具体实施方式

本公开描述了非天然生成的融合蛋白(例如，能够转运一种或多种异源性效应分子的递送构建体)以及用于复性和纯化非天然生成的融合蛋白的方法。举例来说，所述非天然生成的融合蛋白可以是本文描述的IL-22递送构建体。

除了本领域技术人员对这些术语的理解之外，对以下术语的论述是为了说明本说明书中所用术语的含义。如本文和在所附权利要求中所用的，除非上下文中另有明确规定，单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“所述或该(the)”包括复数指代。还应当指出，权利要求的撰写可以排除任何可选要素。因此，这种陈述旨在在引述权利要求要素的情况下用作使用诸如“唯一”(solely)、“仅仅”(only)等排除性术语的引用基础，或用作使用“否定式”限定的引用基础。

本文给出了某些范围或数字，其中在数值前面带有术语“大约”。本文所用的术语“大约”，应该指的是该术语所指的数目加或减1％、2％、3％、4％或5％。如本文所用的，术语“受试者”和“个体”可以互换使用，并且可以是任何动物，包括哺乳动物(例如，人或非人类动物)。

如本文所用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”，以及其它语法上的等同形式，包括缓解、减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状，改善、预防或降低疾病或病症一种或多种其它症状的出现、严重程度或频率，改善或预防疾病或病症的一种或多种症状的内在原因，抑制这种疾病或病症，例如遏制疾病或病症的发展、缓和疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓和由疾病或病症导致的病症，或者预防性和/或治疗性地抑制疾病或病症的症状。

如本文所用的，术语“序列同一性百分数(％)”和与其相关的术语，在氨基酸序列的上下文中，是在对齐序列和引入空位(如果有必要的话)之后候选序列中与选定序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数，以获得最大的序列同一性百分数，并且不考虑将任何保守性置换作为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性的百分数，可以通过在本领域技术范围内的多种方式实现比对，例如使用公开获取的计算机软件，如ClustalOmega、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于衡量比对的适当参数，包括在正在比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用，用于指氨基酸残基的聚合物。肽类还基本上包括任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，例如由醚键连接的氨基酸，而不是由酰胺键。

效应分子和递送构建体

本文所提供的是能够转运一种或多种异源性效应分子(例如，一种或多种治疗性效应分子)通过上皮细胞(例如，极化型肠上皮细胞)并经由胞吞转运进入固有层的递送构建体。所述递送构建体可以包含偶联至异源性效应分子的载体。所述递送构建体可以是非天然生成的融合蛋白。所述载体可以能够利用内源性运输途径转运异源性效应分子通过极化型上皮细胞(例如，极化型肠上皮细胞)。利用内源性运输途径而不是采用被动扩散，可以使载体快速高效地运送异源性效应分子穿过上皮细胞而不损害这些细胞的屏障功能或异源性效应分子的生物活性。本文还提供了用于纯化和复性本文描述的递送构建体的方法。

本文的载体可以来源于细菌分泌的多肽。这种载体可以源于霍乱弧菌或绿脓杆菌分泌的多肽。霍乱弧菌分泌的多肽可以是Cholix多肽。源于Cholix多肽的载体可以是天然生成的或非天然生成的。例如，非天然生成的Cholix多肽可以由SEQ ID NO:1(一个Cholix1-634的示例)所示的氨基酸序列组成(表1)。源于Cholix多肽的载体可以是源于Cholix的多肽的截短型变体和/或突变型变体。例如，所述载体可以包含带有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:26的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266和1-386的氨基酸序列，或者由带有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:26的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266和1-386的氨基酸序列组成。在某些情况下，此类载体具有带有SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-206、1-245、1-251、1-266和1-386的氨基酸序列。突变可以包括一种或多种置换、缺失和/或加入。例如，本文的载体可以包含V1L置换。换句话说，在一些实施方案中，Cholix相关的载体在位置“1”处具有亮氨酸氨基酸(位置1指的是不具有N-末端蛋氨酸的变体的第一氨基酸或包括N-末端蛋氨酸的变体中的第二位置。换而言之，在确定载体的长度时，如果存在N-末端蛋氨酸，则忽略不计)。在一些实施方案中，包含V1L置换的载体减少或消除了N-末端氨基酸的裂解。在一些实施方案中，包含V1L置换的载体减少或消除了N-末端氨基酸的乙酰化。本文所提供的载体相对于天然生成的Cholix变体而言，其ADP核糖基化活性(例如，延伸因子2的核糖基化)可以降低(例如，至少降低50％)或减弱。在一些实施方案中，所述载体可以包含N-末端蛋氨酸。在其它实施方案中，不存在N-末端蛋氨酸。

截短型Cholix载体可以由SEQ ID NO:26(式I)所示序列的氨基酸残基1-386组成，基本上由其组成，或包含SEQ ID NO:26(式I)所示序列的氨基酸残基1-386。截短型Cholix载体可以由SEQ ID NO:26(式I)所示序列的氨基酸残基1-266组成，基本上由其组成，或包含SEQ ID NO:26(式I)所示序列的氨基酸残基1-266。在这种情况下，载体可以由SEQ IDNO:1所示序列的氨基酸残基1-266组成，基本上由其组成，或包含SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸残基1-266。因此，在某些情况下，所述载体由SEQ ID NO:2(一个Cholix1-386的示例)或SEQ ID NO:3(一个Cholix1-266的示例)所示的氨基酸序列组成。在某些情况下，载体具有以带有V1L置换的SEQ ID NO:2来表示的氨基酸序列。因此，在某些情况下，所述载体由SEQ ID NO:4(一个V1L-Cholix1-386的示例)或SEQ ID NO:5(一个V1LCholix1-266的示例)所示的氨基酸序列组成。这些载体中的任一种可以在其N-末端包括一种或多种用于在多种微生物(如，细菌)中表达的氨基酸，如N-末端蛋氨酸。此类载体可以具有SEQ ID NO:6-9中所示的氨基酸序列。

Cholix多肽可以是包含与SEQ ID NO:1-9或SEQ ID NO:22-23中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，或者具有100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，可以是基本上由其组成的蛋白质或由其组成的蛋白质。本文以SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:22的形式提供Cholix多肽的示例。本文还考虑了截短型Cholix多肽变体，它们能够转运效应分子通过极化型上皮细胞(如，极化型肠上皮细胞)。与参照序列相比，此类Cholix多肽可以在从206至633的任何一个氨基酸位置进行截短，例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26，或者是与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

本文还考虑了包含与上述序列具有高度序列同一性的载体的递送构建体。这种高度序列同一性可以包括至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。因此，在某些情况下，所述载体包含与SEQ ID NO:6-9中所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

本文所考虑的载体可以偶联至效应分子，例如异源性效应分子。这种效应分子可以是治疗性效应分子。治疗性效应分子可以是细胞因子、激素、生长因子、治疗性抗体、抗原、上述任何一种的功能性片段，或者是具有生物活性、治疗活性的任何其它蛋白质，或者是受试者可能缺乏的蛋白质(如，某种蛋白质的基因/遗传缺陷)。本文所考虑的细胞因子包括单体趋化因子和白细胞介素(这里也简称为“IL”)。白细胞介素可以是IL-22。白细胞介素可以来自任何物种(如，来自人类或啮齿动物)。白细胞介素可以是人白细胞介素。人IL-22可以具有SEQ ID NO:10(IL-22^1-179)或SEQ ID NO:11(IL-22^34-179)中所示的氨基酸序列。本文的IL-22还可以包括在其N-末端的蛋氨酸，例如，当这种IL-22蛋白在细菌中表达时。在一个实例中，IL-22具有SEQ ID NO:12(M+IL-22^34-179)所示的氨基酸序列。本文的IL-22还可以包括在其N-末端的蛋氨酸，例如，当这种IL-22蛋白在细菌中表达时。在一个实例中，IL-22具有SEQ ID NO:12(M+IL-22^34-179)所示的氨基酸序列。所述IL-22可以包含SEQ ID NO:10，或者包含与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性百分数的氨基酸序列或片段，基本上由SEQ ID NO:10，或者基本上由与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性百分数的氨基酸序列或片段组成，或由SEQ ID NO:10，或者由与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性百分数的氨基酸序列或片段组成。所述IL-22可以包含SEQ ID NO:11(IL-22^34-179)，这是一种分泌型IL-22，或者包含与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性百分数的氨基酸序列或片段，基本上由SEQ ID NO:11(IL-22^34-179)组成，或基本上由与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性百分数的氨基酸序列或片段组成，或由SEQ ID NO:11(IL-22^34-179)组成，或由与其具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性百分数的氨基酸序列或片段组成。IL-22可以包括在其N-末端的蛋氨酸，例如，当这种IL-22蛋白在细菌中表达时。这种IL-22可以由SEQ ID NO:12(M+IL-22^34-179)所示的氨基酸序列组成，基本上由其组成，或者包含SEQ ID NO:12(M+IL-22^34-179)所示的氨基酸序列。

在某些情况下，本文的任何一种递送构建体中所用的载体可以是一种蛋白质或能够转运治疗性效应分子通过上皮(如，受试者的极化型肠上皮)的另一类型的分子。这种转运可以包括胞吞转运。如本文所提及的，“胞吞转运”指的是运输融合分子通过极化型上皮细胞。这种运输允许从极化型上皮细胞的基底外侧膜释放生物活性货物(Cargo)。胞吞转运过程可以涉及载体与上皮细胞(如，极化型肠上皮细胞)顶端和/或基底表面上以及上皮细胞内部的一个或多个受体和/或蛋白的相互作用。所述载体可以能够转运治疗性效应分子通过上皮而不损害上皮、载体和/或该效应分子的生物和/或治疗作用。

