一种重组miR-218及其生产方法和在毛发再生中的应用
阅读说明：本技术 一种重组miR-218及其生产方法和在毛发再生中的应用 (Recombinant miR-218, production method thereof and application thereof in hair regeneration ) 是由 骞爱荣 陈志浩 田野 谭慎行 骞婧 韩江帆 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组miR-218,所述重组miR-218的序列如SEQ ID NO：1所示,或者为与SEQ ID NO：1所示序列相似度达90％以上的序列。另外,本发明还公开了该重组miR-218的生产方法及在毛发再生中的应用。本发明采用tRNA为支架,嵌合miR-218序列,在大肠杆菌中表达重组miR-218。本发明制备的重组miR-218外用喷洒到脱毛的C57BL/6小鼠背部。结果证明了重组miR-218能够显著促进毛发再生。本发明制备的重组miR-218通过生物工程技术获得,具有生物学活性高、设备便捷、生产快、产量高、成本低、功能性好等优点。(The invention discloses a recombinant miR-218, wherein the sequence of the recombinant miR-218 is shown in SEQ ID NO: 1 or a sequence similar to SEQ ID NO: 1 with a sequence similarity of more than 90%. In addition, the invention also discloses a production method of the recombinant miR-218 and an application of the recombinant miR-218 in hair regeneration. The invention adopts tRNA as a bracket, is embedded with a miR-218 sequence, and expresses recombinant miR-218 in escherichia coli. The recombinant miR-218 prepared by the invention is externally sprayed on the back of a unhaired C57BL/6 mouse. The results prove that the recombinant miR-218 can remarkably promote hair regeneration. The recombinant miR-218 prepared by the invention is obtained by a bioengineering technology, and has the advantages of high biological activity, convenient equipment, fast production, high yield, low cost, good functionality and the like.)
技术领域
本发明属于分子生物学及医学技术领域，具体涉及一种重组miR-218及其生产方法和在毛发再生中的应用。
背景技术
毛发疾病是临床上常见的皮肤性疾病，尤其以脱发最为常见。近年来，发病率随着人们生活节奏的加快和饮食结构的改变呈逐年上升的趋势。脱发的发病机制尚不完全清楚，现在认为可能是遗传背景与外在环境相互作用的结果，与自体的免疫紊乱、精神压力过大和机体疲劳有关，也可能与毛囊生长周期的紊乱和毛囊退行性改变的启动有关，但直到目前为止，对其尚无有效的预防和治疗方法。受中度脱发影响的人转向局部治疗，如米诺地尔(抗高血压钾通道开放剂)和非那雄胺(治疗前列腺增生)，因为两者都不是为脱发治疗而设计的，所以不是非常有效，而且还需要使用者不断重新涂抹以维持毛发生长。
微小RNA(miRNA)存在于所有后生动物基因组中，并在mRNA的降解和基因调控中发挥作用，在许多生物过程中起着关键作用。在皮肤和毛囊的生物学中，研究人员关注miRNA在皮肤形态发生和分化、毛囊(HF)发育、毛发周期和毛发色素沉着中的作用。毛囊是一个复杂的生物系统，涉及由基因调控的动态过程。研究发现，miR-218通过靶向SFRP2正向调控Wnt信号通路，并在皮肤和毛囊发育过程中发挥动态调控作用。SFRP2在毛囊的真皮乳头中起着核心作用，可以通过Wnt/β-catenin信号通路增强Wnt3a以增加培养的人真皮乳头细胞的活性；SFRP2还是维持毛囊发育生理机能的关键因素。
RNA类的新药或化妆品的应用开发以及RNA的功能研究已经掣肘于RNA原料的获取。目前RNA主要采用化学或体外转录合成。这些合成方法生产的RNA，不仅价格昂贵产率低，而且为提高稳定性可能带有较多的人工基因修饰，造成RNA折叠、生物活性及安全性受到影响。因此，新兴技术生物合成重组RNA的介入，降低RNA原料成本，同时还提高了RNA的生物活性和安全性。利用内源性重组tRNA支架在活细胞内生产表达小分子RNA已经应用于多个研究领域，均取得了良好的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种重组miR-218及其生产方法和应用。本发明以人丝氨酸tRNA嵌合has-miR-34a前体，人丝氨酸tRNA为人源tRNA，用其作为支架生产的重组小RNA的开发前景更好，因为人体细胞中本身含有丝氨酸tRNA，但无细菌来源的甲硫氨酰tRNA，因此用人丝氨酸tRNA为支架其毒性及免疫原性可能更低。本发明缩短了所表达的重组tRNA的长度，从而降低了细胞毒性，提高了表达量。本发明对has-miR-34a前体中的序列进行改造，改善互补配对，提高重组miR-218的稳定性。通过生物工程获得的重组miR-218具有较好的生物学活性，miR-218通过Wnt/β-catenin信号通路的正向调节激活了皮肤发育、毛囊生长和毛发周期的作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种重组miR-218，其特征在于，所述重组miR-218的序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1所示序列相似度达90％以上的序列。
另外，本发明还提供了一种上述重组miR-218的生产方法，其特征在于，包括将设计的重组miR-218序列嵌合于tRNA支架，在大肠杆菌中重组表达。
