具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

一、实施方法例

(一)体外使用CasRx特异性敲除Tmc1^Bth转录本

为了在HEK293T细胞中高效和特异性地敲除Tmc1^Bth mRNA，首先比较了两种RNA编辑系统，PspCas13b和CasRx，这两种系统被证明都可以有效地敲除内源转录本。然后设计了30个靶向Tmc1^Bth转录本的sgRNAs，在PspCas13b和CasRx系统中，sgRNA的长度都为30bp，并以一个30bp靶向GFP的sgRNA(记为NT)作为对照(sgRNA1-30和NT的序列如表1，见序列表SEQID NO.1-31)，靶向Tmc1^Bth转录本的sgRNAs设计示意图如图1所示，其中碱基A依次插入到1-30的位置。

表1

(二)质粒的构建

在CAG启动子控制下，合成人密码子优化的CasRx基因，并将其克隆到具有两个NLS(核定位序列)的哺乳动物表达载体中。合成人密码子优化的PspCas13b基因，并将其克隆到CAG启动子控制下的NES(核输出序列)哺乳动物表达载体中。

然后构建CasRx sgRNA克隆主链，其中包含两个用BspQI酶克隆的直接重复序列；构建PspCas13b sgRNA克隆主链，其中包含一个用BbsI酶克隆的3’端直接重复序列。进一步合成了sgRNAs作为单链DNA寡核苷酸。两条反向互补地sgRNA寡核苷酸退火形成双链，通过BspQI酶切位点连接到含有U6启动子的CasRx系统的sgRNA表达载体上，并在U6启动子下克隆。同样使用BbsI酶切位点，把双链sgRNA连到在含有U6启动子元件的PspCas13b系统的sgRNA表达载体上克隆。

为了构建mCherry-Tmc1^Bth报告基因载体，合成了含有c.1235T＞A突变的Tmc1转录本的90bp序列，并将其克隆到mCherry基因的3’端，该端去掉终止密码子。为了构建mCherry-Tmc1⁺报告基因载体，合成了含有c.1235T的Tmc1转录本的90bp序列，并将其克隆到去掉终止密码子的mCherry基因的3’端。

(三)细胞培养和转染

在添加10％胎牛血清(FBS)(v/v)的DMEM培养基(Gibco)中培养293T细胞，在37℃、5％CO₂的条件下培养。转染前，将细胞接种在聚D-赖氨酸包覆的24孔板上，并保持60～70％的融合度。

细胞转染使用EZ Trans试剂(Shanghai Life iLab)，方法按照制造商给的方案。转染时，每孔中混合表达CasRx或PspCas13b质粒(600ng)、表达sgRNA质粒(300ng)，mCherry-Tmc1^Bth或mCherry-Tmc1⁺报告基因。分别用40μL DMEM稀释1μg DNA和3μL EZ转染试剂，将稀释后的EZ转染试剂加入稀释后的DNA溶液中，轻轻混合，室温下孵育15分钟，形成DNA-EZ复合物，然后将DNA-EZ复合物直接添加到每个孔中，来回摇动平板轻轻混合，转染6h后，移除复合物，向细胞中加入0.5mL完全生长培养基。

(四)细胞成像

转染后48h，用尼康TI-E显微镜观察并捕获每个孔的3张图像。ImageJ用于量化mCherry信号的荧光强度。

(五)流式细胞术(FACS)

收集293T细胞并在转染48小时后用流式细胞术检测。mCherry信号通过FCSExpress 5软件(DeNovo软件)在BD LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上立即检测。总共收集了10,000个细胞样本，并使用FlowJo软件对每个样本进行分析。

(六)病毒产量测定

AAV(PHP.eB血清型)病毒载体由和元生物技术(上海)有限公司生产，AAV携带双转基因、U6启动子驱动的靶向Tmc1的sgRNA和CMV启动子驱动的RfxCas13作为治疗载体；除了sgRNA序列被NT序列取代外，对照组AAV的构建与治疗载体一致。采用编码EGFP蛋白的同一血清型AAV检测转导效率。AAV-CasRx+sgRNA3的病毒滴度为3.38×10¹²vg/mL，AAV-CasRx+NT的病毒滴度为1.73×10¹²vg/mL。病毒分株被分离成小体积并储存在-80℃，以避免反复冻融循环。