可以将载体以共价或非共价的方式直接或间接地偶联至治疗性效应分子。可以将该治疗性效应分子直接偶联至所述载体的N-末端或C-末端。在将所述载体以共价的方式偶联至效应分子的情况下，可以将所述载体经由间隔体(此处也称为接头)偶联至这种效应分子。所述间隔体可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸残基。间隔体氨基酸残基可以是例如甘氨酸、丝氨酸和/或色氨酸。间隔体可以是可裂解间隔体或不可裂解间隔体。可裂解间隔体可以被酶裂解或以pH依赖性的方式裂解。

本文所考虑的间隔体的示例包括寡肽序列，例如S、(GS)x、(GGS)x、(GGGS)x(SEQID NO:27)、(GGGGS)x(SEQ ID NO:28)或(GGGGGS)x(SEQ ID NO:29)，其中x＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在某些情况下，间隔体由SEQ ID NO:13((G₄S)₃).(GGGGSGGGGSGGGGS)所示的序列组成，基本上由其组成，或者包含SEQ ID NO:13((G₄S)₃).(GGGGSGGGGSGGGGS)所示的序列。在某些情况下，间隔体由SEQ ID NO:31((G₄S)₅).(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)所示的序列组成，基本上由其组成，或者包含SEQ ID NO:31((G₄S)₅).(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)所示的序列。在某些情况下，递送构建体包含非共价连接的治疗性效应分子和载体(如，经由离子相互作用、范德华相互作用、π-π相互作用等)。载体还可以包含在其N-末端和/或C-末端的一种或多种特征、要素、氨基酸或修饰。例如，一些实施方案包括位于所述载体N-末端的N-末端蛋氨酸。其它修饰(如，乙酰化)也可以存在，包括用于在异源系统中表达的修饰。

本文的递送构建体可以具有SEQ ID NO:15或17中所示的氨基酸序列(M+Cholix^{1 -266}-(G4S)₃-IL-22^34-179的示例)(表1)。其它递送构建体可以具有SEQ ID NO:24或25中所示的氨基酸序列(例如，当在如CHO细胞等哺乳动物细胞中表达时)。这种示例性递送构建体转运IL-22通过完整的极化型肠上皮细胞并进入固有层。

在多种实施方案中，所述非天然生成的融合蛋白具有SEQ ID NO:14-21、24或25中所示的氨基酸序列，或者具有与其有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。含有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的非天然生成的融合蛋白的载体、间隔体和效应分子的示意图，在图16中予以说明。

表1示出了与本文公开的方法结合使用的生物活性分子的氨基酸序列。

表1-示例性氨基酸序列

在一些实施方案中，所述非天然生成的融合蛋白包括：载体，其选自SEQ ID NO:1-9、22-23和26中所示的序列中的任一项，以及效应分子，其选自SEQ ID NO:10-12中所示的序列中的任一项，或者由以上载体和效应分子组成，并且其中所述载体和效应分子任选地通过间隔体偶联，这种间隔体选自SEQ ID NO:13和27-29中所示的序列中的任一项。

本文还提供了药物组合物，其包含递送构建体和一种或多种药学上可接受的载体。在某些情况下，所述递送构建体由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成。在某些情况下，所述递送构建体由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成。此类药物组合物可以配制成用于给受试者施用。在某些情况下，将药物组合物配制成给受试者经口施用。

可以将包含递送构建体的药物组合物施用于需要它们的受试者(如，人类)，以治疗疾病。可以使用本公开的递送构建体治疗的疾病包括自身免疫性疾病和炎症性疾病。在某些情况下，这种疾病是上皮细胞损伤或上皮细胞膜(如，在胃肠道中)的损害。在某些情况下，这种疾病是肝炎、肥胖症、脂肪性肝病、肝脏炎症或胰腺炎、克罗恩病(如，瘘管性克罗恩病)、溃疡性结肠炎(如，轻度至中度或中度至重度)、贮袋炎、直肠炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎或银屑病。

纯化方法和组合物

本公开考虑了用于获得纯化的非天然生成的融合蛋白的方法。所述非天然生成的融合蛋白可以包含IL-22和载体，以及任选地将IL-22偶联至所述载体的间隔体。所述非天然生成的融合蛋白可以是包含与SEQ ID NO:14-21、24或25中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性，或具有100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，也可以是基本上由其组成的蛋白质或由其组成的蛋白质。本文描述的方法和组合物的有益效果包括保持纯化的多肽或蛋白质的高纯度和生物活性。

本文所公开的方法的具体有益效果包括：a)由于使用专门开发的折叠缓冲液进行了正确折叠，非天然生成的融合蛋白具有很高的生物活性；b)纯化的非天然生成的融合蛋白化学纯度高，同时伴随低毒性；c)经纯化的物料收率高；d)结果的可重复性保证了可靠的生产和供应；e)工艺性和可放大性达到了克级和千克级的规模，适用于临床和商业应用；f)可持续利用物料和资源，为临床相关分子提供具有成本效益和物流效益的纯化方法。此外，生产方法的改进可以加快这些纯化蛋白用于治疗性应用的开发速度(图22)。

图17示出了用于纯化本文描述的非天然生成的融合蛋白的示例性工艺，其进一步说明了在纯化过程中，每个阶段非天然生成的融合蛋白的示例性纯度和收率。

如本文所使用的，“纯度”表示在还可以包含非预期蛋白或蛋白的非预期型(如，非天然生成的融合蛋白的聚集体、错误折叠的蛋白质或其组合)的组合物中，预期蛋白(如，非天然生成的融合蛋白)或蛋白的预期型(如，单体非天然生成的融合蛋白、正确折叠的非天然生成的融合蛋白或其组合)的含量。这种含量可以用预期蛋白或蛋白的预期型的百分比(％)来表示。举例来说，这种纯度可以高于40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或者可以是100％。术语“纯化的”可以用来表示纯度有所提高的组合物。纯度的提高可归因于本文所描述的纯化过程，例如阴离子交换层析、羟基磷灰石层析、阳离子交换层析或其组合。

在某些情况下，本公开的方法和组合物包含使用至少两根串联的层析柱，然后是浓缩/缓冲液置换步骤(超滤/渗滤(UF/DF)以对溶液进行浓缩和缓冲液置换)。层析柱可以是低压层析系统，例如来自通用电气(GE)的AKTA Avant 150柱或AKTA Pilot柱。在某些情况下，至少有一根柱含有阴离子交换树脂(如，NH₂-750F树脂)，并且至少有一根柱含有羟基磷灰石树脂(如，树脂)。在某些情况下，将含有阴离子交换树脂的至少一根柱用于捕获步骤，而将含有羟基磷灰石树脂的至少一根柱用于精制步骤。在某些情况下，可以使用阳离子交换柱来代替(或补充)羟基磷灰石柱。例如，在一些实施方案中，阳离子交换柱带有硫酸根官能化的聚甲基丙烯酸酯树脂，如TOYOPEARL Sulfate-650F。溶解的蛋白质的纯度可以在UF/DF之后，从44％升高至47％，在阴离子交换层析之后，从93％升高至97％，在羟基磷灰石层析之后，升高至至少99％。溶解的蛋白质的收率可以在阴离子交换层析之后，从70％提高至73％，在羟基磷灰石层析之后，提高到至少97％。

从包涵体中分离非天然生成的融合蛋白

在一些实施方案中，从包涵体(IB)中分离待纯化的非天然生成的融合蛋白。如本文所描述的包涵体，可以是胞核内或胞浆内稳定物质的聚集体，例如蛋白和多肽。在一些实施方案中，将含有发酵形成的非天然生成的融合蛋白(如，SEQ ID NO:14-21)的双重洗涤包涵体(DWIB)重悬于特定的缓冲液体系中(参见实施例6)。

在某些情况下，DWIB的浓度是从约0.5g DWIB/100mL缓冲液至约5g DWIB/10mL缓冲液。在某些情况下，DWIB的浓度是从约2g DWIB/50mL缓冲液至约5g DWIB/50mL缓冲液。在某些情况下，DWIB的浓度是从约1g DWIB/20mL缓冲液至约1g DWIB/10mL缓冲液。在某些情况下，DWIB的浓度是至少1g DWIB/100mL缓冲液。在某些情况下，DWIB的浓度是至少1gDWIB/10mL缓冲液。

用于重悬的这种缓冲液体系可以含有多种缓冲剂和成分。在某些情况下，用于重悬的这种缓冲液体系含有浓度至少为1M、至少为2M、至少为4M、至少为6M、至少为8M的盐酸胍(Gu-HCl)。在某些情况下，Gu-HCl的浓度是从约4M至约8M。在某些情况下，用于重悬的这种缓冲液体系含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，其中Tris的浓度为至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM或至少100mM。在某些情况下，这种Tris缓冲液的浓度从约40mM至约60mM。这种Tris缓冲液可以是Tris-HCl。这种Tris-HCl的pH值可以是从8.0至8.5。这种Tris-HCl的pH值可以是8.2。在某些情况下，这种用于重悬的缓冲液体系含有二硫苏糖醇(DTT)。DTT的浓度可以是至少7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM或70mM。DTT的浓度可以是从7mM至11mM、从8mM至10mM或从9mM至10mM。在某些情况下，这种用于重悬的缓冲液体系含有乙二胺四乙酸(EDTA)。EDTA的浓度可以是至少1mM、1.5mM、2mM或2.5mM。EDTA的浓度可以是从1mM至2.5mM或从1.9mM至2.1mM。在一些实施方案中，这种用于重悬的缓冲液体系含有Tris缓冲液、Gu-HCl和DTT，基本上由Tris缓冲液、Gu-HCl和DTT组成或由其组成。这种用于重悬的缓冲液体系的pH值可以是从约6至约10。在某些情况下，这种缓冲液体系的pH值是从约7.5至约8.5。在某些情况下，这种缓冲液体系的pH值至少为7。在某些情况下，这种缓冲液体系的pH值至少为8。在某些情况下，这种缓冲液体系的pH值至少为8.5。

