具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

所述柠檬酸钠二水合物、硝酸铬三水合物(Cr(NO₃)₃·9H₂O)、荧光素钠、罗丹明B、吖啶橙、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、冰乙酸、谷胱甘肽(GSH) 和所有使用的金属盐均购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)且所有产品均为分析纯；所述寡核苷酸均由SangonBiotechnology Co.，Ltd.(中国上海)合成，四个寡核苷酸(T33、A33、C33和G33)在5'端具有羧基荧光素(FAM)-标记。所述A33、T33和C33分别代表包含33个连续的A，T和C的序列。所述G33 代表GGGGGGTGGGGGGGGGGGGGGGTGGGGGGTGGGGG序列；所述水溶液均采用Milli-Q系统(美国马萨诸塞州贝德福德的Millipore，18.2MΩ·cm)产生的超纯水制备。

所述ssDNA意为单链DNA；所述加标回收率是指在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。所述T-Hg²⁺-T发夹结构是指胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶(T-Hg²⁺-T)配位现象，由Hg²⁺取代亚氨基质子与胸腺嘧啶的N3结合并连接两个胸腺嘧啶残基形成。

实施例1：氧化铬纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)的制备方法

(1)Cr(NO₃)₃·9H₂O水溶液(20mM)用Galanz HP3(S0)家用微波炉(中国)在700W功率下加热约2分钟。当溶液沸腾且出现大量均匀气泡时停止加热并将其取出，立即添加柠檬酸钠(20mM)水溶液，继续将混合溶液在700W 下微波加热1.5分钟，取出并在黑暗中冷却至室温。随后，将混合物在15,000RCF 下离心20分钟，离心后沉淀为蓝绿色，表明微波加热可能诱导Cr³⁺和柠檬酸钠反应形成胶体。再用超纯水洗涤两次，得产物。最后，将蓝绿色产物重新分散在最终浓度为200mM的超纯水中，即可得到纯化的氧化铬纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)。

(2)为检测Cr₂O₃ NPs的吸收光谱和荧光光谱，取制备所得的氧化铬纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)放在干净的硅片或铜网上并自然干燥后，用SU8010场发射扫描电子显微镜(SEM，日本日立)、Tecnai G2 F20透射电子显微镜(TEM，FEI，美国)和能量分散光谱仪(EDS)观察纯化的Cr₂O₃ NPs样品。使用Image J软件测量SEM(至少500个粒子)和TEM(至少300个粒子)图像，并通过高斯拟合计算它们的粒径分布。

使用微观形态学和化学组成分析来表征获得的蓝绿色胶体。所得胶体溶液具有明显的丁达尔效应，颜色为灰白色，在190-900nm范围内有宽吸收带且峰值在230nm处(图1A)。图1B中的SEM图像证实，所获得的胶体大部分是光滑且规则的球形颗粒，平均直径为123.68±3.45nm(N＝500，R²＝0.980，图 1D)。图1C中的TEM图像还显示，所获得的胶体是单分散且均匀的纳米颗粒，尺寸范围为80-300nm，平均直径为140.06±4.27nm(N＝300，R²＝0.986，图 1E)，与SEM结果一致。

(3)通过X射线衍射(XRD)系统(德国Bruker D8)，IS10傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪(美国尼古拉)，ESCALAB 250xi X射线光电子能谱仪(XPS，美国赛默飞世尔科技公司)测量了Cr₂O₃ NPs的晶相，表面官能团和元素组成。