(七)供试小鼠

所有的供试小鼠都被饲养在相同设施中，以12小时的光-暗周期饲养。杂合的贝多芬小鼠(Tmc1^Bth/+)由Andrew Griffith博士(特拉维夫大学Sackler医学院人类遗传与分子医学系)赠送。将Tmc1^Bth/+小鼠与Tmc1^+/+或Tmc1^Bth/+C3HeB/FeJ(C3H)背景小鼠(JacksonLaboratories)进行近亲交配繁殖新幼鼠。采用混合蛋白酶-K的裂解液，在55℃下孵育8h，然后在85℃下孵育1h，从尾夹活检标本中提取DNA，使用20μL体系进行PCR，产物测序进行基因型鉴定。

(八)内耳注射

Tmc1^Bth/+或野生型P1和P2幼鼠在通过圆窗膜注射1.5μL病毒。幼鼠在冰上麻醉2-3分钟，直到失去意识。麻醉后，在耳后切口暴露耳蜗观察圆窗膜。用玻璃微管将病毒通过圆窗膜缓慢注入右耳蜗。注射后缝合皮肤切口，将幼鼠置于42℃加热垫上进行恢复，幼鼠完全康复后被送回母鼠喂养。

(九)毛细胞电生理学

在P4-P5收集注射Tmc1^+/+、Tmc1^Bth/Bth或Tmc1^Bth的小鼠耳蜗，在含1％胎牛血清的DMEM(1×)培养基中，37℃，5％CO₂下培养。全细胞膜片钳记录内毛细胞在P14-P15的表达，在标准的人工外淋巴液中含有(单位：mM)：137NaCl、5.8KCl、1.3CaCl₂、0.9MgCl₂、0.7NaH₂PO₄、10HEPES和5.6D-葡萄糖，调整pH到7.40，渗透压为～300mmol/kg。从硼硅酸盐玻璃毛细管中提取记录移液管(1B150F-4，世界精密仪器公司，佛罗里达，美国)，内部溶液包含(单位：mM)：140CsCl、0.1EGTA、1MgCl₂、10HEPES、2Mg-ATP和0.3Na-ATP(pH 7.20，渗透压～295mmol/kg)。通过EPC10/2放大器(HEKA，Lambrecht/Pfalz，德国)在PC端Patchmaster(HEKA)驱动下，保持电位为-80mV，使用电压钳记录MET电流。电流信号在2kHz被过滤，在200kHz被数字化。通过一根尖端为～10μm的管，在～15μm远处喷射液流，使毛细胞纤毛束产生偏移。喷射液流由一个压电盘(27毫米直径)，施加正弦电压(40Hz，±120V)驱动产生。

(十)目标深度测序数据分析

为了在RNA水平上分析CasRx敲除突变体的序列，从耳蜗中获得了总RNA和cDNA，用引物TMC1-lib-F和TMC1-lib-R扩增目的位点序列(引物序列如表2)，PCR产物在2％琼脂糖凝胶上观察，用纯化试剂盒(Qiagen)纯化，在Illumina MiSeq平台上生成150个碱基对。基于野生型序列的存在，对杂合子样本的读取进行分离(5’-ATG CCT CCT GGG GAT GTT CTGTCC CAC C-3’和反补序列5’-GGT GGG ACA GAA CAT CCC CAG GAG GGA CAT-3’)、突变序列(5’-ATGTCC CTC CTG GGGAAG TTC TGT CCC ACC-3’)和它的反补序列(5’-GGTGGGACAGAACTT CCC CAG GAG GGACAT-3’)。

敲除效率计算公式为：

(十一)耳蜗的RT-qPCR

对野生型和杂合子小鼠耳蜗进行解剖，取出的耳蜗组织用TRIzol(Invitrogen)提取总mRNA，并按照制造商的方案，用cDNA合成超混合(YEASEN)对mRNA进行逆转录，1μL RT产物加入RT-qPCR SYBR试剂盒(YEASEN)进行后续的RT-qPCR检测，步骤如下：95℃5min，95℃10s，60℃35s，40个循环。

设计引物q-TMC1-F2和q-TMC1-R2检测Tmc1总表达量。为了检测突变体转录本的表达，设计了正向引物q-TMC1-F4，其3’端是碱基A与突变体序列特异性结合，反向引物q-TMC1-R2(引物序列如表2)。

表2质粒构建、基因分型、深度测序和RT-PCR所用到的引物

(十二)脱靶分析

为了分析跨转录组的脱靶RNA编辑位点，使用RNeasy Plus Miniprep试剂盒(Qiagen)收集来自不同处理样本的总RNA，每个样本取1g RNA作为RNA样品制备的输入材料，测序文库使用RNALibrary Prep Kit for Illumina(NEB，USA)，根据制造商的建议，并将索引代码添加到每个样本的属性序列，每个样本至少有500万次读取。使用DESeq2 R包对两组进行差异表达分析。DESeq2提供了统计例程，使用基于负二项分布的模型来确定数字基因表达数据中的差异表达。p值结果采用Benjamini和Hochberg方法进行调整，以控制错误发现率。DESeq2发现的p值＞0.05的基因被认为是差异表达。