溶解的非天然生成的融合蛋白的还原

可以将还原剂添加到重悬溶液中。这种还原剂可以是二硫苏糖醇(DTT)。所用还原剂的量可以取决于重悬溶液的体积和存在于该溶液中的融合蛋白。在某些情况下，所用还原剂的量是从约0.025mM至约50mM、从0.5mM至30mM、从1mM至10mM。在某些情况下，所用还原剂的量为至少(或介于两者之间)2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。

溶解的非天然生成的融合蛋白(如，SEQ ID NO:14-21)溶液可在从约2℃至约40℃的不同温度下进行孵育。在某些情况下，可以将该蛋白溶液在室温(RT)下进行孵育。可以在搅拌溶液时进行孵育。可以在磁力搅拌盘上搅拌溶液，然后离心。可以在约1,000xg至约20,000xg下进行离心。在某些情况下，在4℃下以15,970xg进行离心90分钟。孵育时间可以从约20分钟到约180分钟不等，这取决于成分的浓度、融合蛋白(如，SEQ ID NO:14-21)的浓度。

在本文所述的整个方法和过程中，各种溶液中的蛋白质浓度可使用考马斯亮蓝(Bradford)测定法进行测定。溶解的非天然生成的融合蛋白的浓度可以是从约1mg/mL至约50mg/mL。在某些情况下，溶解的非天然生成的融合蛋白的终浓度可以是从约3mg/mL至约30mg/mL。在某些情况下，溶解的非天然生成的融合蛋白的终浓度可以是从约5mg/mL至约20mg/mL。在某些情况下，溶解的非天然生成的融合蛋白的终浓度可以是至少15mg/mL。

非天然生成的融合蛋白的复性

本公开的非天然生成的融合蛋白可能由于其特定的三维结构或折叠而发挥其生物活性。因此，这些多肽的复性对于开发用于药物应用的这些多肽可能具有重要意义。包含至少一种载体和IL-22的融合蛋白的理想复性可以包括将载体或IL-22复性成与天然生成的同源载体或IL-22序列的三级结构相似的三级结构，或复性成与引起该载体(如，融合蛋白的胞吞转运)和IL-22的预期活性得以保持的三级结构相似的三级结构。本文描述的方法可以包括将溶解的非天然生成的融合蛋白进行复性，以生成复性的非天然生成的融合蛋白。这种复性可以在进行阴离子交换层析之前发生。

可以将溶解的蛋白(如，SEQ ID NO:14-21)加入到复性溶液(也称为复性缓冲溶液)中。所用溶解的蛋白量可以是从0.1mg/mL至1mg/mL、1mg/mL至100mg/mL、从1mg/mL至50mg/mL、从1mg/mL至10mg/mL、从5mg/mL至20mg/mL，或可以是约15mg/mL。溶解的蛋白量可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/mL。溶解的蛋白量可以是不超过0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/mL。这种复性溶液的pH值可以介于7.5和8.5之间，或约为7.0。

这种复性缓冲溶液可以含有氨基酸、多元醇、盐、糖、氧化还原试剂、离液剂，或其组合。氨基酸可以是脯氨酸、甘氨酸、精氨酸或丙氨酸。多元醇可以是甘油。盐可以是氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)或氯化镁(MgCl₂)。糖可以是葡萄糖或蔗糖。氧化还原试剂可以是半胱氨酸、胱胺、谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)或硫酸铜(CuSO₄)。在一些实施方案中，这种复性缓冲溶液包含Tris-碱、精氨酸-盐酸、尿素、EDTA、甘油、L-半胱氨酸、胱胺二盐酸盐、DTT、Gu-HCl或其组合。在一些实施方案中，这种复性缓冲溶液包含pH为8.5的Tris、精氨酸、甘油、半胱氨酸和胱胺，基本上由pH为8.5的Tris、精氨酸、甘油、半胱氨酸和胱胺组成或者由其组成。Tris缓冲液的浓度可从约20mM到约200mM，其pH值从约6到约9。精氨酸-盐酸的浓度可以从约0.1M至约1.5M、从约0.75M至1.25M，或约为1.0M。尿素的浓度可以从约0.5M至1.5M。EDTA的浓度可以从1mM至3mM。甘油的浓度可以从约2％v/v至约20％v/v、从约8％v/v至约12％v/v，或约为10％v/v。半胱氨酸的浓度可以从1mM至5mM、从2mM至4mM，或约为3mM。半胱氨酸可以是L-半胱氨酸。胱胺的浓度可以从约0.5mM至约5mM、从约1mM至约4mM，或约为3mM。胱胺可以是胱胺二盐酸盐。DTT的浓度可以从约0.1mM至约1mM。Gu-HCl的浓度可以从约50mM至约500mM。这种复性缓冲液可以包含Tris、L-精氨酸、尿素、EDTA、半胱氨酸和胱胺，基本上由Tris、L-精氨酸、尿素、EDTA、半胱氨酸和胱胺组成，或者由其组成。这种复性缓冲液可以包含100mM的pH为8.5的Tris、1M的精氨酸、10％(v/v)的甘油、3mM的L-半胱氨酸和1mM的胱胺二盐酸盐，基本上由100mM的pH为8.5的Tris、1M的精氨酸、10％(v/v)的甘油、3mM的L-半胱氨酸和1mM的胱胺二盐酸盐组成，或由其组成。可以将溶解的非天然生成的融合蛋白加入到该复性缓冲液中，以生成复性混合液。在将非天然生成的融合蛋白加入到复性混合液中之后，其浓度可以从约0.1mg/mL至1.0mg/mL、0.5mg/mL至1.5mg/mL、从0.75mg/mL至1.25mg/mL，或约为1mg/mL。非天然生成的融合蛋白在复性混合液中的浓度可以低于0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1.0mg/mL。

在多个实施方案中，使用了约100mL至约10,000L体积的复性缓冲液。在某些情况下，该体积是从约50mL至约1500L。在某些情况下，该体积是从约10L至约300L。在某些情况下，该体积至少为200L。

这种复性溶液可以有一定的温度。例如，可以将这种复性溶液预冷至约2-12℃。在某些情况下，将这种复性溶液预冷至至少约3℃。这种复性工艺可以根据所用的蛋白和应用进行优化(图18)。

在本公开的一些实施方案中，将所述复性混合液孵育一段时间。在某些情况下，这个过程可以是约1小时、2小时、4小时、5小时或20小时。在某些情况下，这个复性过程需要约15至约25小时。在某些情况下，需要蠕动泵，并根据溶液的组成(如，浓度或体积)来设置一定的流速，从而将这种溶解的物料递送到复性溶液中。在某些情况下，将蠕动泵的流速设定为60-80ml/min。优化过程采用了15种不同基质、12个变量和200个复性反应的实验设计(DOE)。通过排除法作出决定。

在多种实施方案中，可以进行定量分析以确定包含所述复性非天然生成的融合蛋白的溶液中正确折叠的蛋白质的量或百分比。在某些情况下，进行体积排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)以确定存在于复性样品中正确折叠的非天然生成的融合蛋白的量。

复性非天然生成的融合蛋白的纯度可以从45％到65％、从40％到60％或者从45％到55％。复性非天然生成的融合蛋白的纯度可以是至少40％、45％、50％或55％。

溶解的IL-22递送构建体的切向流过滤(TFF)

在多种实施方案中，蛋白质复性与具有一定截留分子量(MWCO)的切向流过滤(TFF)系统(例如，Millipore)和超滤/渗滤(UF/DF)系统结合进行或在它们之前进行。

蛋白复性混合液可随后通过TFF进行处理，以对溶液进行浓缩和缓冲液置换。在某些情况下，通过超滤/渗滤(UF/DF)来进行这种处理。在超滤过程中，溶液可以浓缩8倍到12倍，或约10倍。超滤之后可以在渗滤过程中用渗滤缓冲液进行5倍缓冲液置换。这种UF/DF可以包含使用10-20kDa MWCO的Millipore Ultracell Pellican3过滤器，并配有1-2m²的TFF平板盒。具体的参数(即，跨膜压差)可以根据蛋白质的分子特性而变化。渗滤缓冲液可以包含10-25mM的pH值为约7至约8.5的Tris-碱，以及50-200mM的NaCl。具体的参数可以根据蛋白质的分子特性而变化。UF/DF过程结束时的终体积可为约5L至约100L。在某些情况下，终体积介于从约10至约50L的范围。在某些情况下，终体积介于从约80mL至约10L的范围。

后续的过滤可以使用流动过滤系统进行。在某些情况下，这种流动过滤系统是AkroPac过滤系统和Cole-Parmer蠕动泵及管路。可以进行考马斯亮蓝测定，以确定蛋白浓度、产率和分步收率。

在多种实施方案中，可以进行定量分析，以确定样品溶液中正确折叠的蛋白质的量或百分比。在某些情况下，进行体积排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)以确定存在于复性和UF/DF样品中正确折叠的非天然生成的融合蛋白的量。

UF/DF之后，包含复性非天然生成的融合蛋白的溶液的纯度可以从35％至55％、从40％至50％、从43％至47％，或约为45％。UF/DF之后，包含复性非天然生成的融合蛋白的溶液的纯度可以是至少35％、40％或45％。UF/DF之后，溶解的复性非天然生成的融合蛋白的收率可以从87％至97％、从90％至94％、从92％至93％，或约为92.5％。(还可以使用其它浓度和缓冲液置换体系。)

