质材料中筛选出19个高光效种质。
实施例2
本实施例提供利用实施例1建立的高光效种质筛选模型对待鉴别枸杞种质材料进行判别的方法：
(1)选取待鉴别枸杞种质材料的叶片，测定气孔导度、比叶重和叶片鲜重，测定方法参照实施例1的第2部分；
(2)根据判别函数计算待鉴别枸杞种质材料对应的坐标；
(3)计算待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离，比较计算得到的各距离之间的大小；
(4)按照距离最小原则判定待鉴别枸杞种质材料所属类群：分别计算待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与各类群的重心坐标之间的距离，待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与哪一类群的重心坐标距离最小，则判定待鉴别枸杞种质材料属于该类群；
(5)若待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与(-2.235，2.944)之间的距离最小，则判定待鉴别枸杞种质材料为低光效种质；若待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与(-0.710，-0.505)之间的距离最小，则判定待鉴别枸杞种质材料为中光效种质；若待鉴别枸杞种质材料对应的坐标与(2.613，0.427)之间的距离最小，则判定待鉴别枸杞种质材料为高光效种质。
此外，由图2给出的领域图可看出，根据两个判别函数分别构成了图形的两个坐标轴，不同类群的重心用星号表示，整个平面被3条线分开，待鉴别枸杞种质材料对应的坐标处于哪个区域，就判定为哪个类群。
以宁夏银川市芦花台宁夏农林科学院现代农业综合试验基地枸杞种质资源圃的某杂交品系(2-12)为例，测得的气孔导度、叶片鲜重和比叶重分别为600.85、0.38、0.138，代入判别函数计算得到该枸杞种质材料对应的坐标(4.011，-1.266)，计算该坐标与(-2.235，2.944)、(-0.710，-0.505)和(2.613，0.427)之间的距离，分别为7.532、4.782和2.196，因此该枸杞种质材料对应的坐标与(2.613，0.427)之间距离最近，判定该枸杞种质材料属于第三类群，为高光效种质。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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