(十三)听觉测试

使用BioSigRZ系统(塔克-戴维斯技术公司，Alachua，FL，美国)在隔音室中记录了ABRs和DPOAEs。小鼠腹腔注射甲苯噻嗪(10mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)麻醉。刺激由PXI-1042Q底盘上的数字输入/输出卡(美国国家仪器公司PXI-4461)产生，由SA-1扬声器驱动器(Tucker Davis Technologies，Inc.)放大，并由两个静电驱动器(CUI MiniatureDynamics)传送到被研究的耳朵，采用驻极体麦克风(驻极体电容)记录耳道声压，采用植入耳廓(活动电极)、顶点(参考电极)和臀部(接地电极)的皮下针电极收集ABR信号。

声音刺激为持续时间100毫秒的方形脉冲，音调爆发长3毫秒，频率分别为4、8、16、24和32千赫。声级从低于阈值的20分贝提升到90分贝，每5分贝提升一次，电信号平均重复512次。ABR阈值在视觉上被定义为最低声压级(dB SPL)，在此任何波都可以被检测到。取各实验组ABR阈值平均值并进行统计分析。第一波振幅定义为第一波峰值与刺激前1ms基线平均值的差值。在与ABR相同的条件下采集并记录DPOAE数据。在2f1-f2产生DPOAEs时，初级音调的频率比为1.2(f2/f1)，每对f2/f1的f2级比f1级低10dB SPL。f2级以5dB步从20dB扫到80dB。在每一水平上均采用波形和平均波谱，以提高所记录的耳道声压的信噪比。在每个水平上，从平均波谱和噪声中提取DPOAE在2f1-f2的振幅。根据DPOAE振幅与声级的关系插值出等响应曲线。该阈值被定义为产生高于0dB的DPOAEs所需的f2水平。

(十四)耳蜗的免疫组化

10周龄成年小鼠颈椎脱位处死后，取注射耳蜗和对侧未注射耳蜗的免疫组化。颞骨耳蜗顶部穿孔，4％多聚甲醛灌注，4℃孵育过夜，4℃、10％EDTA脱钙1-3天。PBS对脱钙化的耳蜗切片进行全贴式免疫荧光染色。用1％的Triton X-100渗透组织，用10％的驴血清在4℃条件下封闭12～16小时，然后用一抗兔抗-MYO7A(#25-6790，Proteus BioSciences,，1:800稀释)在4℃条件下孵育过夜，用二抗Cy3偶联驴抗兔IgG(AlexJackson ImmunoResearch711-165-152，1:500稀释)黑暗条件孵育2小时，在室温下用PBS冲洗三次。2周龄小鼠摘取耳蜗，解剖时不脱钙，用一抗鸡抗-EGFP(Abcam，1:1000稀释)检测AAV的转导效率，步骤同上。将标本安装在粘附显微镜载玻片(#188105，Citotest)上，用徕卡TCS SP8显微镜、40×甘油浸没透镜获得共聚焦图像。

(十五)毛细胞计数

采用ImageJ对每个分段z-堆栈的最大强度投影来合并z-堆栈。将MYO7A阳性的IHCs和IHCs在100μm的耳蜗切片上计数，分别在8kHz和16kHz区域，根据指令确定每个区域感知到的近似频率。排列细胞外三排为OHCs，内单排为IHCs。

(十六)扫描电子显微镜观察

将10周龄成年小鼠颈椎脱位处死后，取耳蜗将其打孔，从孔中灌注2.5％戊二醛，4℃下2.5％戊二醛固定过夜，4℃下10％EDTA脱钙处理3-5天，将脱钙化的耳蜗在0.1M PB培养基内分割成小块，将解剖组织放入2.5％戊二醛中，用0.1M PB洗涤3次，在1％锇酸中4℃固定2小时。组织在乙醇梯度中脱水，然后在HCP-2干燥器中干燥2小时，将干燥后的组织贴在样品台上，用IB-3离子溅射仪喷洒3min。用高真空场发射扫描电子显微镜(日立575SU-8010)在2.5kV(低倍率)和10.0kV(高倍率)下获得扫描电镜图像。

(十七)数据统计

所有数据均以标准差均值或SEM均值表示，使用GraphPad Prism(GraphPadPrism，8.0版)对结果进行统计分析，使用学生t检验来确定平均值之间的显著差异，并使用单因素方差分析(ANOVA)或双向方差分析来进行多重比较，显著性水平P＜0.05。