上述的生产方法，其特征在于，所述tRNA支架的序列为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90％以上的序列，所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO：2所示。
上述的生产方法，其特征在于，所述生产方法的具体步骤包括：
步骤一、设计合成嵌合miR-218序列的hsa-miR-34a重组序列；
步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将步骤一中的重组序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；
步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；
步骤四、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标重组miR-218。
进一步地，本发明提供了一种上述重组miR-218在制备促进毛发再生和/或治疗脱发的前药、药物、原料药或药物组合中的应用，以及在制备养发、生发、育发或护发产品中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明对has-miR-34a前体中的序列进行改造，改善互补配对，提高重组miR-218的稳定性。
2、本发明以人丝氨酸tRNA嵌合has-miR-34a前体，人丝氨酸tRNA为人源tRNA，用其作为支架生产的重组小RNA的开发前景更好，因为人体细胞中本身含有丝氨酸tRNA，但无细菌来源的甲硫氨酰tRNA，因此用人丝氨酸tRNA为支架其毒性和免疫原性均可更低。
3、本发明利用tRNA支架(Optimal noncoding RNA Scraffold，OnRS)表达的具有生物学活性的miR-218，生产工艺简单、产量高、性价比高，安全性高。
4、本发明设计制备的重组miR-218具有较好的生物学活性，miR-218通过Wnt/β-catenin信号通路的正向调节激活了皮肤发育、毛囊生长和毛发周期的作用，能够促进毛囊干细胞的再生，促进毛发的生长，发挥生发的作用。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是本发明实施例1利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定检测大肠杆菌中重组mir-218的表达。
图2是本实施例以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度
图3是本发明利用Bio-Rad NGCTM Chromatography System纯化重组miR-218的FPLC色谱图。
图4是发明实施例3利用外用喷洒方法在背部脱毛C57BL6小鼠进行治疗实验，通过20天连续监测小鼠背部毛发生长实验结果图。
图5是发明实施例3利用外用喷洒方法在背部脱毛C57BL6小鼠进行治疗实验，通过20天连续拍照小鼠背部毛发生长实验结果数据分析统计图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1：以pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体构建重组miR-218质粒，表达重组miR-218。
(1)根据重组miR-218序列(SEQ ID NO：1)，以及pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体上的序列设计引物，命名为mir-34a/重组miR-218，同时在引物的两端加上1-15nt载体插入位点两侧的同源序列。设计合成嵌合miR-218序列的hsa-miR-34a重组序列。
表1mir-34a/miR-218引物
(2)插入片段的合成
以两条引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)互为模板，利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将重组序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；反应体系如表2所示，反应过程如表3所示：
表2聚合酶体外扩增链反应体系(50μL)
表3聚合酶体外扩增链反应过程
(3)pBSKrnaSeph/has-mir-34a载体的双酶切
用Eag I-HFTM，Sac II限制性内切酶对载体进行37℃酶切，反应体系如表4所示。
表4 50μL双酶切体系
(4)酶切质粒以及PCR片段的回收及纯化
将PCR产物和酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用OMEGA公司的胶回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)进行回收纯化。
(5)插入片段与载体的连接
胶回收片段用Ligation-Free Cloning System进行连接，反应体系如表5所示。
表5无缝连接反应体系(20μL)
混匀后，置于37℃孵育30min；转化大肠杆菌HST08感受态细菌；对克隆菌落进行氨苄青霉素抗性筛选。
(6)DNA测序鉴定重组miR-218表达载体
挑取单克隆菌落，于含有氨苄的LB培养基中培养约3h。取100μL菌液，送擎科生物科技有限公司，用测序引物进行DNA测序鉴定。
实施例2：重组miR-218的表达
(1)200ng重组miR-218表达质粒转化HST08感受态细菌后，加入5mL LB培养基在37℃，200rpm震荡培养过夜。菌液经10000g离心2min后，收集沉淀。于沉淀中加入180μL 10mM醋酸镁-Tris·HCl溶液重悬，再加入200μL的饱和苯酚，室温振摇20-60min。10000g离心10min后收集水相，加入0.1倍水相体积的5M NaCl沉淀大分子杂质。上清液再加入2倍体积无水乙醇，10000g离心10min后，弃掉上清。吸水纸吸干残留乙醇，待RNA干燥后加入DEPC水溶解RNA，测定浓度，-80℃冰箱保存。
(2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
将2μg RNA样品与2x RNA上样缓冲液混合，加入变性胶样品孔内。120～150V电泳40～60min后，放入含0.5μg/mL溴化乙锭的溶液中轻摇20～30min，于凝胶成像系统下观测，拍照保存。