非天然生成的融合蛋白的纯化和回收

如前所述，两种层析方法串联使用，例如阴离子交换层析和羟基磷灰石层析(或可选地，阳离子交换层析)，可以提高溶液中非天然生成的融合蛋白(例如本文描述的IL-22递送构建体)的纯度和收率。在本公开的多种实施方案中，根据各种参数(例如，待纯化的蛋白质)来确定和优化层析的具体细节(例如，柱类型、树脂、流速、缓冲体系、梯度和电导率)。多种纯化柱可用于本文所述的蛋白质纯化。

阴离子交换层析

本文描述的方法可以包括对含有非天然生成的融合蛋白的混合液进行阴离子交换层析(AEX)。这种混合液可以是含有复性非天然融合蛋白的溶液。进行阴离子交换层析可以生成包含非天然生成的融合蛋白的第一级分。

多种树脂可以与本公开的方法和组合物结合使用。在某些情况下，这种树脂包含胺基官能化的聚甲基丙烯酸酯珠。在某些情况下，将阴离子交换树脂NH₂-750F用于蛋白纯化。可以用树脂填充具有至少15cm、20cm、25cm或30cm的床层高度的柱。可以用树脂来填充床层高度为10至50cm的柱，在某种程度上以确保柱体积可以有利于适当的动态载量(如，>20g/L)，从而能够生产出所需数量的蛋白质。在某些情况下，柱的动态载量是从5g/L至100g/L、从20g/L至约50g/L、从15g/L至30g/L或从20g/L至25g/L。

用于在阴离子交换层析中洗脱(如，梯度洗脱)的缓冲液体系可以包含1种、2种、3种或4种不同的缓冲溶液(如，缓冲液A至D)。在一些实施方案中，将两种缓冲液用在阴离子交换层析中，并在此称其为缓冲液A和缓冲液B。在某些情况下，缓冲溶液含有Tris(如，10-50mM、pH 7-9)和/或NaCl(如，0.1-5M)。在某些情况下，这种缓冲溶液还包含甘油。在一些实施方案中，用在阴离子交换层析中的缓冲溶液(例如，缓冲液A或缓冲液B)包含pH为7.5的Tris和NaCl，并且任选地包含甘油，基本上由pH为7.5的Tris和NaCl组成，或由其组成，任选甘油。

缓冲液A可以包含从10mM至30mM、从15mM至25mM、从19mM至21mM或约为20mM的pH为7.5的Tris。缓冲液A可以包含从0.25M至0.95M、从0.35M至0.75M、从0.45M至0.55M、约0.5M、从0.65M至0.75M，或约0.7M的NaCl。缓冲液B可以包含从10mM至30mM、从15mM至25mM、从19mM至21mM或约为20mM的pH为7.5的Tris。缓冲液B可以包含从1M至3M、从1.5M至2.5M、从1.9M至2.1M，或约2M的NaCl。缓冲液A还可以包含从8％至12％、从9％至11％，或约10％(v/v)的甘油。缓冲液B还可以包含从8％至12％、从9％至11％，或约10％(v/v)的甘油。

对于SEQ ID NO:15的阴离子交换层析，缓冲液A可以包含20mM的pH为7.5的Tris和0.5M的NaCl，而缓冲液B可以包含20mM的pH为7.5的Tris和2.0M的NaCl(表4)。对于SEQ IDNO:17的阴离子交换层析，缓冲液A可以包含20mM的pH为7.5的Tris和0.5M的NaCl，而缓冲液B可以包含20mM的pH为7.5的Tris和2.0M的NaCl。对于SEQ ID NO:14的阴离子交换层析，缓冲液A可以包含20mM的pH为7.5的Tris、0.7M的NaCl和10％(v/v)的甘油，而缓冲液B可以包含20mM的pH为7.5的Tris、2.0M的NaCl和10％(v/v)的甘油(表5)。

在一些实施方案中，将一定体积的盐溶液加入到蛋白质溶液中。在某些情况下，将浓度范围介于约0.1至约5M的NaCl溶液加入到蛋白质溶液中。

可以将蛋白质溶液加载到柱上，以便观察特定的流速和特定的柱停留时间，从而确保蛋白质和固定相(如，树脂)的适当相互作用。

在某些情况下，对流速进行控制，使柱停留时间为约30秒至约6分钟，或约5分钟。柱停留时间可以为至少30秒，或1、2、3、4或5分钟。柱停留时间可以为不超过3、4、5、6、7、8、9或10分钟。可以收集和分析流穿液，以确定是否有未结合的蛋白质，这被认为是一种损失。对于蛋白分析和纯化，在约280nm处的吸光度用于测定蛋白质浓度，并且使用SEC-HPLC来测定蛋白质纯度。

在一些实施方案中，将第一缓冲液的百分数(如，0-100％)或流速(如，1-10mL/min)与第二缓冲液相结合，以获得柱纯化系统的特定的终流速(如，1-10mL/min)。例如，对于蛋白纯化，先进行20倍柱体积(CV)的从0.0至62.5％的缓冲液B(从100至37.5％的缓冲液A)的线性梯度，再进行另外5倍CV的100％的缓冲液B(0％的缓冲液A)的逐级梯度。在某些情况下，可以作为洗脱梯度来进行40倍CV的从0至75％的缓冲液B(从100至25％的缓冲液A)的梯度洗脱，再进行10倍CV的100％的缓冲液B的逐级洗脱，结果显示蛋白纯度为91-93％，并且收率>90％。

第一级分中这种非天然生成的融合蛋白的纯度可以是从90％至99％或从91％至95％。第一级分中这种溶解的非天然生成的融合蛋白的纯度可以是至少90％、91％、92％、93％、94％或95％。第一级分中这种溶解的非天然生成的融合蛋白的收率可以是从61％至81％、从66％至76％或从71％至72％。

阳离子交换层析或羟基磷灰石层析

本文描述的方法还可以包括将阴离子交换层析之后获得的第一级分进行阳离子交换树脂处理，以获得包含非天然生成的融合蛋白的第二级分。这种阳离子交换树脂可以是硫酸根官能化的聚甲基丙烯酸酯树脂。这种阳离子交换树脂可以是Sulfate-650F树脂。

本文描述的方法可以附加地或可选地包括将阴离子交换层析之后获得的第一级分进行羟基磷灰石树脂处理，以获得包含非天然生成的融合蛋白的第二级分。这种羟基磷灰石树脂可以是还含有钙亲和性的阳离子交换树脂。这种羟基磷灰石树脂可以包含磷酸钙。这种羟基磷灰石树脂可以包含以下化学式：Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂。这种羟基磷灰石树脂可以包含的粒径为从30μm至50μm、从35μm至45μm，或约39μm。这种羟基磷灰石树脂可以是树脂。

树脂的优点可以包括：a)耐盐性，允许在水溶液中以高电导率吸附蛋白质；b)装载前不需要准备蛋白质(如，SEQ ID NO:14-21等融合蛋白)；c)获得高收率(>90％)；d)高载量(>20mg/mL树脂)；e)通过去除低分子量(LMW)杂质来提高纯度；以及f)确保清除内毒素(<1.0EU/mg)。

这种阳离子交换树脂或羟基磷灰石树脂可以用于层析柱的填充。这种柱可以包含的床层高度从10cm至50cm或约20cm。这种柱可以包含的床层高度为至少10cm、15cm、20cm、25cm或30cm。这种柱可以包含的床层高度为不超过20cm、30cm、40cm或50cm。在某些情况下，羟基磷灰石混合模式的树脂用于填充床层高度为10-50cm的柱，以确保柱体积有利于高达10-100g/L的动态载量，从而能够生产所需数量的蛋白质。

用于在羟基磷灰石层析中洗脱(如，梯度洗脱)的缓冲液体系可以包含1种、2种、3种或4种不同的缓冲溶液(如，缓冲液A至D)。在一些实施方案中，将两种缓冲液用在羟基磷灰石层析中，并在此称其为缓冲液A和缓冲液B。在某些情况下，缓冲溶液含有Tris(如，10-50mM、pH为7-9)和/或NaCl(如，0.1-5M)。在某些情况下，这种缓冲溶液还包含甘油。在一些实施方案中，用在羟基磷灰石层析中的第一缓冲溶液(例如，缓冲液A)包含pH为7.5的Tris、NaCl和CaCl₂，基本上由pH为7.5的Tris、NaCl和CaCl₂组成，或由其组成。在一些实施方案中，用在羟基磷灰石层析中的第二缓冲溶液(例如，缓冲液B)包含pH为7.0的磷酸钠、NaCl和CaCl₂，基本上由pH为7.0的磷酸钠、NaCl和CaCl₂组成，或由其组成。

缓冲液A可以包含从10mM至30mM、从15mM至25mM、从19mM至21mM或约20mM的pH为7.5的Tris。缓冲液A可以包含从80mM至120mM、从90mM至110mM或约100mM的NaCl。缓冲液A可以包含从0.5mM至1.5mM、从0.75mM至1.25mM、从0.9mM至1.1mM或约1mM的CaCl₂。缓冲液B可以包含从150mM至250mM、从175mM至225mM、从190mM至210mM或约200mM的pH为7.0的磷酸钠。缓冲液B可以包含从50mM至150mM、从75mM至125mM、从90mM至110mM或约100mM的NaCl。缓冲液B可以包含从0.5mM至1.5mM、从0.75mM至1.25mM、从0.9mM至1.1mM或约1mM的CaCl₂。

对于SEQ ID NO:15的羟基磷灰石层析，缓冲液A可以包含20mM的pH为7.5的Tris、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂，而缓冲液B可以包含200mM的pH为7.0的磷酸钠、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂(表6)。对于SEQ ID NO:17的羟基磷灰石层析，缓冲液A可以包含20mM的pH为7.5的Tris、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂，而缓冲液B可以包含200mM的pH为7.0的磷酸钠、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂。对于SEQ ID NO:14的羟基磷灰石层析，缓冲液A可以包含20mM的pH为7.5的Tris、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂，而缓冲液B可以包含200mM的pH为7.0的磷酸钠、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂(表7)。