XRD光谱分析表明，2θ值为32.06°、32.98°和75.26°分别对应于Cr₂O₃纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)的(111)、(202)和(311)的晶面(图2A，注意21.42°， 61.70°和69.32°处的峰可归因于SiO₂基底)。Cr₂O₃ NPs的化学官能团的FT-IR分析显示，Cr₂O₃ NPs在3415.10、1386.32、961.82、552.51和518cm^-1处有很强的吸收带(图2B)。羟基和Cr-O畸变振动的特征带分别位于3405-3425cm^-1和 550-565cm^-1区域，吸收带位于1385-1395cm^-1区域可能是羧酸根离子，位于 940-975cm^-1和515-530cm^-1区域的峰分别对应于Cr₂O₃ NPs的拉伸振动和弯曲振动。TEM附带的EDS元素分析(图2C)显示，Cr₂O₃ NPs中存在C，O，Cr， Na，Cu元素，其中Cu、C和Na可以归因于覆盖在纳米颗粒表面的铜网和柠檬酸钠。图2D中Cr₂O₃ NPs的XPS光谱显示在99.08、285.08、400.08、532.08、 577.08和1071.08eV处有几个明显的峰，证明存在Si2p、C 1s(46.26％)、O 1s (45.67％)、N 1s(3.01％)、Cr 2p(5.06％)和Na 1s，与柠檬酸钠涂覆的Cr₂O₃NPs的元素组成一致(请注意，Si和N的存在分别与硅片和微波加热产生的有机氮有关)。对C1s、O 1s、N 1s和Cr 2p的高分辨率核能级谱进行扫描，去卷积和拟合以进一步鉴定元素形式。C 1s的核心能谱(图2E)可以分解为四个不同的峰，分别对应于C-O/C-N(284.83eV)、C-N(286.28eV)、C-O(288.33eV) 键；图2F中的N1s核心能谱在399.83eV和401.78eV处出现两个峰，分别归因于C-N-C和N-H键；O 1s核心能谱可以分解为C＝O(531.48eV)，-OH(533.03 eV)和-COOH(535.38eV)(图2G)。Cr₂O₃ NPs的Cr 2p核心能谱(图2H) 表明，Cr₂O₃ NPs中存在三种不同的铬元素态，包括Cr金属键(574.28eV)、CrO₃(589.28eV)和Cr₂O₃(576.38、577.08、579.83、584.38和586.73eV)。根据 Cr 2p信号，我们制备的纳米颗粒中Cr₂O₃，CrO₃和金属Cr的比例分别为90.19％， 5.41％和4.40％。以上结果表明，通过微波加热Cr³⁺和柠檬酸钠所得到的纳米颗粒是柠檬酸盐涂覆的Cr₂O₃ NPs。

实施例2：不同比例的柠檬酸钠和Cr(NO₃)₃·9H₂O对微波加热诱导胶体形成的影响

采用实施例1的方法微波检测加热对柠檬酸钠(20、40、100、200mM)和 Cr(NO₃)₃·9H₂O(20mM)的四种不同比例(1：1、2：1、5：1、10：1)的影响。

如图3所示：

在微波加热下，四种不同比例(柠檬酸钠：Cr³⁺＝1：1、2：1、5：1、10： 1)的反应溶液均产生了丁达尔效应。

如图4所示：

SEM图像显示四种不同比例的柠檬酸钠和硝酸铬(10：1、5：1、2：1、1： 1)对所得纳米颗粒的形态没有显著影响，大部分纳米粒子仍是规则的球形颗粒，但四种不同比例的纳米颗粒的平均直径略有不同。

实施例3：检测氧化铬纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)的荧光猝灭能力

选择三种常见的荧光染料和四种FAM标记的ssDNA(T33，A33，C33和 G33)来评估实施例1制备所得的氧化铬纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)的荧光猝灭能力。

将400μL荧光素钠(0.5μM)，若丹明B(1.25μM)，吖啶橙(2μM)，FAM 标记的ssDNA(T33、A33、C33和G33；100nM)溶液添加到2-mm狭缝微量荧光比色杯中，并且在不同的激发波长(475、550、490、485nm)下分别在495-700 nm、565-700nm和510-700nm的范围内测量上述溶液的荧光发射光谱。随后，将不同浓度的Cr₂O₃ NPs添加到上述溶液中，并在相同条件下测量混合物的荧光发射光谱。

