具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。

共刺激抗原受体(CoStAR)

本文提供了重组共刺激抗原受体(CoStAR)，包括：(i)疾病或肿瘤相关抗原结合结构域；(ii)刺激性受体蛋白的细胞外配体结合区段，和(iii)包含受体蛋白的细胞内信号传导结构域的第一细胞内区段，和(iv)可选地包含第二受体蛋白的细胞内信号传导结构域的第二细胞内区段。在某些实施方案中，细胞外区段和第一细胞内区段包括相同受体蛋白的区段。在某些实施方案中，细胞外区段和第一细胞内区段包括不同受体蛋白的区段。在本发明的实施方案中，在细胞外区段和第一细胞内区段之间存在插入的跨膜结构域。包含可选的第二细胞内区段和/或可选的第三细胞内区段的实施方案进一步可以包括细胞内区段之间的间隔区。在简单的形式中，本发明的CoStAR包括与全长 CD28融合的单链抗体片段(scFv)，该片段根据scFv与其同源抗原的结合和/或CD28与其同源配体的结合传递共刺激信号。如本文所使用的，“全长蛋白质”或“全长受体”是指受体蛋白，例如CD28受体蛋白。术语“全长”包含一旦其信号肽被切割，在成熟受体蛋白的N端处缺少多达约5个或多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9或10个氨基酸的受体蛋白。例如，虽然可以定义受体N端信号肽的特定切割位点，但已观察到确切切割点的可变性。术语“全长”并不意味着受体N端信号肽的氨基酸的存在或不存在。在一个实施方案中，术语“全长”(例如根据本发明的某些方面的全长CD28)包含缺少N端信号肽的成熟受体蛋白(例如根据本发明的某些方面的CD28)，一旦其信号肽被切割，在成熟受体蛋白的N端缺少多达约5个，例如1、2、3、 4、5或多达10个氨基酸。SEQ ID NO.2示出了包含信号肽的成熟CD28蛋白。如上所述，根据本发明的各个方面的“全长”CD28受体不包括信号肽并且可以在成熟受体蛋白的N端(例如N端残基N、K、I、L和/或V)缺少多达约5个，例如1、2、3、4、5或多达10个氨基酸。这在示例性融合中示出，例如SEQ ID No.4-12(注意这些可能在成熟受体蛋白的N端缺少多达约5个，例如1、2、3、4、5或多达10个氨基酸，如框区域中所示)。

CoStAR具有模块化形式，并且可以构建为包括从一种或多种蛋白质获得的细胞外、跨膜和细胞内结构域，以及从与疾病相关抗原(例如肿瘤相关抗原)结合的抗体获得的scFv。

根据本发明，在一个实施方案中，CoStAR包括疾病相关的(例如肿瘤相关的) 抗原受体，例如但不限于肿瘤相关的抗原特异性scFv，以及能够与其同源配体结合并提供细胞内信号的初级共刺激受体蛋白。在某些实施方案中，初级共刺激受体可以小于全长蛋白质但足以结合同源配体并转导信号。在某些实施方案中，初级共刺激受体结构域是全长的，例如但不限于全长CD28。因此，抗原特异性结合结构域和配体特异性受体都能够分别结合同源抗原和配体。图1描绘了CoStAR构建体的两个实施例。两种 CoStAR均包括抗原结合结构域、可选的间隔区和包含细胞外配体结合区段和细胞内信号传导结构域的全长共刺激受体蛋白。在另一个实施方案中，CoStAR包括抗原结合结构域、可选的间隔区、共刺激受体蛋白的细胞外配体结合部分、跨膜结构域和第二不同共刺激受体蛋白的细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞外配体结合部分包括CD28截短，例如，如SEQ ID NO:13中氨基酸IEV之后的C端CD28截短，其后是细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域来自CD40。分隔细胞外配体结合和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域可以来自但不限于CD28、 CD40。与图1的左侧构建体相比，图1的右侧构建体进一步包括另外的第二细胞内受体信号传导结构域和可选的间隔区。在进一步的实施方案中，CoStAR可以包括另外的共刺激结构域，例如第三细胞内共刺激信号传导结构域，并且在这方面可以类似于某些嵌合抗原受体(CAR)，其已被分类为第一(仅CD3ζ)、第二(一个共刺激结构域+CD3ζ)或第三代(多于一个共刺激结构域+CD3ζ)。