使用阳离子交换树脂或羟基磷灰石树脂后，溶解的蛋白质的纯度可以从99％提高至100％。使用羟基磷灰石树脂后，溶解的蛋白质的纯度可以为至少95％、96％、97％、98％、99％或100％。使用羟基磷灰石树脂后，溶解的蛋白质的收率可以是从85％至100％、从96％至99％或从97％to 98％。这种羟基磷灰石树脂可以是

可以将在柱层析过程中收集的含有经纯化的化合物(如，融合蛋白)的级分，使用缓冲液置换或渗滤进行浓缩或配制，以用于给药。举例来说，可以使用TFF系统(如，Pall公司)将在过程中收集的级分进行浓缩和配制，以浓缩这种蛋白。可以将蛋白质浓缩至20mg/mL的终浓度，然后进行5倍的缓冲液置换。过滤过程可以使用超滤/渗滤(UF/DF)和配有10kDa MWCO的Millipore Pellican3、0.114m²的TFF平板盒的过滤器来进行。过滤系统的MWCO可以根据待纯化的蛋白质(如，分子量)而变化。渗滤缓冲液可以由10-20mM的pH约为7.0的磷酸钠、50-100mM的NaCl组成。随后，配制的SEQ ID NO:14-21可以采用AkroPac0.8/0.2微米过滤器和Cole-Parmer蠕动泵及管路并通过流动过滤系统进行过滤。经纯化和配制的蛋白质可以在-80℃下以等份的形式储存，以备后续使用。

在特定的实施方案中，使用TSKgel GW3000SWXL、5μm、7.8mm ID x 30.0cm L柱(Tosoh Bioscience,8541)，通过SEC-HPLC对蛋白质进行分析，显示出超过97％的纯度(通常>98％)。

蛋白质分析

源自不同级分的样品可以采用Bio-Rad ChemiDoc^TM MP成像系统通过SDS-PAGE进行分析，并且在柱层析过程中收集的级分可以使用Thermo Fisher Nanodrop One^TM来分析蛋白含量。蛋白质检测或分析的一般技术包括凝胶电泳、荧光显微技术、毛细管电泳、质谱技术、电泳迁移率测定或核磁共振。

治疗方法

在本公开的多种实施方案中，提供了用于治疗和/或预防炎症性疾病的包含本公开的融合分子的药物组合物。可以将这些药物组合物配制成用于经口递送。“炎症性疾病”可以包括所有与急性或慢性炎症有关的疾病。急性炎症是机体对有害刺激的最初反应，也是血浆和白细胞(例如粒细胞)从血液进入受损组织的运动增加的结果。许多生物化学事件会使炎症反应扩散和加重，包括局部血管系统、免疫系统和受损组织内的各种细胞。长期炎症被称为慢性炎症，这会导致存在于炎症部位细胞类型的进行性改变，并且其特征在于炎症过程中组织的破坏和愈合同时发生。炎症性疾病可由以下原因造成：例如烧伤、化学刺激物、冻伤、毒素、病原体感染、物理损伤、过敏引起的免疫反应、电离辐射或异物(如，碎片、污垢和碎屑)。在一些实施方案中，炎症性疾病是上皮细胞损伤、肝炎、肥胖症、脂肪性肝病、肝脏炎症、胰腺炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、瘘管性克罗恩病、溃疡性结肠炎、轻度至中度溃疡性结肠炎、中度至重度溃疡性结肠炎、贮袋炎、直肠炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎或银屑病。

本文进一步描述的是用于治疗受试者的疾病或病症的方法，包括为受试者施用非天然生成的融合蛋白。在一些实施方案中，这种疾病或病症是上皮细胞损伤、肝炎、肥胖症、脂肪性肝病、肝脏炎症、胰腺炎、克罗恩病、瘘管性克罗恩病、溃疡性结肠炎、轻度至中度溃疡性结肠炎、中度至重度溃疡性结肠炎、贮袋炎、直肠炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎或银屑病。可以将这种非天然生成的融合蛋白经口施用给予受试者。受试者可以是人。

实施例

提供这些实施例仅用于说明的目的，而并不是为了限制本文所提供的权利要求的保护范围。

实施例1

递送构建体的表达

在本实施例中，对作为单一氨基酸序列的递送构建体的制备进行了一般性描述，这种递送构建体包含来源于Cholix的载体序列、间隔体序列和治疗性效应分子。

首先，通过PCR扩增编码SEQ ID NO:15的递送构建体的核酸序列，在PCR产物的两端引入限制性酶对NdeI和EcoRI、PstI和PstI、AgeI和EcoRI或PstI和EcoRI的位点。经限制性酶酶切之后，将PCR产物克隆到合适的质粒中进行细胞表达，并用相应的限制性酶对进行酶切。这种质粒编码包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的递送构建体。

递送构建体的表达如下：在适当的质粒存在下，使用常规的热休克法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Novagen,Madison,Wis.)，以生成递送构建体表达细胞，在含有氨苄青霉素的培养基上进行筛选，并在含有抗生素的Luria-Bertani肉汤(Difco；Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)中进行分离和生长，然后在培养液的OD值为0.6时，通过加入1mM的异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白表达。IPTG诱导后2小时，通过以5,000rpm离心10分钟来收获细胞。细胞裂解后分离出包涵体，并以1g/10mL的比例用水洗涤两次。将来自细胞裂解的沉淀用水重悬，然后在4℃下以10,000rpm的转速离心1小时。然后重复该洗涤一次。将其中的双重洗涤包涵体(DWIB)溶解于含有50mM的Tris-盐酸、6mM的盐酸胍(pH为8.2)和10mM的二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中。然后将溶解的物料稀释到含有0.1M的Tris(在4℃下、pH为8.5)、1.0M的L-精氨酸、10％的甘油、3mM的L-半胱氨酸、1mM的胱胺二盐酸盐的复性缓冲液中。通过阴离子交换层析(Q琼脂糖离子交换)和Superdex 200凝胶过滤层析(Amersham Biosciences,Inc.,Sweden)对具有SEQ ID NO:15的复性蛋白质进行纯化。通过SDS-PAGE和HPLC分析法(Agilent,Inc.Palo Alto,Calif.)对蛋白纯度进行评估。

对递送构建体进行评估，以验证其就预期分子大小而言的正确折叠。诱导之后，从包涵体中收集表达的蛋白质。利用包涵体，通过凝胶电泳验证递送构建体的表达程度，并将表观分子量与计算的质量进行比较。

结果表明，在高产率和高纯度的前提下，稳定高效地生成了功能性递送构建体。

实施例2

转运效应分子通过单层上皮细胞的体外模型评价

本实施例展示了一种体外模型，其旨在评估本文描述的效应分子或递送构建体的转运特性。

图1示意性地示出了一种装置，其包括位于单层上皮细胞上方的顶室和位于该单层上皮细胞下方的基底室。

为了测定从顶端到基底外侧的通透性，将供试品(例如，递送构建体、效应分子等)加在顶端(A)侧，然后测定基底外侧(B)侧上的通透量。为了测定从基底外侧到顶端的通透性，将供试品加在基底外侧(B)侧，然后测定顶端(A)侧上的通透量。

根据以下公式，可将数据表示为通透率(Papp)：Papp＝(dQ/dt)/(C0*A)。Q/dt为通透速率，C0为供试品的初始浓度，并且A为单层的面积。根据以下公式，可以计算外排转运率(Re)：(Re)＝Papp(B-A)/Papp(A-B)。Re>2可以表示P-糖蛋白(P-gp)或其它主动外排转运体的潜在底物。

可以使用SMI-100或Caco-2细胞在体外来评估载体或递送构建体的胞吞转运功能。

对于Caco-2细胞，进行ELISA检测，以评估载体或递送构建体经由胞吞转运穿过单层Caco-2细胞的能力。在37℃、5％的二氧化碳条件下，将Caco-2(ATCC HTB-37^TM)细胞在完全培养基中培养：在杜尔贝科改良伊格尔培养基F12(DMEM F12)中补充10％的胎牛血清、2.5mM的谷氨酰胺、100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素(Gibco BRL,Grand Island,N.Y.)。细胞每2至3天用这种培养基(指定的完全培养基)换液一次，每5至7天传代一次。对于测定，将细胞接种于24-孔板或96-孔板中，并使细胞生长至汇合。

Caco-2细胞在胶原包覆的0.4-μm孔径聚碳酸酯膜Transwell支持物(Corning-Costar,Cambridge,MA)上以汇合的单层生长，并在使用探针式Millicell-电压表(Millipore)测量的跨上皮电阻(TER)达到>250Ω·cm2后的18-25天使用细胞。在37℃下将4.7nM、23.6nM和236nM的递送构建体施加于顶端之后，通过测定在特定的时间点(如，15、30和45分钟)转运的蛋白量，来确定载体或递送构建体从顶端到基底外侧(A→B)的转运。在实验过程中，采用TER测量法和10kDa荧光葡聚糖的范围(使用HPLC体积排阻法来测定)来验证单层屏障特性。递送构建体(如，SEQ ID NO:15)转运的范围通过在以细胞为基础的细胞毒性测定中收集的培养基的滴定来测定。利用抗体(如，抗载体或抗效应分子，例如抗IL-22抗体)进行捕获和检测，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定转运的递送构建体。

在使用前，使在细胞培养小室中建立的人小肠组织(SMI-100,MatTek公司；Ashland,MA,USA)的汇合单层在37℃下稳定24小时。只有具有>400Ω·cm2的跨上皮电阻(TER)的小室才被认为具有足够的单层完整性用于研究。通过评估70kD葡聚糖转运的抑制，对单层完整性进行了二次验证。用转运缓冲液(PBS)洗涤培养室一次。将以20μg/mL的浓度制备的待测分子以100μL的体积施加于小室的顶端表面。在转运研究的每个时间点，更换500μL PBS的基底外侧体积。每个实验条件都重复进行3次。