结果显示，随着Cr₂O₃ NPs浓度的增加，染料的荧光逐渐被猝灭(图5A)，它们的猝灭率分别为70.8％、51％和43％(图5B)，并且三种染料(荧光素钠，红线；罗丹明B，绿线；吖啶橙，蓝线)的荧光发射光谱在500至700nm处与 Cr₂O₃ NPs吸收带(黑线)重叠。这证明Cr₂O₃NPs(柠檬酸盐：Cr³⁺＝1：1)具有广泛的荧光猝灭能力，可以用作各种荧光分子的潜在猝灭剂。但是，Cr₂O₃ NPs (柠檬酸盐：Cr³⁺＝10：1)对荧光素钠的荧光具有一定的增强作用。这意味着不同比例的Cr₂O₃ NPs对荧光染料的影响不同。

如图5C所示，FAM荧光标记的A33、T33、C33和G33均可被Cr₂O₃ NPs 猝灭，并且随着Cr₂O₃ NPs浓度的持续增加，荧光猝灭程度变得更明显。Cr₂O₃ NPs 对FAM标记的DNA的猝灭效率低于单独的荧光素钠(图5D)，这可能归因于游离单链DNA分子引起的位阻。且，Cr₂O₃NPs在不同温度下对T33的 Stern–Volmer常数(K_SV)在25℃为0.0296L/mmol，在35℃为0.0210L/mmol，在45℃为0.0192L/mmol，随温度的升高而降低，表明Cr₂O₃ NPs和T33之间形成了静态猝灭复合物。静态猝灭常数(K_P)和结合常数K_A在25℃下分别为 0.0218和0.0212L/mmol，在35℃下为0.0166和0.0179L/mmol，在45℃下为 0.0155和0.0224L/mmol。

试验例1：DNA-Cr₂O₃ NPs复合物用于检测Hg²⁺

(1)取实施例1制备所得的氧化铬纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)，通过将70μL 的200mMCr₂O₃ NPs添加到400μL的T33溶液(100nM)中来制备T33-Cr₂O₃ NPs复合物。反应4分钟后，测量T33-Cr₂O₃ NPs复合物的初始荧光发射光谱。然后，在添加不同浓度的金属离子并反应4分钟后，测量T33-Cr₂O₃ NPs与金属离子的混合物的荧光发射光谱，并计算猝灭速率。

最佳条件下(T33：100nM、Cr₂O₃ NPs：30mM、Tris-HAc：5mM，pH 7.0)，使用T33-Cr₂O₃NPs复合物检测Hg²⁺。如图6A和6B所示，在0～96.2μM范围内随着Hg²⁺浓度逐渐增加，T33-Cr₂O₃ NPs复合物(100mM：30mM)的荧光强度和猝灭率(F₀-F)/F₀逐渐降低。图6C和6D显示(F₀-F)/F₀值与Hg²⁺浓度在 0.21～2μM和4.2～50.5μM之间具有两个良好的线性关系。这两个校准方程分别为y＝11.639x+3.116，相关系数为R²＝0.983，以及y＝0.919x+34.067，R²＝0.989。根据3-sigma规则，检出限(LOD)为5.78nM，低于美国环境保护署允许的饮用水中无机Hg²⁺的最大允许水平(10nM)。

与其他先前报道的Hg²⁺光学检测相比，本发明提出的方法具有更低或相当的检出限。结果表明，T33-Cr₂O₃ NPs复合物可以灵感地检测Hg²⁺。

为了进一步评估T33-Cr₂O₃ NPs复合物的选择性，采用该方法对Hg²⁺和其他金属离子(Fe³⁺、Mg²⁺、Cu²⁺，Pb²⁺，Na⁺，Ca²⁺，Al³⁺，K⁺，Mn²⁺，Cr³⁺，Zn²⁺， Ni²⁺，Cd²⁺，Ba²⁺，Be²⁺，Ag⁺和Co²⁺：各5μM)的荧光响应。如图6E所示，只有Hg²⁺引起T33-Cr₂O₃ NPs复合物产生约38.9％的猝灭率；而其他干扰金属离子最多可引起6.6％的荧光猝灭或9.4％的荧光恢复率。结果表明，T33-Cr₂O₃ NPs 复合物对Hg²⁺的检测具有很高的选择性。