可用于本发明的CoStAR的共刺激受体蛋白包括但不限于CD2、CD9、 CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、 CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、 CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6，其天然形式包括细胞外配体结合结构域和细胞内信号转导结构域。例如，CD2被表征为在T细胞表面发现的细胞粘附分子，并且能够启动T细胞活化所必需的细胞内信号。CD27被表征为属于TNF超家族(TNFSF)的II型跨膜糖蛋白，其在B细胞上的表达由B细胞中的抗原受体活化诱导。 CD28是T细胞上的一种蛋白质，是抗原呈递细胞上的CD80(B7.1)和CD86(B7.2)配体的受体。CD137(4-1BB)配体发现于大多数白细胞和一些非免疫细胞上。OX4配体在许多抗原呈递细胞上表达，例如DC2(树突细胞)、巨噬细胞和B淋巴细胞。在一个实施方案中，共刺激受体蛋白是如本文定义的全长CD28。

在本发明的实施方案中，CoStAR可以在具有治疗活性的治疗性细胞群(例如肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL))中在启动子的控制下单独表达。或者，CoStAR可以与治疗性转基因一起表达，例如嵌合抗原受体(CAR)和/或T-细胞受体(TCR)，例如如SEQ ID NO:3-12中所述(注意可能在成熟受体蛋白的N端缺少多达约5个，例如1、2、3、4、 5或多达10个氨基酸)。因此，一方面，本发明还涉及具有如SEQ ID NOs:3-12中任一项所示的序列的CoStar构建体，包括这些序列中的一个，其在成熟受体蛋白的N端缺少多达约5个，例如1、2、3、4、5个或最多10个氨基酸)。合适的TCR和CAR在文献中是众所周知的，例如HLA-A*02-NYESO-1特异性TCR(Rapoport et al.Nat Med 2015)或抗CD19scFv.CD3ζ融合CAR(Kochenderfer et al.JClin Oncol 2015)，其已被分别成功用于治疗骨髓瘤或B-细胞恶性肿瘤。本文所述的CoStAR可以用任何已知的CAR或TCR 表达，从而为细胞提供可调节的生长开关以允许体外或体内细胞扩增，以及TCR或 CAR形式的用于抗癌症活性的常规活化机制。因此，本发明提供了用于过继细胞治疗的细胞，该细胞包括如本文所述的CoStAR和特异性结合肿瘤相关抗原的TCR和/或CAR。包含CD28的示例性CoStAR包括细胞外抗原结合结构域和细胞外、跨膜和细胞内信号传导结构域，其包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

如本文所使用的，术语“抗原结合结构域”是指抗体片段，包括但不限于双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或更多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合至抗原但不包括完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合结构域能够结合亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)所结合的相同抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段可以包括一个或更多个来自特定人抗体的互补决定区(CDR)，其移植到来自一种或更多种不同人抗体的骨架 (FR)上。

可以使抗原结合结构域对任何疾病相关抗原具有特异性，包括但不限于肿瘤相关抗原(TAA)和传染病相关抗原。在某些实施方案中，配体结合结构域是双特异性的。抗原已经在大多数人类癌症中被鉴定出，包括Burkitt淋巴瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌。TAA包括但不限于 CD19、CD20、CD22、CD24、CD33、CD38、CD123、CD228、CD138、BCMA、 GPC3、CEA、叶酸受体(FRα)、间皮素、CD276、gp100、5T4、GD2、EGFR、MUC- 1、PSMA、EpCAM、MCSP、SM5-1、MICA、MICB、ULBP和HER-2。TAA进一步包括新生抗原、肽/MHC复合物和HSP/肽复合物。