二、实验结果例

(一)体外使用CasRx特异性敲除Tmc1^Bth转录本

为了筛选最佳sgRNA，构建了两个包含野生型或突变型Tmc1序列的mCherry荧光报告基因，mCherry基因融合在序列的5’末端(图2a)。然后共转染了这些报告基团，PspCas13b或CasRx表达载体，将sgRNA表达载体转染到293T细胞中，转染48h后，RNA编辑系统中断融合RNA的表达，测定细胞的荧光强度，作为RNA敲除效率的指标。如预期的那样，CasRx和PspCas13b导致293T细胞中mCherry的表达显著下降(图3)。当使用CasRx和PspCas13b系统靶向mCherry-Tmc1^Bth时，细胞的最低荧光强度比率分别为9.2±0.13％和17.44±0.48％(图2b,c)。进一步，为了比较两种体系的特异性，我们以mCherry-Tmc1⁺为目标测量了平均荧光强度(图2d)，并分析了mCherry-Tmc1^Bth和mCherry-Tmc1⁺mRNA干扰之间的平均荧光强度比。CasRx系统中sgRNA3比值最低，为0.089113(图2d)，其mCherry整合密度显著降低82％(图2e)，表明Tmc1^Bth转录本被高效敲除。综上所述，这些结果表明，CasRx中的sgRNA3是有效敲除Tmc1^Bth转录本而不干扰Tmc1⁺转录本的理想sgRNA。(二)CasRx在体内介导特异性靶向

上述研究结果表明，CasRx系统中的sgRNA3对293T细胞中Tmc1^Bth转录本的靶向效率最高，可用于判断AAV-CasRx+sgRNA3在体内是否有效，编码sgRNA3和CasRx的AAV载体Tmc1^Bth在Bth小鼠内耳中下调Tmc1^Bth转录本，非靶向sgRNA被包装在与对照相同的载体中(图4a)。我们使用了AAV9变种作为递送载体，其是一种更有效的和进一步发展的PHP.eB血清型AAV载体。为了验证AAV-PHP.eB载体将基因导入内毛细胞(IHCs)和外毛细胞(OHCs)的能力，我们通过圆窗膜将AAV-PHP.eB编码的EGFP注入出生后P1-P2的小鼠右内耳。于注射后2周采集耳蜗，并解剖Corti器官进行免疫组化(图4b)。我们在IHCs和OHCs中观察到近100％的病毒转导效率，发现病毒转导效率超过95％，效率由顶圈到底圈逐渐下降(图5)，这与我们之前的研究一致。

为了确定CasRx在体内的编辑能力，对全耳蜗组织进行了靶向深度测序。注射AAV-CasRx+sgRNA3的Bth小鼠耳蜗显示，Tmc1^Bth转录本占总Tmc1转录本的14.88±9.77％，与未注射的小鼠(52.83±5.33％)和注射AAV-CasRx+NT(对照组AAV，非靶向sgRNA)的小鼠(53.39±4.8％)相比明显减少(图4c和表3)。非注射、AAV-CasRx+NT和AAV-CasRx+sgRNA3的Tmc1^Bth与Tmc1⁺转录本的实际比值分别为1.1397±0.2584、1.1605±0.2183和0.186±0.1457，(图4d)，这表明Tmc1^Bth基因的敲除效率为70％。

为了进一步对Tmc1^Bth表达的分析，使用RT-qPCR在RNA水平上测量基因表达。与未注射耳蜗相比，观察到CasRx表达增加，总Tmc1表达降低(图4e)。RT-qPCR采用一对引物特异性靶向Tmc1^Bth cDNA(图4f)，结果显示，对照组Tmc1^Bth mRNA下降至54.69-10.49％(图4e)。

进一步，为了检测CasRx和sgRNA3对突变体Tmc1位点的特异靶向性，测量了MET电流。Tmc1^Bth突变不会影响毛细胞机械转导的敏感性，但Tmc1的敲除会导致MET电流的降低。Tmc1和Tmc2都是MET所必需的，Tmc2在出生后第一周短暂表达，然后在P10从免疫组化的静纤毛中消失，而Tmc1持续表达。因此，为了消除Tmc2对MET电流的贡献，我们使用P15-P16的小鼠耳蜗内毛细胞，测量了Corti体外培养器官内毛细胞在P15-P16等量时的MET电流(图4g)。野生型Tmc^+/+小鼠和未注射Tmc1^Bth/Bth小鼠顶圈内毛细胞表现出相似的MET电流振幅，而注射AAV-CasRx+sgRNA3的Tmc1^Bth/Bth小鼠顶圈内毛细胞的MET电流振幅显著降低(图4h)，表明CasRx+sgRNA3可靶向小鼠内耳Tmc1^Bth mRNA。上述结果证实了AAV-CasRx+sgRNA3介导的Tmc1^Bth转录本在体内的高效和选择性敲除。