实施例3

载体介导的转运IL-22通过极化型肠上皮细胞

本实施例表明，载体(SEQ ID NO:7)可以在体外转运IL-22效应分子(SEQ ID NO:11)通过极化型肠上皮细胞。本实施例还表明，具有SEQ ID NO:7的载体可以在体内转运具有生物活性的IL-22效应分子通过极化型肠上皮细胞并到达固有层。

根据实施例2并如图1所示的从顶端(A)到基底侧(B)的转运，通过施加递送构建体于上皮细胞的顶端膜，检测了转运递送构建体(SEQ ID NO:15)通过单层Caco-2细胞和小肠上皮组织(在此也被称为SMI-100)。实验重复进行3次，并且在顶端施加之后的15、30和45分钟，收集来自基底外侧室的样品，以测定转运的蛋白量。如在实施例2中描述的，采用ELISA测定法来测定经胞吞转运的蛋白量。

图2和图3中的数据表明，当载体(SEQ ID NO:7)偶联至IL-22(SEQ ID NO:11)时，引起IL-22效应分子以时间依赖性的方式转运通过Caco-2(图2)和SMI-100(图3)两种单层细胞，并且与未和载体偶联的IL-22(SEQ ID NO:12，M+IL-22^34-179)单独转运相比，这种递送构建体引起IL-22通过上皮细胞的数量增加了约2-3倍。

对于体内实验，使用雄性Wistar大鼠来测试胞吞转运。在明/暗循环为12/12小时的环境下以每笼3-5只来饲养雄性Wistar大鼠，并且当进行研究时，其体重约为225-275克(约6-8周龄)。在明的阶段进行实验，采用的是持续异氟醚麻醉的非清醒方法。执行4-5厘米的腹部中线切口，以暴露空肠中段区域。用磷酸盐缓冲液(PBS)配制浓度为3.86×10-5M的递送构建体(SEQ ID NO:15)储备溶液，使用29号针头通过腔内注射(ILI)给药50μL(每只250g的大鼠)。然后用永久性记号笔标记注射部位的肠系膜。在研究结束时，将捕获标记的肠段的3-5mm区域分离出来，并进行处理以用于显微镜评估。

递送构建体(SEQ ID NO:15)胞吞转运活性的结果在图4中予以显示，表明当作为包含偶联至IL-22的Cholix-衍生载体(SEQ ID NO:7)的递送构建体的一部分提供时，大量IL-22效应分子(SEQ ID NO:11)在体内穿过完整的极化型肠上皮。这张显微镜图像显示了在Wistar大鼠空肠的腔内应用SEQ ID NO:15的递送构建体后，IL-22效应分子(SEQ ID NO:11)从肠上皮的顶端部位(用1号白色箭头突出显示)转运至上皮细胞的基底部位(用2号白色箭头突出显示)，并进入固有层(缩写为“l.p.”)。该图像还显示了IL-22与位于固有层内的细胞和极化型上皮的外基底膜(用3号白色箭头突出显示)上的IL-22受体有显著的相互作用和结合。IL-22的定位用2号和3号白色箭头表示。

实施例4

重组人IL-22与鼠IL-22受体的结合

本实施例显示了重组人IL-22(rhIL-22,SEQ ID NO:12)与重组鼠IL-22(rmIL-22)相比，呈剂量依赖性地结合至鼠IL-22受体。

图5A显示了鼠FL83 B细胞中STAT3的磷酸化与激动剂浓度的函数关系(单位：pM)，其中这种激动剂为rhIL-22(SEQ ID NO:12)或rmIL-22。该数据示出了rhIL-22和rmIL-22呈浓度依赖性地诱导STAT3的磷酸化，表明人IL-22蛋白可以像小鼠IL-22一样有效地与小鼠IL-22受体结合并通过小鼠IL-22受体诱导信号转导。

图5B显示了rhIL-22(SEQ ID NO:12)和rmIL-22还可以诱导鼠Hepa1-6细胞中STAT3的磷酸化。

图6A展示了rhIL-22(SEQ ID NO:12)和rmIL-22呈剂量依赖性地诱导鼠FL83 B细胞中STAT5的磷酸化，表明人IL-22蛋白可以与小鼠IL-22受体结合并通过小鼠IL-22受体诱导信号转导，其效果与小鼠IL-22相当。

图6B展示了rhIL-22(SEQ ID NO:12)和rmIL-22还可以诱导鼠Hepa1-6细胞中STAT5的磷酸化，但在后续实验中还需要进行额外的剂量范围调整。

这些数据提供了强有力的证据，证明rhIL-22(如，用于具有SEQ ID NO:10或11的递送构建体中的)能够激活小鼠细胞中的STAT3和STAT5，从而为在小鼠模型中使用这类递送构建体来评估IL-22的活性和功能提供了理论依据。

实施例5

具有SEQ ID NO:15的递送构建体在体内结肠炎模型中的有效性

本实施例显示了在葡聚糖硫酸钠(DSS)小鼠模型中，与IL-22单独(SEQ ID NO:12)作用相比，具有SEQ ID NO:15的包含经由接头(SEQ ID NO:13)偶联至IL-22(SEQ ID NO:11)的Cholix衍生载体(SEQ ID NO:7)的递送构建体的体内有效性。

图7A示出了体内研究设计和时间轴的概览，用于比较SEQ ID NO:15的该递送构建体以两个每日一次的剂量水平(1mg/kg和30mg/kg)经口(p.o.)给药与rhIL-22以一个每日一次的剂量水平(4mg/kg)腹腔内(i.p.)给药。这项体内研究在常规饲料喂养、8-10周龄、体重约23克的雌性C57BL/6小鼠中进行。通过让其自由饮用2.5％的葡聚糖硫酸钠(DSS)饮用水溶液，用化学方法诱导结肠炎。研究终点包括体重变化百分比、疾病活动指数、结肠长度和重量以及组织病理学。

图7B示出了在图7A中所描述的研究中使用的实验组和对照组的特征。

图8A示出了各实验组和对照组动物体重在研究第10天相对于第0天的变化百分比(％)通过单因素ANOVA进行评估，具有SEQ ID NO:12的rhIL-22或具有SEQ ID NO:15的递送构建体相对于溶剂对照的基线(第0天与第10天相比)体重变化不显著。通过单因素ANOVA进行评估，模型的阳性对照(环孢菌素A)CsA相对于溶剂对照存在显著差别。

图8B示出了实验组动物和对照组动物在前10个研究日的体重变化情况。通过双因素ANOVA进行评估，在研究期间，CsA组的平均体重相对于溶剂对照组在第6天至第10天有了显著增加(*、**、***)，通过双因素ANOVA进行评估，rhIL-22(i.p.)组的平均体重相对于溶剂对照组在第10天有了显著增加(*)，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。

图9示出了以血浆酶联免疫吸附测定(ELISA)实验测定IL-22血浆水平的结果。这些结果显示，经口灌胃给予1mg/kg和30mg/kg两个剂量的具有SEQ ID NO:15的递送构建体后，血浆中的rhIL-22浓度呈剂量依赖性的上升趋势(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001；平均值+SEM；空白对照组(n＝2)，溶剂对照组(n＝5)，CsA组(n＝5)，其它组(n＝10))。

这些数据表明，经口灌胃给药之后，具有SEQ ID NO:15的递送构建体引起呈剂量依赖性的体重增加趋势。经口灌胃给予1mg/kg和30mg/kg两个剂量的具有SEQ ID NO:15的递送构建体后，经过测定，血浆中的IL-22水平呈剂量依赖性的上升。这些数据表明，在DSS小鼠模型中，经口给予具有SEQ ID NO:15的递送构建体能够减少结肠炎的症状，这与i.p.给予rhIL-22的作用相当。

此外，如下所述，通过将rhIL-22施用于CD-1小鼠，评估了经口给予具有SEQ IDNO:15的递送构建体的生物标志物。

图10A示出了单次给药体内研究的概览，该研究旨在确定正常CD-1小鼠中rhIL-22单次给药(急性给药)后靶标结合的生物标志物。

图10B示出了多次给药(亚慢性给药)体内研究的概览，该研究旨在确定正常CD-1小鼠中rhIL-22单次和多次给药后靶标结合的生物标志物。

图11A示出了rhIL-22的急性和亚慢性给药以一致的方式增加IL-22的浓度。

图11B示出了在图11A中描述的急性和亚慢性给药实验期间测定的一些药代动力学参数。

图12A示出了对rhIL-22(SEQ ID NO:12)急性给药后1天和rhIL-22(SEQ ID NO:12)亚慢性给药5天后作出反应而诱导的循环中鼠C-反应蛋白(mCRP)的浓度变化。结果显示两个研究组的循环中mCRP均呈时间依赖性地增加。

图12B示出了rhIL-22(SEQ ID NO:12)急性给药后1天血浆mCRP浓度的倍数变化。

图12C示出了rhIL-22(SEQ ID NO:12)亚慢性给药5天后血浆mCRP浓度的倍数变化。

图13A示出了对rhIL-22(SEQ ID NO:12)急性给药后1天和rhIL-22(SEQ ID NO:12)亚慢性给药5天后作出反应而诱导的循环中鼠血清淀粉样蛋白A(mSAA)的浓度变化。结果显示两个研究组的循环中mSAA均呈时间依赖性地增加，其中在给药后约8小时达到近似血浆峰值浓度。