在某些实施方案中，抗原结合结构域包括与确定的肿瘤特异性肽-MHC复合物结合的T-细胞受体或其结合片段。术语“T细胞受体”或“TCR”是指由在T细胞表面上配对的αβ或γδ链组成的异二聚体受体。每条α、β、γ和δ链都由两个Ig样结构域组成：通过互补决定区(CDR)赋予抗原识别的可变结构域(V)，随后是通过连接肽和跨膜(TM)区锚固至细胞膜的恒定结构域(C)。TM区与CD3信号传导装置的不变亚基相关联。每个V结构域具有三个CDR。这些CDR与结合至主要组织相容性复合体(pMHC) 编码的蛋白质的抗原肽之间的复合物相互作用(Davis and Bjorkman(1988)Nature,334, 395-402；Davis et al.(1998)Annu RevImmunol,16,523-544；Murphy(2012),xix,868p.)。

在某些实施方案中，抗原结合结构域包括肿瘤表达蛋白或其肿瘤结合片段的天然配体。例如，转铁蛋白受体1(TfR1)也称为CD71，是同源二聚体蛋白，是细胞铁稳态和增殖的关键调节剂。尽管TfR1在多种细胞中以低水平表达，但它在快速增殖的细胞中以较高水平表达，包括过表达与不良预后相关的恶性细胞。在本发明的实施方案中，抗原结合结构域包括转铁蛋白或其转铁蛋白受体结合片段。

在某些实施方案中，抗原结合结构域对确定的肿瘤相关抗原具有特异性，例如但不限于FRα、CEA、5T4、CA125、SM5-1或CD71。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原可以是肿瘤特异性肽-MHC复合物。在某些此类实施方案中，肽是新生抗原。在其它实施方案中，肿瘤相关抗原是肽-热休克蛋白复合物。

在本发明的实施方案中，CoStAR细胞外、跨膜和细胞内结构域信号传导结构域具有如SEQ ID NO:1所示的序列。

如本文所使用的，术语“特异性结合”或“对……具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，例如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其在存在分子(包括生物分子)的异质群时确定靶标的存在。例如，与靶标(其可以是表位)特异性结合的抗体部分是以比其与其它靶标结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合靶标的抗体部分。在一些实施方案中，与抗原特异性结合的抗体部分与抗原的一种或更多种抗原决定簇(例如细胞表面抗原或肽/MHC蛋白复合物)反应，其结合亲和力至少约为其对其它靶标的结合亲和力的10倍。

间隔区结构域

本发明的CoStAR可选地包括抗原结合结构域和共刺激受体之间的间隔区。如本文所使用的，术语“间隔区”是指将抗原结合结构域与共刺激蛋白的外部配体结合结构域分开的CoStAR的细胞外结构区。间隔区提供了接近靶向抗原和受体配体的灵活性。在某些实施方案中，使用长间隔区，例如靶向膜近端表位或糖基化抗原(参见Guest R.D.et al.Therole of extracellular spacer regions in the optimal design of chimeric immunereceptors:evaluation of four different scFvs and antigens.J.Immunother.2005；28:203–211； Wilkie S.et al.,Retargeting of human T cells to tumor-associatedMUC1:the evolution of a chimeric antigen receptor.J.Immunol.2008；180:4901–4909)。在其它实施方案中，CoStAR 带有短间隔区，例如靶向膜远端表位(参见HudecekM.et al.,Receptor affinity and extracellular domain modifications affecttumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor Tcells.Clin.Cancer Res.2013；19:3153–3164；Hudecek M.et al.,The nonsignallingextracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for invivo antitumor activity.Cancer Immunol.Res.2015；3:125–135)。在某些实施方案中，间隔区包括IgG铰链的全部或部分或来源于IgG铰链，包括但不限于IgG1、IgG2或IgG4。“来源于IgG 铰链”是指在IgG铰链中包括插入、缺失或突变的间隔区。在某些实施方案中，间隔区可以包括一个或更多个抗体恒定结构域的全部或部分，例如但不限于CH2和/或CH3结构域。在某些实施方案中，在包含CH2结构域的全部或部分的间隔区中，CH2结构域被修饰以便不与Fc受体结合。例如，已发现骨髓细胞中的Fc受体结合会损害CAR T细胞功能性。在某些实施方案中，间隔区包括来自CD28、CD8或包含铰链区的其它蛋白质的Ig样铰链的全部或部分。在包含间隔区的本发明的某些实施方案中，间隔区的长度为 1至50个氨基酸。