表3

(三)体内RNA敲除预防进行性听力损失

CasRx破坏了由sgRNA3引导的Tmc1^Bth转录本，而不影响Tmc1⁺转录本，因此获得了预期的治疗效果。当Tmc1^Bth转录本被破坏和有害蛋白水平下降时，Bth小鼠的听力得到了保护，而对照组小鼠注射编码非靶向(NT)RNA的AAV后出现了进行性听力损失(图6)。由于Tmc1突变可导致进行性听力丧失，每4周进行一次ABR测试，以测量注射耳蜗的听力功能。我们测量了频率为4、8、16、24和32kHz的纯音ABR，记录在8kHz的ABR波形显示，注入CasRx+sgRNA3比未注入的对照组改善了听力功能(图7a)。在注射后第四周，Bth小鼠注射AAV-CasRx+sgRNA3在所有频率的ABR阈值(在4、8、16、24、32kHz分别为57±9dB、47±11dB、65±8dB、70±8dB和75±7dB)与未注射的对侧耳朵(在4、8、16、24、32kHz分别为77±5dB、67±13dB、78±4dB、78±4dB和82±5dB)相比均较低(图7b)。注射AAV-CasRx+NT后4周Bth小鼠的ABR阈值没有降低(图8a)，且AAV-CasRx+sgRNA3和AAV-Cas+NT均对野生型小鼠的听力有影响(图8b)。在注射后8周，双耳的ABR阈值均上升，但治疗耳在低频率的阈值(72±7dB，65±9dB，78±7dB，在4、8、16kHz)相比对侧的耳朵(84±7dB，82±6dB，87±5dB，在4、8、16kHz)仍然较低(图7b)。

进一步进行了clickABR听力测试，发现注射后4周和8周，注射小鼠耳内阈值明显降低，这与纯音ABR结果一致，即注射AAV-CasRx+sgRNA3减缓了Bth小鼠的进行性听力损失(图7c)。在注射后的第4周，与未注射Bth小鼠相比，注射AAV-CasRx+sgRNA3的Bth小鼠在80dB和90dB的clickABR峰一波振幅增加，注射的Bth小鼠一波整体趋于正常(图8c，d)。

我们还测量了DPOAEs来评估OHCs的功能(图7d)。在注射后4和8周，注射AAV-CasRx+sgRNA3的小鼠耳朵在8kHz和16kHz具有更低的DPOAE阈值(65±10dB、71±9dB，8kHz和16kHz，4周；76±5dB和79±3dB，8kHz和16kHz，8周)，而未注射耳未测出DPOAE，表现出OHCs功能的缺失。这些结果表明，AAV-CasRx+sgRNA3介导的mRNA敲除能改善听力功能达到8周以上。

(四)CasRx介导的毛细胞和静纤毛束形态的保护

为了确定CasRx和sgRNA3是否能够保护毛细胞和纤毛束形态，我们在10周龄时处死小鼠，进行共聚焦和扫描电镜(SEM)分析。发现Corti器官顶圈(8kHz区域)的OHCs开始丢失，从中圈(16kHz区域)到底圈(32kHz区域)的OHCs丢失更为严重，在底圈(32kHz区域)几乎没有OHCs(图9a)。顶圈IHCs保持完整，中圈IHCs丢失，底圈IHCs完全缺失(图9a)。这些结果与之前的研究结果一致。在耳蜗注射AAV-CasRx+sgRNA3后，IHCs和OHCs的存活率均有提高，在8kHz和16kHz区域，耳蜗每100μm OHCs的数量均有增加(37.0±1.6，39.8±1.6相比于26.2±10.1，22.6±9.1)，而在16kHz区域免疫组化数量增加(11.4±2.5相比于1.2±1.3)(图9b)。

然后用扫描电镜观察纤毛束形态。野生型Tmc1^+/+小鼠10周龄时OHCs和IHCs排列整齐，而未注射的小鼠出现严重的纤毛紊乱。AAV-CasRx+sgRNA3注射后顶圈IHCs和OHCs形态都保持正常(图9c)，且中圈保留了纤毛束(图10)。这些结果与ABR数据显示在较低频率区域(4-8kHz)对听力的保护是一致的。