(2)用0.22-μm的滤膜过滤湖南师范大学岳王亭的池塘水样和自来水样。将10mMHg(NO₃)₂溶液添加到自来水和池塘水样品中，以制备50mM和1mM Hg(NO₃)₂溶液。然后，向T33-Cr₂O₃ NPs复合物中添加4μL 1mM Hg²⁺和17μL 50μM Hg²⁺，在室温下孵育4分钟后，测量混合物的荧光。

使用0.22-μm的膜过滤自来水和池塘水样品，以避免水样中的沉淀物对传感系统产生不利影响。结果如表1所示，在两个加标水平(2.00和10.00μM)下在自来水中Hg²⁺的回收率分别为99.02％和104.42％，在池塘水中Hg²⁺的回收率分别为83.83％和102.55％。自来水和池塘水的相对标准偏差(RSD)分别为 2.00％至3.53％和1.68％至3.43％。结果表明，该方法具有检测实际水样中Hg²⁺的巨大潜力。

表1.实际水样中的Hg²⁺检测

其中，^a未检出。

试验例2：用于分子逻辑计算和操作的DNA-Cr₂O₃ NPs传感系统

取实施例1制备所得的氧化铬纳米颗粒(Cr₂O₃ NPs)，通过将70μL的200 mM Cr₂O₃NPs添加到400μL的T33溶液(100nM)中来制备T33-Cr₂O₃ NPs 复合物。反应4分钟后，测量T33-Cr₂O₃ NPs复合物的初始荧光发射光谱。然后，在添加不同浓度的金属离子并反应4分钟后，测量T33-Cr₂O₃ NPs与金属离子的混合物的荧光发射光谱，并计算猝灭速率。为了进行分子逻辑运算，将不同输入物质的组合(T33、Cr₂O₃ NPs、Hg²⁺、GSH)添加到缓冲溶液中，反应4分钟后测量其荧光发射光谱。

如图7所示，在系统模型中，每个组件都可以交互和交换物质、能量和信息(方案1A)。在上述内容中，利用Cr₂O₃ NPs的荧光猝灭能力和ssDNA T33 的特异分子识别能力，构建了基于Cr₂O₃ NPs-DNA的荧光传感系统来检测Hg²⁺ (方案1B)。从物质和能量的角度来看，当FAM标记的T33与Cr₂O₃ NPs混合时，T33可以迅速吸附到Cr₂O₃ NPs表面，导致荧光猝灭(方案1Ba和C红线)。添加Hg²⁺时，Hg²⁺可能与Cr₂O₃ NPs上的T33结合形成T-Hg²⁺-T发夹结构，这导致三个组分更紧密地相互作用，从而导致更强的猝灭作用(方案1Bb和C蓝线)。此外，添加谷胱甘肽(GSH)后，由于GSH巯基与Hg²⁺的竞争性相互作用，T33-Cr₂O₃ NPs-Hg²⁺复合物的相互作用受到干扰，导致荧光恢复(方案1Bc 和C绿线)。

从信息处理的角度来看，作为基本事件的每个组件都可以抽象为一个具有两种可能状态的bit(例如，在物质水平的存在(逻辑为1)或不存在(逻辑为0)，在能量水平高(逻辑为1)或低(逻辑为0)。特定组件作为输入的组合可以诱发产生的中间事件或具有能量变化的顶部事件，作为与信息处理(例如逻辑计算操作)相对应的两层输出(物质和能量水平)。在传感系统中，所得事件可以被认为是一个物质输出(M)，并且其逻辑输出可分别定义为当目标事件不存在为逻辑0，存在为逻辑1。如图8A所示，当只有T33作为物质输入时，物质和能量上形成YES逻辑门。如方案1Ba所示，T33吸附在Cr₂O₃ NPs的表面上，形成AND门T33-Cr₂O₃NPs复合物(T33·Cr₂O₃ NPs，中间事件，点“·”代表AND 布尔代数，图7B红色门符号)，导致荧光猝灭。当与Hg²⁺混合时，T33·Cr₂O₃NPs (中间事件)进一步与Hg²⁺结合形成AND门T33-Cr₂O₃ NPs-Hg²⁺复合物(T33·Cr₂O₃ NPs·Hg²⁺)，导致更强的猝灭(方案1Bb，图8D红色门符号)。添加GSH时，由于GSH的巯基与Hg²⁺的共价结合，T33·Cr₂O₃ NPs·Hg²⁺受到干扰，导致两个主要事件(T33·Cr₂O₃ NPs·Hg²⁺和GSH·Hg²⁺，方案1Bc，图8E)且引起荧光部分恢复。因此，基于Cr₂O₃ NPs-DNA的荧光传感系统可以自组装并表示为(T33·Cr₂O₃ NPs)·(Hg²⁺·GSH)(图8E红色门符号)。