信号传导结构域

如上所述，在某些实施方案中，CoStAR包括全长初级共刺激受体，其可以包含但不限于CD2、CD9、CD26、CD27、CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、 CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137 (41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6的细胞外配体结合和细胞内信号传导部分。在其它实施方案中，共刺激受体包括嵌合蛋白，例如包含上述蛋白质之一的细胞外配体结合结构域和上述蛋白质中另一种的细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，CoStAR的信号传导部分包括单个信号传导结构域。在其它实施方案中，CoStAR的信号传导部分包括第二细胞内信号传导结构域，例如但不限于：CD2、CD27、CD28、CD40、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150 (SLAM)。在某些实施方案中，第一和第二细胞内信号传导结构域是相同的。在其它实施方案中，第一和第二细胞内信号传导结构域是不同的。在某些实施方案中，共刺激受体能够二聚化。不受理论束缚，据认为，CoStAR与其它辅助分子二聚化或缔合以引发信号。在某些实施方案中，CoStAR通过跨膜结构域相互作用与辅助分子二聚化或缔合。在某些实施方案中，与辅助分子的二聚化或缔合由共刺激受体的细胞内部分和/或细胞外部分中的共刺激受体相互作用辅助。

跨膜结构域

尽管跨膜的主要功能是将CoStAR锚定在T细胞膜中，但在某些实施方式中，跨膜结构域影响CoStAR功能。在某些实施方案中，跨膜结构域包含在全长初级共刺激受体结构域中。在其中CoStAR构建体包括一种受体的细胞外结构域和第二受体的细胞内信号传导结构域的本发明的实施方案中，跨膜结构域可以是细胞外结构域或细胞内结构域的跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域来自CD4、CD8α、CD28或 ICOS。Gueden等人将ICOS跨膜结构域的使用与增加的CAR T细胞持久性和总的抗肿瘤功效相关联(Guedan S.et al.,Enhancing CAR T cell persistence through ICOS and 4-1BB costimulation.JCIInsight.2018；3:96976)。在实施方案中，跨膜结构域包括跨越细胞膜的疏水性α螺旋。

根据本发明的CoStAR信号传导结构域的实例以SEQ ID NO.3-12提供。

变体

在一些实施方案中，考虑了本文提供的抗体部分或其它部分的氨基酸序列变体。例如，可能需要提高抗体部分的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体部分的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体部分的核苷酸序列或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，抗体部分的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以达到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特性，例如抗原结合。

在一些实施方案中，提供了包含一个或更多个氨基酸取代、缺失或插入的抗体结合结构域部分。突变变化的目标位点包括抗体结合结构域重链和轻链可变区(VR)和骨架(FR)。可以将氨基酸取代引入目标结合结构域，并筛选具有所需活性的产物，例如保留/ 改善的抗原结合或降低的免疫原性。在某些实施方案中，可以将氨基酸取代引入初级共刺激受体结构域(细胞外或细胞内)、次级共刺激受体结构域或细胞外共受体结构域中的一个或更多个。因此，本发明包含本文特别公开的CoStAR蛋白和组成部分及其变体，即，CoStAR蛋白和组成部分与本文特别公开的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。当提及特定序列时，术语“相似性百分比”、“同一性百分比”和“同源性百分比”按照威斯康星大学GCG 软件程序BestFit中的规定使用。可以使用其它算法，例如BLAST、psiBLAST或 TBLASTN(使用Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:405-410的方法)、FASTA(使用 Pearson and Lipman(1988)PNAS USA 85:2444-244的方法)。

特定氨基酸序列变体可以通过插入、添加、取代或缺失1个氨基酸、2、3、 4、5-10、10-20或20-30个氨基酸而区别于参考序列。在一些实施方案中，变体序列可以包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个被插入、缺失或取代的残基的参考序列。例如，可以插入、缺失或取代5、10、15、多达20、多达30或多达40个残基。

在一些优选的实施方案中，变体可以与参考序列有1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10或更多个保守取代的区别。保守取代涉及用具有相似特性的不同氨基酸替换氨基酸。例如，脂肪族残基可以被另一个脂肪族残基替换，非极性残基可以被另一个非极性残基替换，酸性残基可以被另一个酸性残基替换，碱性残基可以被另一个碱性残基替换，极性残基可以被另一个极性残基替换，或者芳香族残基可以被另一个芳香族残基替换。例如，保守取代可以在以下组内的氨基酸之间：