(五)体内CASRx介导的RNA敲除的脱靶分析

我们对AAV注射后2周收集的耳蜗进行RNA测序。通过小鼠全基因组比对sgRNA30bp序列，筛选出最可能脱靶的10个基因(图11a)，并分析注射AAV-CasRx+sgRNA3组(n＝3只小鼠)与未注射组(n＝3只小鼠)的表达差异。10个基因中有9个基因的RNA表达没有区别，其中一个基因(Gm13492)未检测到(图11b和表4)。尽管如此，RNA表达总体基本没有差异，表明CASRx介导的RNA敲除没有脱靶效应。

表4

结论：

TMC1突变占全球遗传性听力损失病例的4％-8％。在本发明中，我们使用CRISPR-CasRx系统在人遗传性耳聋的Bth小鼠模型中下调了Tmc1^Bth mRNA的转录本，但没有下调Tmc1⁺的转录本(两种转录本之间只有单一的碱基差异)。以毛细胞为靶点采用一种新的、高效的AAV-PHP.eB递送系统将CasRx和sgRNA3递送到Bth小鼠耳蜗，通过提高毛细胞存活和改善纤毛束紊乱，从而保护听觉功能。这些结果表明，CasRx系统可以通过特异性敲除突变体转录本，从而成功改善显性-负效应听力损失。

研究结果表明，CasRx RNA编辑系统显示了很高的敲除效率，将编码外源的Tmc1序列、CasRx和sgRNA的载体共转染到293T细胞中，可使Tmc1^Bth mRNA转录本敲除80％以上。CasRx RNA在体内也显示超过70％的RNA敲除率，两个主要因素决定了高效的敲除结果：第一，CasRx是Cas13家族中最小的蛋白，这使得它很容易被包装进一个的AAV中；第二，不同的AAV血清型具有不同的转染效率，几种改进的AAV已经被证实能安全有效地将基因送入内耳。我们之前证明了AAV-PHP.eB载体在体内耳蜗IHCs和OHCs中具有极高的转导效率，它可以将CasRx和sgRNA传递到毛细胞，转导效率超过95％(图5)。

CASRx介导的RNA敲除可改善Bth小鼠的听觉功能。在我们的结果中，我们检测到Bth小鼠的听力在8周时改善了约10-20dB，在12周时仍然可以防止听力损失(数据未显示)，表明其听力保护效果与基于Cas9的DNA编辑技术相当。治疗组内耳的IHCs和OHCs数量多于未处理组耳，这与听力改善基本一致。在基底膜底圈，Bth小鼠的静纤毛束紊乱，这阻止了声音的传播，从而在低频时产生更高的ABR阈值。这就解释了为什么虽然有毛细胞存在，但低频时的听觉阈值却很高。结果表明，在底圈部位，注射耳的IHCs和OHCs的纤毛束形态明显好于未注射耳，低频时听力保持良好。此外，注射对照组AAV(AAV-CasRx+NT)并不能改善杂合小鼠的听力(图8a)，然后我们在野生型小鼠上注射AAV-CasRx+sgRNA3和对照AAV，发现与未注射的小鼠相比，没有观察到ABR阈值的变化(图8b)。说明AAV-CasRx+sgRNA3特异性地抑制了听力损失，且注射AAV-CasRx+sgRNA3是安全的，不影响正常听力功能。尽管取得了积极的结果，但我们仍然发现，与野生型小鼠相比，注射AAV-CasRx+sgRNA3仍然不能完全恢复听觉功能，特别是在高频区域。在今后的工作中，需要利用更有效的AAV载体来提高靶向效率，以更大程度地恢复听觉功能。

基于CasRx系统的RNA编辑技术在疾病治疗中具有一定的优势。在RNA表达水平上，与RNA干扰敲除相比，CasRx介导的敲除可以显著减少脱靶效应。我们的RNA-seq数据也表明很少脱靶效应。在基因编辑水平上，使用CRISPR系统靶向RNA可以避免永久改变DNA相关的风险。本发明上述研究也比较了CasRx和PspCas13b系统，发现CasRx具有更高的效率(如图2b,c)和特异性(如图2d)。最近的一项研究表明，CasRx没有毒性作用，而PguCas13b和PspCas13b对胚胎发育产生负面影响。这些发现表明，CasRx系统在未来应用于临床治疗时，可能是一种安全、高效的RNA敲除工具。