图1是本实施例利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组miR-218的表达。图中M表示RNA marker；1表示野生型HST08 E.coli总RNA；2表示重组miR-218表达质粒转化的HST08 E.coli后的总RNA。与未转化重组miR-218表达质粒的细菌总RNA相比，转化后的细菌总RNA在150-300nt之间多了一条条带。结果表明，重组miR-218表达质粒在大肠杆菌中可以高表达重组miR-218。
实施例3：HPLC纯化重组miR-218
(1)采用Bio-Rad NGCTM Chromatography System，以离子交换柱(ENrichTMQ10×100Column)纯化重组miR-218。
流动相A：10mM NaH2PO4溶液，pH7.0。流动相B：10mM NaH2PO4溶液，1M NaCl溶液，pH7.0。
流速为2.0mL/min。以DEPC水，流动相A，流动相B分别交替冲洗色谱柱约1h。每次冲洗5柱体积。
以260nm的吸光度检测RNA，并收集重组RNA所对应的峰。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。
(2)RNA样品处理方法
总RNA提取步骤同上。所提取的总RNA于4℃13000rpm离心10min后，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，每次进样5-10mg。
(3)HPLC组分收集及浓缩去盐
以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。混合后的各组分用2倍体积无水乙醇沉淀RNA，-80℃冰箱放置约1h。以10000g转速于4℃离心10min收集RNA。将所得RNA沉淀用DEPC水溶解，用tra-2mL Centrifugal Filters 4℃7500g离心10min，去滤液，重复此步骤直至所有溶液离心完，再将Filters倒置，2000g离心2min，收集所得溶液，测定浓度后于-80℃保存。
图2是本实施例利用Bio-Rad NGCTM Chromatography System纯化重组miR-218，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。结果表明，经HPLC纯化后，可得到高纯的重组miR-218。
图3是本发明利用Bio-Rad NGCTM Chromatography System纯化重组miR-218的HPLC色谱图。目标RNA与细菌总RNA中的其他内源性RNA得到了良好的分离，且通过峰面积积分所示目标RNA的表达在细菌总RNA中大于15％。
实施例4：重组miR-218对背部脱毛C57BL6小鼠毛发生长实验
实验分为：空白对照组(PBS溶液)和治疗组(重组miR-218)。购买30只3月龄健康C57BL6雄性小鼠为实验动物，每组随机取10只。在不损伤表皮情况下选取背部脊柱两侧皮肤部位脱毛。造模结束后按照不同分组进行给药治疗。空白对照组喷涂PBS，治疗组喷涂重组miR-218溶液，每只小鼠给药剂量1mL，喷涂于实验动物背部去毛皮肤后按摩1分钟促进皮肤吸收，每日1次，浓度10μg/mL，持续20天，每天采用照相机拍照。
如图4所示，与PBS空白对照组相比，重组miR-218的治疗组随着时间增加，都不同程度的促进毛发再生，20d时效果非常明显。
如图5所示，第10、15和20天头发覆盖率的量化。重组mir-218的治疗组在20d时新生毛发覆盖率在60％以上，与对照组小鼠新生毛发覆盖率有显著性差异。*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001。
实施例5：重组miR-218对脱发患者的治疗作用
为了验证重组miR-218的生发效果的效果，选取8名年龄在30-60岁之间的患有脱发症的志愿者。用前清洗脱发患者头皮，吹干。根据脱发皮肤面积大小，将1mL左右生发素喷于脱发患者头皮裸露部位，晾干，每天1次。过程中配合按摩或者其他刺激头皮方法促进样品吸收，样品在头皮表面停留8小时以上洗头。持续喷28天。每天在同一条件下进行拍照，记录毛发变化。
采用计算机分析毛发变化：
第一步：手动选取相同部位大小相近的区域(拍摄角度也要尽量保持一致)进行接下去的运算。
第二步：将已选区域转化为灰度图像以避免颜色产生的干扰。
第三步：对图像进行标准化处理以减少全局光照的影响。具体公式如下：
第四步：计算图像中黑色像素(代表头发)的占比，公式如下：
result＝1-mean(Xnew)
如表所示，8名受试者，有6名受试者，使用后黑色像素增加。有效率达75％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西北工业大学
<120> 一种重组miR-218及其生产方法和在毛发再生中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 180
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcuacguag cucaguuggu uagagcagcg gccgggccag cugugagugu uucuuuugug 60
cuugaucuaa ccauguuugu gagcaauagu aaggaagaac augguuagau caagcacaaa 120
gaagugcugc acguuguugg cccccgcggg ucacagguuc gaaucccguc guagccacca 180
<210> 2
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacunnnn nnnnnnnnnn nnaauccaau 60
ggggucuccc cgcgcagguu cgaacccugc ucgcugcgcc annn 104
<210> 3
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgtaacgct gaattcggct acgtagctca gttggttaga gcagcggccg ggccagctgt 60
gagtgtttct tttgtgcttg atctaaccat gtttgtgagc aatagtaagg aag 113
<210> 4
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctttcgctaa ggatctgcag tggtggctac gacgggattc gaacctgtga cccgcggggg 60
ccaacaacgt gcagcacttc tttgtgcttg atctaaccat gttcttcctt actattgc 118