图13B示出了rhIL-22(SEQ ID NO:12)急性给药后1天血浆mSAA浓度的倍数变化。

图13C示出了rhIL-22(SEQ ID NO:12)亚慢性给药5天后血浆mSAA浓度的倍数变化。

图14A示出了对rhIL-22(SEQ ID NO:12)急性给药后1天和rhIL-22(SEQ ID NO:12)亚慢性给药5天后作出反应而诱导的循环中胰岛再生源蛋白3β(Reg3β)的浓度变化。

图14B示出了rhIL-22(SEQ ID NO:12)急性给药后1天血浆Reg3β浓度的倍数变化。

图14C示出了rhIL-22(SEQ ID NO:12)亚慢性给药5天后血浆Reg3β浓度的倍数变化。

这些结果显示，三种潜在的靶标结合的IL-22药效动力学(PD)生物标志物：C-反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和胰岛再生源蛋白3β(Reg3β)可以用于评估诸如那些具有SEQ ID NO:15或17的递送构建体的PD的研究中。

实施例6

蛋白溶解

将627g通过SEQ ID NO:15发酵形成的双重洗涤包涵体(DWIB)重悬于4500mL 8M的盐酸胍(Gu-HCl)和50mM的pH为8.0的Tris。随后，添加50mM的pH为8.5的Tris，使体积达到6.0L。将此溶液在搅拌盘上轻轻搅拌，并加入9.225g还原剂二硫苏糖醇(DTT)。这6L最终溶解的蛋白(SEQ ID NO:15)的溶液由6M的Gu-HCl、50mM的pH为8.0的Tris、10mM的DTT和约1gDWIB/10mL的缓冲液组成。将溶解的蛋白(SEQ ID NO:15)的溶液在室温(RT)下孵育，同时置于磁力搅拌盘上搅拌，然后在4℃下以15,970xg的转速离心90分钟。将包含溶解的蛋白的上清液小心转移到一个总容积为5520mL的新容器中。通过考马斯亮蓝测定法进行蛋白浓度测定，并且其测定是在15mg/mL的条件下进行。

这些数据表明，可以使用以上过程进行蛋白的溶解。

实施例7

蛋白质复性

如图17的流程图中所描述，本实施例显示了作为纯化过程的一部分的蛋白质复性。

复性溶液经过了仔细研究、开发和优化(图18)。优化过程采用了15种不同基质、12个变量和200个复性反应的实验设计(DOE)。通过排除法作出决定。表2给出了最初的复性混合液(含有最初的复性溶液和复性的溶解的蛋白(SEQ ID NO:15))。表3给出了优化的复性混合液(含有优化的复性溶液和复性的溶解的蛋白(SEQ ID NO:15))。

表2-最初的复性混合液

表3-优化的复性混合液

将105L的复性溶液在4℃下孵育16小时，再使用0.8/0.2um的滤膜和Cole-Parmer蠕动泵及管路通过流动过滤器(Pall公司的AkroPac或Sartorius的Sartopore 2XLG)进行过滤。

将实施例6中的溶解的蛋白质(SEQ ID NO:15)(105g)加入100L预冷至4℃的优化的复性溶液中。

这个过程使用设定为73ml/min的Cole-Parmer蠕动泵，并将该过程编程为1小时。这一过程是在4℃的冷室中进行的。

优化的复性缓冲溶液产生了相对于SEQ ID NO:15的聚集体更多的SEQ ID NO:15(图19-图20)。使用最初的复性溶液产生了约10％-15％的正确复性的SEQ ID NO:15。使用优化的复性溶液产生了约45％-55％的正确复性的SEQ ID NO:15。

实施例8

通过TFF UF/DF进行蛋白浓缩和缓冲液置换

本实施例显示了根据超滤/渗滤(UF/DF)原理并利用切向流过滤(TFF)进行的蛋白浓缩和缓冲液置换。

利用TFF系统对复性蛋白质(例如，SEQ ID NO:15的)进行处理，以将其浓缩10倍并执行5倍的缓冲液置换。采用4只10kDa MWCO的Millipore Ultracell Pellican3过滤器(配有1.14m²的TFF平板盒)，通过超滤/渗滤(UF/DF)来进行这个过程。渗滤缓冲液由20mM的pH为7.5的Tris-碱和100mM的NaCl组成。UF/DF过程结束时，终体积为10L。随后，采用Pall公司的AkroPac 0.8/0.2um过滤器和Cole-Parmer蠕动泵及管路并通过流动过滤系统对这种物料进行过滤。进行考马斯亮蓝测定，以确定蛋白浓度、产率和分步收率。在这个时候，进行定量SEC-HPLC以确定存在于复性和UF/DF样品中的正确折叠的具有SEQ ID NO:15的蛋白质的量。使用市售已知浓度的BSA作为参考标准，由此生成标准曲线，用于考马斯亮蓝测定。使用了Agilent 1100HPLC系统和TSKgel SuperSW3000、4μm、4.6mm ID x 30.0cm L柱(TosohBioscience,18675)。基于这种定量测定，确定了复性效率。

这些数据表明，可以使用缓冲液置换和TFF UF/DF来进行蛋白质的复性。

实施例9

使用捕获步骤NH₂-树脂进行蛋白层析

本实施例显示了使用NH₂-树脂在蛋白的阴离子交换层析中的捕获步骤。

将来自通用电气(GE)的AKTA Avant 150或AKTA Pilot FPLC系统用于蛋白层析。将Tosoh的阴离子交换树脂NH₂-用于填充柱，使最低床层高度为至少20cm，以确保柱体积有利于20-25g/L的动态载量。将20mM的pH为4.5的乙酸钠或20mM的pH为4.5的柠檬酸钠的缓冲液用于填充柱。所用的缓冲液如下：缓冲液A：20mM的pH为7.5的Tris、0.5M的NaCl；缓冲液B：20mM的pH为7.5的Tris、2.0M的NaCl。然后用0.5M的NaOH溶液清洗NH₂-750F柱，接触时间为30分钟，再用至少3倍柱体积(CV)的缓冲液A平衡，或者直到pH值和电导率达到预期值的稳定线(pH 7.5-pH 7.7，约49mS/cm+/-1mS/cm)。

在加载到柱上之前，通过添加5M的储备溶液，在UF/DF蛋白(SEQ ID NO:15)溶液中补充0.4M的NaCl，并且测量电导率，以确保电导率为49mS/cm+/-2mS/cm。将这种蛋白(SEQID NO:15)溶液加载到柱上，设定流速为柱停留时间至少5分钟，并收集流穿液。用3倍CV的缓冲液A清洗柱，或者直到280nm处的吸光度恢复，并且在基线处稳定，在280nm处的吸光度接近0.0mAU。在这个时候，先运行20倍CV的从0.0至62.5％的缓冲液B的线性梯度，再运行另外5倍CV的100％的缓冲液B的逐级梯度。全程收集级分，并且其体积不超过0.5倍柱体积。源自不同级分的样品采用Bio-Rad ChemiDoc^TM MP成像系统通过SDS-PAGE进行分析，并且将含有超过90％的SEQ ID NO:15的级分合并起来，将其指定为NH₂-750F-池。使用ThermoFisher Nanodrop One^TM来测定NH₂-750F-池中的蛋白浓度，考虑到SEQ ID NO:15的消光系数为1.22，且260/280nm的比值<0.6，因此在280nm处读取吸光度(A280)。NH₂-750F-池中含有大约1.0M的NaCl。

图21A示出了对SEQ ID NO:15进行NH₂-750F纯化之后的示例性色谱图，其中床层高度为20cm并且柱体积为10mL，而图21B示出的色谱图，其中床层高度为30cm并且柱体积为4.6L。

表4显示了对SEQ ID NO:15进行NH₂-750F纯化的概览，而表5显示的是对SEQ IDNO:14纯化的概览，SEQ ID NO:14通常以类似于SEQ ID NO:15的方式产生、复性和纯化。

表4-对SEQ ID NO:15进行NH₂-750F纯化的概览

表5-对SEQ ID NO:14进行NH₂-750F纯化的概览

实施例10

使用工艺进行蛋白层析

本实施例显示了在蛋白层析中使用工艺进行的精制纯化步骤。

将来自通用电气(GE)的AKTA Avant 150或AKTA Pilot FPLC系统用于对SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:14的蛋白进行蛋白层析。将Tosoh的羟基磷灰石混合模式的树脂用于为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:14中的每一种填充最低床层高度为至少10cm的柱，以确保柱体积会有利于高达20g/L的动态载量。对于SEQ ID NO:15，所用的缓冲液如下：缓冲液A：20mM的pH为7.5的Tris、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂；缓冲液B：200mM的pH为7.0的磷酸钠、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂；对于SEQ ID NO:14，所用的缓冲液如下：缓冲液A：20mM的pH为7.5的Tris、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂；缓冲液B：200mM的pH为7.0的磷酸钠、100mM的NaCl和1mM的CaCl₂；然后用0.5M的NaOH清洗每根柱，接触时间为30分钟或更长，再用至少3倍柱体积(CV)的缓冲液A平衡，或者直到pH值和电导率达到预期值的稳定线(pH 7.5-pH 7.7，约11mS/cm+/-1mS/cm)。在将NH₂-750F-池加载到柱上之前，无需对其进行处理。这显著减少了蛋白质损失、时间和资源。将这种NH₂-750F-池加载到柱上，设定流速为柱停留时间至少5分钟，并收集流穿液。用3倍CV的缓冲液A清洗柱，或者直到280nm处的吸光度恢复，并且在基线处稳定，吸光度接近0.0mAU。在这个时候，先运行25倍CV的从0至25％的缓冲液B的线性梯度，再运行另外5倍CV的100％的缓冲液B的逐级梯度。全程收集级分，并且根据洗脱曲线，其体积介于0.36至1.43倍柱体积。源自不同级分的样品采用ChemiDoc^TM MP成像系统通过SDS-PAGE进行分析，并且将含有超过95％的SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:14的级分合并起来，将其指定为CaPure-池。使用Thermo Fisher NanodropOne^TM来测定CaPure-池中的蛋白浓度，考虑到SEQ ID NO:15的消光系数为1.22，且260/280nm的比值<0.6，因此在280nm处读取吸光度(A280)。