综上所述，本发明很好应用了CasRx RNA来敲除治疗显性-负效应听力损失，这表明，CasRx在未来治疗人类显性-负效应听力损失方面具有巨大的潜力。

序列表

<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院

<120> 基于CRISPR/CasRx的基因编辑方法及其应用

<141> 2021-08-11

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

caaataagtc aaacagggtg ggacagaact 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aaataagtca aacagggtgg gacagaactt 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aataagtcaa acagggtggg acagaacttc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ataagtcaaa cagggtggga cagaacttcc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

taagtcaaac agggtgggac agaacttccc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aagtcaaaca gggtgggaca gaacttcccc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

agtcaaacag ggtgggacag aacttcccca 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtcaaacagg gtgggacaga acttccccag 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tcaaacaggg tgggacagaa cttccccagg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caaacagggt gggacagaac ttccccagga 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aaacagggtg ggacagaact tccccaggag 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aacagggtgg gacagaactt ccccaggagg 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

acagggtggg acagaacttc cccaggaggg 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cagggtggga cagaacttcc ccaggaggga 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

agggtgggac agaacttccc caggagggac 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gggtgggaca gaacttcccc aggagggaca 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ggtgggacag aacttcccca ggagggacat 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gtgggacaga acttccccag gagggacatt 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

tgggacagaa cttccccagg agggacatta 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gggacagaac ttccccagga gggacattac 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggacagaact tccccaggag ggacattacc 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gacagaactt ccccaggagg gacattacca 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

acagaacttc cccaggaggg acattaccat 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

cagaacttcc ccaggaggga cattaccatg 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

agaacttccc caggagggac attaccatgt 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

gaacttcccc aggagggaca ttaccatgtt 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

aacttcccca ggagggacat taccatgttc 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

acttccccag gagggacatt accatgttca 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

cttccccagg agggacatta ccatgttcat 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

ttccccagga gggacattac catgttcatt 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

accaggatgg gcaccacccc ggtgaacagc 30

<210> 32

<211> 6367

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

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aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaacgg gccctctaga ctcgagatgg tgagcaaggg cgaggaggat aacatggcca 960

tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc acatggaggg ctccgtgaac ggccacgagt 1020

tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc gccaagctga 1080

aggtgaccaa gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtcccct cagttcatgt 1140

acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacttg aagctgtcct 1200

tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggtgaccg 1260

tgacccagga ctcctccctg caggacggcg agttcatcta caaggtgaag ctgcgcggca 1320

ccaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcct 1380

ccgagcggat gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga gatcaagcag aggctgaagc 1440

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actacaccat cgtggaacag tacgaacgcg ccgagggccg ccactccacc ggcggcatgg 1620

acgagctgta caagagtgga tacctcatct tttgggctgt gaagcgatcc caggagttcg 1680

cccagcaaga tcctgacacc cttgggtggt gggaaaaaaa tgaaatgaac atggtaatgt 1740

ccctcctggg gaagttctgt cccaccctgt ttgacttatt tgctgaactg gaagattacc 1800

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tgtatgtatt cattctcgcc ttgatggatg agattaacaa caagattgaa gaggagaagc 1920

ttgtgaaggc caataagctt aagtttaaac cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt 1980

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cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 2100

tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 2160

aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc 2220

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ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 2400

ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat 2460

ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc 2520

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tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg 2640

atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa 2700

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ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca 2820

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ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct 3000

tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg atctgatcaa gagacaggat 3060

gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 3120

tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 3180

tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 3240

ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 3300

cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 3360

aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 3420

tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 3480

aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 3540

atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 3600

cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 3660

tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 3720

accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 3780

gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 3840

tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca 3900

agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt 3960

gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat 4020

gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 4080

caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 4140

gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt 4200

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 4260

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 4320

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 4380

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 4440

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ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 4560

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 4620

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cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 4740

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 4800

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 4860

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 4920

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 4980

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 5040

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aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtttttttgt 5160

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 5220

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 5280

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 5340

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 5400

ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 5460

tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 5520

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 5580

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 5640

aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 5700

gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 5760

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 5820

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 5880

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 5940

ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 6000

cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 6060

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 6120

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 6180

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 6240

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 6300

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 6360

tgacgtc 6367

<210> 33

<211> 6367

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaacgg gccctctaga ctcgagatgg tgagcaaggg cgaggaggat aacatggcca 960

tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc acatggaggg ctccgtgaac ggccacgagt 1020

tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc gccaagctga 1080

aggtgaccaa gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtcccct cagttcatgt 1140

acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacttg aagctgtcct 1200

tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggtgaccg 1260

tgacccagga ctcctccctg caggacggcg agttcatcta caaggtgaag ctgcgcggca 1320

ccaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcct 1380

ccgagcggat gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga gatcaagcag aggctgaagc 1440

tgaaggacgg cggccactac gacgctgagg tcaagaccac ctacaaggcc aagaagcccg 1500

tgcagctgcc cggcgcctac aacgtcaaca tcaagttgga catcacctcc cacaacgagg 1560

actacaccat cgtggaacag tacgaacgcg ccgagggccg ccactccacc ggcggcatgg 1620

acgagctgta caagagtgga tacctcatct tttgggctgt gaagcgatcc caggagttcg 1680

cccagcaaga tcctgacacc cttgggtggt gggaaaaaaa tgaaatgaac atggtaatgt 1740

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cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 2100