保守取代如下表所示。

根据通常的侧链特性，氨基酸可以分为不同的类别：a.疏水性：正亮氨酸、 Met、Ala、Val、Leu、Ile；b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；c.酸性：Asp、 Glu；d.碱性：His、Lys、Arg；e.影响链定向的残基：Gly、Pro；芳香族：Trp、Tyr、 Phe。非保守取代将需要将这些类别之一的成员与另一类别交换。

细胞

本发明中使用的细胞可以是用于过继细胞治疗的任何淋巴细胞，例如T-细胞或自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、γ/δT-细胞或T调节细胞。细胞对于患者可以是同种异体的或自体的。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中具有核心作用的淋巴细胞类型。它们可以通过细胞表面上的T-细胞受体(TCR)的存在与其它淋巴细胞(例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))区分开来。有多种类型的T细胞，总结如下。细胞毒性T细胞 (TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还与移植排斥有牵连。CTL在其表面表达CD8分子。

这些细胞通过结合与MHC I类相关的抗原来识别它们的靶标，抗原存在于所有有核细胞的表面。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其它分子，可以使CD8+细胞失活至无反应状态，其预防自身免疫性疾病，例如实验性自身免疫性脑脊髓炎。

记忆T细胞是抗原特异性T细胞的亚组，在感染解决后会长期存在。它们在重新接触其同源抗原后迅速扩大为大量的效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T 细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。调节性T细胞(Treg细胞)以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中的负选择过程的自身反应性T细胞。

已经描述了CD4+Treg细胞的两个主要类别——天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。天然存在的Treg细胞(也称为CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg细胞)出现在胸腺中，并与发育中的T细胞与TSLP激活的髓样(CD11c⁺)和浆细胞样(CD123⁺)树突细胞之间的相互作用有关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其它T细胞区分开来。适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可能起源于正常的免疫反应。

自然杀伤细胞(或NK细胞)是一种溶细胞性细胞，构成先天免疫系统的一部分。NK细胞以独立于MHC的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速反应。NK 细胞(属于先天淋巴细胞群)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并组成从产生B淋巴细胞和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化而来的第三种细胞。

在某些实施方案中，本发明的治疗细胞包括被工程化以表达CoStAR的自体细胞。在某些实施方案中，本发明的治疗细胞包括被工程化以表达CoStAR的同种异体细胞。由于TCR介导的受体同种异体抗原识别，表达CoStAR的自体细胞可能有利于避免移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。而且，CoStAR受体的免疫系统可以攻击注入的CoStAR细胞，导致排斥反应。在某些实施方案中，为了防止GVHD和减少排斥反应，通过基因组编辑从同种异体CoStAR细胞中去除内源性TcR。

核酸

本发明的一方面提供了本发明的核酸序列，编码本文所述的任何CoStAR、多肽或蛋白质(包括其功能部分和功能变体)。如本文所使用的，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本文所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映将在其中表达多肽的任何特定宿主生物的密码子使用，例如密码子优化。根据本发明的核酸可以包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是多核苷酸，其中包括合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架、在分子的3'和/或5'端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解，可以通过本领域可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强目标多核苷酸的体内活性或寿命。

与核苷酸序列相关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括来自或对序列的一种(或更多种)核酸的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或添加。

核酸序列可以编码如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列或其变体。核苷酸序列可以包括如SEQ ID NO:1所示的密码子优化的人CD28核酸序列或其变体(在图1中表示)。

本发明还提供了核酸序列，其包括编码CoStAR的核酸序列和编码T-细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的另外的核酸序列。

核酸序列可以通过允许两个或更多个核酸序列共表达的序列连接。例如，构建体可以包括内部启动子、内部核糖体进入序列(IRES)序列或编码切割位点的序列。切割位点可以是自切割的，使得当产生多肽时，它立即被切割成分离的蛋白质，而不需要任何外部切割活性。各种自切割位点是已知的，包括口蹄疫病毒(FMDV)和2A自切割肽。共表达序列可以是内部核糖体进入序列(IRES)。共表达序列可以是内部启动子。