此外，上述分子事件的不同组合中的荧光变化也可被抽象为能量水平的逻辑输出,当荧光(F)≥150(a.u.)时逻辑为1，荧光(F)<150(a.u.)时逻辑为 0。当Cr₂O₃ NPs和T33作为两个输入时，只要存在T33，溶液的荧光输出就为 1，对应于T33 YES荧光门(图8B)。当将Hg²⁺和GSH用作两个输入时，当仅存在Hg²⁺时，T33-Cr₂O₃ NPs复合物的荧光输出为0，对应于Hg²⁺NOT OR GSH 荧光门(图8C)。根据三种输入信号T33、Cr₂O₃ NPs、Hg²⁺的组合真值表，只要存在T33而其他三个不同时存在，则溶液的荧光输出为1，对应于(T33 AND NOT Cr₂O₃NPs)OR(T33 AND NOT Hg²⁺)荧光门(图8D)。如果T33，Cr₂O₃ NPs，Hg²⁺和GSH是四个输入，则整个荧光传感系统可以实现更复杂的荧光逻辑功能(T33 AND NOT Cr₂O₃ NPs)OR(T33 ANDNOT Hg²⁺)OR(T33 AND GSH)(图8E)。

利用Cr₂O₃ NPs的荧光猝灭能力和ssDNA T33的特异分子识别能力，设计用于实现简单逻辑门操作的分子逻辑计算系统(YES、NOT、AND、OR)和复杂的逻辑环路。从物质和能量的角度来看，当FAM标记的T33与Cr₂O₃ NPs混合时，T33可以迅速吸附到Cr₂O₃ NPs表面，导致荧光猝灭。添加Hg²⁺时，Hg²⁺可能与Cr₂O₃ NPs上的T33结合形成T-Hg²⁺-T发夹结构，这导致三个组分更紧密地相互作用，从而导致更强的猝灭作用。此外，添加谷胱甘肽(GSH)后，由于GSH巯基与Hg²⁺的竞争性相互作用，T33-Cr₂O₃ NPs-Hg²⁺复合物的相互作用受到干扰，导致荧光恢复。

综上所述，本发明的方法只需利用Galanz HP3(S0)家用微波炉(中国) 微波辅助加热Cr³⁺和柠檬酸盐的混合溶液几分钟，再将混合溶液简单离心纯化，就可以合成Cr₂O₃NPs；与其他合成方法相比，该制备方法成本低、规模大、节能环保，并且不使用苛刻的条件。

所制备的Cr₂O₃ NPs具有新颖的荧光猝灭特性，可作为通用的荧光传感平台，可与DNA结合用于Hg²⁺的传感，检测范围为0.21～2μM和4.2～50.5μM，检测限为5.78nM，与其他先前报道的Hg²⁺光学检测相比，我们提出的方法具有更低或相当的检出限。通过从物质(分子事件)、能量(荧光)和信息流等方面进行全面分析，Cr₂O₃ NPs-ssDNA荧光传感系统可以进一步执行从单个输入到4 个输入(Cr₂O₃ NP、T33、Hg²⁺、GSH)对应2个输出(物质和荧光水平)的分子逻辑计算，包括简单的逻辑门(YES、NOT、AND、OR)和复杂的逻辑电路。此外，目前还没有关于铬基纳米材料的荧光猝灭特性及其在荧光传感和分子逻辑应用中的报道。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是进行相关材料及方法步骤的等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。