图22A示出了对SEQ ID NO:15进行纯化之后的示例性色谱图，其中床层高度为10cm并且柱体积为5mL，而图22B示出的色谱图，其中床层高度为21cm并且柱体积为800mL。

表6显示了对SEQ ID NO:15进行纯化的概览，而表7显示的是对SEQ IDNO:14纯化的概览。

表6-对SEQ ID NO:15进行纯化的概览

表7-对SEQ ID NO:14进行纯化的概览

实施例11

通过TFF UF/DF进行蛋白浓缩

本实施例显示了通过TFF UF/DF过程进行的蛋白配制。

通过TFF系统(Pall corporation)，将池浓缩至20mg/mL的终浓度，再进行的5倍的缓冲液置换。采用3只10kDa MWCO的Millipore Pellican3过滤器(配有0.114m²的TFF平板盒)，通过超滤/渗滤(UF/DF)来进行这个过程。渗滤缓冲液由10mM的pH为7.0的磷酸钠和100mM的NaCl组成。随后，采用Pall公司的AkroPac 0.8/0.2um过滤器和Cole-Parmer蠕动泵及管路并通过流动过滤系统对这种配制的SEQ ID NO:15进行过滤。然后，经配制的SEQ ID NO:15在-80℃下以等份的形式储存，并进行了以下分析以确保其生物物理性质：(1)考虑到蛋白的消光系数为1.22，因此使用Thermo Fisher Nanodrop One^TM并通过测量在280nm处的吸光度(260/280nm的比值<0.6)，来获得20mg/mL的蛋白质(如，SEQID NO:15)浓度；(2)由Charles River实验室设备、通过鲎试剂法(LAL)检测的内毒素水平低于1.0Eu/mg；(3)使用TSKgel GW3000SWXL、5μm、7.8mm ID x 30.0cm L柱(TosohBioscience,8541)，通过SEC-HPLC分析的纯度高于97％(通常>98％)；(4)使用Bio-Rad凝胶仪器及其相关的ChemiDoc^TM MP成像系统，进行SDS-PAGE分析。

实施例12

纯化的融合分子的体内活性评估

本实施例显示了用于验证融合分子正确折叠的方法，该方法涉及融合分子携带生物活性货物穿过完整上皮的能力。

将具有SEQ ID NO:15的融合蛋白在大肠杆菌中表达，再从包涵体中收集，并使用如以上实施例8所描述的混洗置换缓冲液体系进行折叠。根据融合分子的分子特征，按照实施例9和实施例10中描述的方法以及表4-表7中示例的汇总，对所生成的物料进行纯化。基于SDS-PAGE，这种配制的蛋白纯度约为98％。在25nM和250nM浓度下，使用具有SEQ ID NO:15的融合分子处理上皮细胞。通过流式细胞术检测活/死细胞，与未经处理的配对细胞相比，经过SEQ ID NO:15处理的细胞，出现细胞数量的呈剂量依赖性减少。数值代表n＝4±标准差。

实施例13

融合蛋白纯化的规模扩大

本实施例显示了SEQ ID NO:15的融合蛋白纯化方法的放大(图7A和图7B)。

具有SEQ ID NO:15的融合蛋白在两种不同的规模上纯化。

第一纯化使用体积为10mL的层析柱进行，并填充NH₂-树脂，参数如下：床层高度：20cm，停留时间：5分钟(流速：2mL/min)，缓冲液A：20mM的pH为7.5的Tris、0.5M的NaCl，缓冲液B：20mM的pH为7.5的Tris、2M的NaCl，以及采用以下梯度：0.0-62.5％的缓冲液B、运行20倍的柱体积(CVs)。获得了具有SEQ ID NO:15的融合蛋白，纯度为93-96％、收率>71％，并且内毒素水平<1.0EU/mg。

第二纯化使用体积为4.6L的层析柱进行，并填充NH₂-树脂，参数如下：床层高度：30cm，停留时间：11.55min(流速：400mL/min)，缓冲液A：20mM的pH为7.5的Tris、0.5M的NaCl，缓冲液B：20mM的pH为7.5的Tris、2M的NaCl，以及采用以下梯度：0.0-62.5％的缓冲液B、运行20倍的柱体积(CV)。获得了具有SEQ ID NO:15的融合蛋白，纯度为93-96％、收率>71％，并且内毒素水平<1.0EU/mg。

实施例14

工艺的分步收率之间的一致性

在纯化过程中，对SEQ ID NO:15的融合蛋白进行了4次纯化(批次1-4)，并在纯化过程的每个阶段后评估该融合蛋白的收率(表8)。在这些重复之间，融合蛋白的收率具有高度的一致性。

表8在4次重复的纯化过程中，SEQ ID NO:15的融合蛋白的收率

这些数据表明，本公开的方法和组合物允许大规模地生产和纯化治疗性融合蛋白，并且本公开的方法和组合物在放大过程中提供了高度的一致性。

本文公开的和要求保护的所有方法均可以根据本公开提出和执行，而无需进行不当的实验。尽管本公开的组合物和方法已经以优选实施方案的形式进行了描述，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开的概念、精神和范围的前提下，可以对本文所述的方法和步骤或步骤的顺序进行变动。更具体地说，显然，某些在化学上和生理上都相关的作用剂可以替代本文所述的作用剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员来说显而易见的是，所有这些类似的替代和修改都被视为处于如所附权利要求所定义的本公开的精神、范围和概念内。

实施例15

SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的比较

对代表SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的纯化的组合物进行了液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析，其结果分别如图23B和图23A所示。SEQ ID NO:17的组合物以类似于上述与SEQ ID NO:15的组合物有关的方式产生、复性和纯化。

实施例16

递送构建体的体内评估

本实施例描述了具有SEQ ID NO:15的序列的递送构建体相对于溶剂对照的体内评估。

图24显示了单次给药的研究概览，该研究用于评价经口(此处简称为P.O.)递送具有序列SEQ ID NO:15的递送构建体之后，该构建体转运通过肠上皮而进入循环。这些实验中使用的动物是未禁食的CD-1雄性小鼠。主要研究终点是血浆IL-22的总暴露量，次要研究终点是血浆生物标志物，包括IL-22结合蛋白(例如，IL-22BP)。

表9提供了有关实验设置的详细信息，包括关于液体(未配制)递送构建体和溶剂的信息。

表9-体内研究的实验设置

表10汇总了本实验中递送的SEQ ID NO:15构建体的特性。

表10-以液体形式递送的递送构建体的特性

在相应的时间点测定血浆IL-22总暴露量，如表9所示。图25A显示了全身IL-22的总暴露量(单位：pg/mL)，图25B显示了在采集血样和测定的不同时间点的IL-22BP暴露量(单位：pg/mL)。图26A-图26B显示了本研究中测试的每个组的个体测量值和数据点。

据观察，经口施用具有SEQ ID NO:15所示序列的递送构建体在血浆中提供了IL-22。

实施例17

间隔体的长度以及效应分子与载体的N-末端或C-末端偶联不会显著影响效应分子的生物活性

本实施例示出了不同长度的氨基酸接头以及异源性效应分子与载体N-末端的偶联不会显著影响效应分子包含在递送构建体中时与其靶标的结合能力。所检测的氨基酸接头是SEQ ID NO:13(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:28(GGGGS)和SEQ ID NO:31(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。

通过接种DiscoverX HEK293细胞，并使用所示浓度的激动剂(包含IL-22效应分子的递送构建体)孵育细胞16小时(每孔5,000个细胞)而进行IL-22受体二聚化的测定。使用eXpress IL22RA1/IL10RB二聚化测定法在读板仪上读取终点发光值。

图27A示出了当IL-22(SEQ ID NO:11)包含在具有SEQ ID NO:15、32和33的递送构建体中时，具有SEQ ID NO:13、28和31的氨基酸间隔体的长度不会影响IL-22诱导IL-22受体二聚化的能力。对照组重组人IL-22(rhIL-22,SEQ ID NO:12)对受体二聚化的诱导作用由黑色曲线表示。

图27B示出了IL-22效应分子(SEQ ID NO:11)经由间隔体(具有SEQ ID NO:28)偶联至载体(包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266)的N-末端或C-末端，并不会显著改变递送构建体(具有SEQ ID NO:32、34和35)诱导IL-22受体二聚化的能力。对照组重组人IL-22(rhIL-22)对受体二聚化的诱导作用由黑色曲线表示。

使用10μL不同浓度的激动剂(相应的递送构建体或IL-22对照)与Colo205细胞一起孵育15分钟，进行pSTAT3激活测定。然后，使用MSD STAT3板(货号：N450SMA-1)读取pSTAT3的激活程度。

图27C示出了当IL-22(SEQ ID NO:11)包含在具有SEQ ID NO:15、32和33的递送构建体中时，具有SEQ ID NO:13、28和31的氨基酸间隔体的长度不会影响IL-22诱导pSTAT3激活的能力。对照组重组人IL-22(rhIL-22,SEQ ID NO:12)的pSTAT3激活由黑色曲线表示。

图27D示出了IL-22效应分子(SEQ ID NO:11)经由间隔体(具有SEQ ID NO:28)偶联至载体(包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-266)的N-末端或C-末端，并不会显著改变递送构建体(具有SEQ ID NO:32、34和35)诱导pSTAT3激活的能力。对照组重组人IL-22(rhIL-22)的pSTAT3激活由黑色曲线表示。