载体

一方面，本发明提供了包含本发明的核酸序列或核酸构建体的载体。

此类载体可用于将核酸序列或核酸构建体引入宿主细胞，以使其表达根据本发明的第一方面的一种或更多种CoStAR和可选地一种或更多种其它目标蛋白质(POI)，例如TCR或CAR。载体可以例如是质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成mRNA。

本发明的核酸还可以用于使用标准基因送递方案的核酸免疫和基因治疗。基因送递的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、 5,589,466，在此以其全文形式通过引用并入。

来源于逆转录病毒(例如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。载体可以能够转染或转导淋巴细胞，包括T细胞或NK细胞。本发明还提供了其中插入了本发明的核酸的载体。编码CoStAR和可选的TCR或CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CoStAR和 TCR/CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接到一个或更多个启动子并将构建体引入表达载体中来实现。

另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近有许多启动子也被证明包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此颠倒或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到相距50bp。

合适启动子的一个示例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适启动子的另一个示例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。但是，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳氏(Rous)肉瘤病毒启动子，以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。

载体可以适用于真核细胞中的复制和整合。典型的克隆载体包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调节所需核酸序列表达的启动子。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory,New York)以及其它病毒学和分子生物学手册(另参见， WO01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)中。在一些实施方案中，构建体如SEQ IDNO:3-12中所示(图2中图示)。在一些实施方案中，核酸是多顺反子构建体，其允许在单个启动子的控制下表达多种转基因(例如，CoStAR和TCR和/或CAR等)。在一些实施方案中，转基因(例如，CoStAR和TCR和/或CAR等)被自切割2A肽分开。可用于本发明的核酸构建体的2A肽的示例包括F2A、P2A、T2A和E2A。在本发明的其它实施方案中，本发明的核酸构建体是包含两个启动子的多顺反子构建体；一个启动子驱动CoStAR的表达，而另一个启动子驱动TCR或CAR的表达。在一些实施方案中，本发明的双启动子构建体是单向的。在其它实施方案中，本发明的双启动子构建体是双向的。为了评估CoStAR多肽或其部分的表达，引入细胞中的表达载体还可以包含选择标记基因或报告基因或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或转导的细胞群中识别和选择表达细胞。

细胞来源

在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)。术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫反应的活的生物体 (例如哺乳动物)。受试者的示例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。

一方面，通过裂解红细胞并去除单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。

可以通过正选择或负选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD3+、 CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，一方面，通过与抗CD3/ 抗CD28缀合的珠粒(例如M-450CD3/CD28 T)温育来分离T细胞，持续足以正选择所需T细胞的时间段。一方面，时间段为约30分钟。在进一步的方面，时间段的范围是从30分钟到36小时或更长，以及其间的所有整数值。在进一步的方面，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一优选的方面，时间段为10到24小时。一方面，温育时间段为24小时。在与其它细胞类型相比，T细胞很少的任何情况下，例如从肿瘤组织或从免疫功能低下的个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)时，可以使用更长的温育时间来分离T细胞。此外，使用更长的温育时间可以提高捕获CD8+ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或减少珠粒与T细胞的比值(如本文进一步描述的)，可以在培养开始时或在过程中的其它时间点优先选择或负选择T细胞亚群。此外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠粒或其它表面上的比例，可以在培养开始时或在其它所需时间点优先选择或负选择T细胞亚群。技术人员会认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择”的细胞也可以进行进一步的多轮选择。

通过负选择富集T细胞群可以通过针对负选择细胞特有的表面标记的抗体组合来完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对负选择细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD16、HLA-DR和 CD8的抗体。在某些方面，可能希望富集或正选择典型地表达CD4+、CD25+、 CD62Lhi、GITR+、CD137、PD1、TIM3、LAG-3、CD150和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些方面，通过抗CD25缀合的珠粒或其它类似的选择方法去除T调节细胞。

本文所述的方法可以包括，例如，使用例如负选择技术(例如本文所述的)选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，其是去除T调节细胞的群体、去除CD25+的细胞。优选地，去除T调节细胞的群体包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、 4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。