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ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 2400

ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat 2460

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tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg 2640

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ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct 3000

tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg atctgatcaa gagacaggat 3060

gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 3120

tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 3180

tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 3240

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aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 3420

tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 3480

aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 3540

atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 3600

cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 3660

tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 3720

accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 3780

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tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca 3900

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gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat 4020

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gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt 4200

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 4260

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cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 4380

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 4440

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 4500

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 4560

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 4620

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 4680

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 4740

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 4800

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 4860

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<210> 34

<211> 8830

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

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<400> 35

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tcatcagact gaccgtggac gacatgctga ccgacaccga gcggagaatc aagagattca 3540

aggacgaccg gaagtccatt cggagcgccg acaacaagat gggaaagaga ggcttcaagc 3600

agatctccac aggcaagctg gccgacttcc tggccaagga catcgtgctg tttcagccca 3660

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acctgaagtc cctgccacag atggaaggca tcgacttcaa caatgccaac gtgacctatc 4140

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accgcaacta ccggtacatg gacatgctta agggcgagta cgacagaaag ggctccctgc 4260

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ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 5940

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 6000

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggataac tttaaataat 6060

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tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 6660

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 6720

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tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 6840

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tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 6960

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<210> 36

<211> 4995

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

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tgggactcgc acattcttca cgtccgttcg cagcgtcacc cggatcttcg ccgctaccct 3420

tgtgggcccc ccggcgacgc ttcctgctcc gcccctaagt cgggaaggtt ccttgcggtt 3480

cgcggcgtgc cggacgtgac aaacggaagc cgcacgtctc actagtaccc tcgcagacgg 3540

acagcgccag ggagcaatgg cagcgcgccg accgcgatgg gctgtggcca atagcggctg 3600

ctcagcaggg cgcgccgaga gcagcggccg ggaaggggcg gtgcgggagg cggggtgtgg 3660

ggcggtagtg tgggccctgt tcctgcccgc gcggtgttcc gcattctgca agcctccgga 3720

gcgcacgtcg gcagtcggct ccctcgttga ccgaatcacc gacctctctc cccaggggga 3780

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cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 4020

ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca 4080

ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt 4140

cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 4200

caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 4260

cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 4320

cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 4380

gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 4440

gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 4500

cgagctgtac aagtaacgcc cgccccacga cccgcagcgc ccgaccgaaa ggagcgcacg 4560

accccatgca tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 4620

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<210> 37

<211> 4814

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

ggtaccgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcacg agactagcct cgagcggccg 60

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tgtggaaagg acgaaacacc gaagtcttcg atatcgaaga cttgttgtgg aaggtccagt 360

tttgaggggc tattacaact ttttttaaag aattctcgac ctcgagacaa atggcagtat 420

tcatccacaa ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag 480

tagacataat agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc 540

aaaattttcg ggtttattac agggacagca gagatccact ttggccgcgg ctcgaggggg 600

ttggggttgc gccttttcca aggcagccct gggtttgcgc agggacgcgg ctgctctggg 660

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ccgcccctaa gtcgggaagg ttccttgcgg ttcgcggcgt gccggacgtg acaaacggaa 840

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cgaccgcgat gggctgtggc caatagcggc tgctcagcag ggcgcgccga gagcagcggc 960

cgggaagggg cggtgcggga ggcggggtgt ggggcggtag tgtgggccct gttcctgccc 1020

gcgcggtgtt ccgcattctg caagcctccg gagcgcacgt cggcagtcgg ctccctcgtt 1080

gaccgaatca ccgacctctc tccccagggg gatccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc 1140

tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt 1200

tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca 1260

tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg 1320

gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg 1380

ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca 1440

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gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca 1560

gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga 1620

tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc 1680

ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc 1740

tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg 1800

ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaagt acctttaaga ccaatgactt 1860

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gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa 1980

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aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg 2100

gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggtc gcttcctcgc tcactgactc 2160

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 2220

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 2280

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 2340

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 2400

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 2460

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg 2520

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 2580

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 2640

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 2700

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 2760

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 2820

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 2880

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 2940

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 3000

cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 3060

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 3120

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 3180

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgggac ccacgctcac cggctccaga 3240

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 3300

atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 3360

taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 3420

tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 3480

gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 3540

cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 3600

cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 3660

gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 3720

aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 3780

accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 3840

ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 3900

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