可以通过正选择技术富集与靶抗原特异性结合的CoStAR效应细胞的特定亚群。例如，在一些实施方案中，通过与靶抗原缀合的珠粒温育足以正选择所需abTCR效应细胞的时间段来富集效应细胞。在一些实施方案中，时间段为约30分钟。在一些实施方案中，时间段的范围为从30分钟到36小时或更长(包括这些值之间的所有范围)。在一些实施方案中，时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施方案中，时间段为10到24小时。在一些实施方案中，温育时间段为24小时。为了分离异质细胞群中以低水平存在的效应细胞，使用更长的温育时间(例如24小时)可以提高细胞产量。在与其它细胞类型相比，效应细胞很少的任何情况下，可以使用更长的温育时间来分离效应细胞。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。在去除血浆和血小板的洗涤步骤后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在本文中将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的 PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、 20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或其它合适的细胞冷冻培养基(含有例如Hespan和 PlasmaLyte A)，然后将细胞以每分钟1°的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的汽相中。可以使用其它受控的冷冻方法，也可以立即在-20℃或液氮中进行非受控的冷冻。

同种异体CoStAR

在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少内源性T细胞受体(TCR)和/或人类白细胞抗原(HLA)表达的同种异体T细胞，例如HLA I类和/或HLA II 类。

缺少功能性内源性TCR的T细胞可以例如，被工程化使其不在其表面表达任何功能性TCR，被工程化使其不表达包含功能性TCR的一个或更多个亚基(例如，被工程化使其不表达(或表现出降低的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或 TCRζ)或被工程化使其在其表面产生非常少的功能性TCR。或者，T细胞可以表达显著受损的TCR，例如通过表达TCR的一个或更多个亚基的突变或截短形式。术语“显著受损的TCR”是指该TCR不会在宿主中引发不利的免疫反应。

本文所述的T细胞可以例如被工程化使其不在其表面表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以被工程化使得细胞表面表达HLA(例如HLA 1类和/或HLA II 类)被下调。在一些方面，HLA的下调可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来完成。

在一些实施方案中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I 类和/或HLA II类。缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何合适的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或更多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。

在一些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或低水平表达抑制分子的细胞，例如通过本文所述的任何方法工程化的细胞。例如，细胞可以是不表达或低水平表达抑制分子的细胞，例如，其可以降低表达CoStAR的细胞引发免疫效应反应的能力。抑制分子的示例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如 CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、 LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、Gal9、腺苷和TGFRβ。抑制分子的抑制，例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制，可以优化表达CAR 的细胞性能。在实施方案中，可以使用抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，或锌指核酸内切酶(ZFN)，例如如本文所述的。

抑制内源性TCR或HLA的siRNA和shRNA

在一些实施方案中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或 shRNA和/或本文所述的抑制分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、 CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、 TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、 HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、Gal9、腺苷和 TGFRβ)来抑制T细胞中的TCR表达和/或HLA表达。

可以使用任何常规表达系统(例如慢病毒表达系统)实现siRNA和shRNA在 T细胞中的表达。例如，在美国公开号：2012/0321667中描述了下调TCR组分表达的示例性shRNA。例如，在美国公开号：US 2007/0036773中描述了下调HLA I类和/或HLA II类基因表达的示例性siRNA和shRNA。

抑制TCR或HLA的CRISPR

如本文所使用的“CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组成簇的规律间隔的短回文重复序列，或包含这种一组重复序列的系统。如本文所使用的，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指来源于CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默或突变TCR和/或HLA基因，和/或本文所述的抑制分子(例如， PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或 CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、 B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I 类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ)。

在大约40％的已测序真细菌基因组和90％的已测序古细菌中发现了天然存在的CRISPR/Cas系统。Grissa et al.(2007)BMC Bioinformatics 8:172。该系统是一种原核免疫系统，它赋予对外来遗传元件(例如质粒和噬菌体)的抗性，并提供一种获得性免疫。Barrangou et al.(2007)Science 315:1709-1712；Marragini et al.(2008)Science322: 1843-1845。

T细胞的活化和扩增

通常可以使用如例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964； 5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；

7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号 20060121005中描述的方法来活化和扩增T细胞。

通常，本发明的T细胞可以通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体而言，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗 CD2抗体接触，或通过结合钙离子载体与蛋白激酶C激活剂(例如苔藓虫素)接触。对于 T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，在适合刺激T细胞增殖的条件下，可以将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的示例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，可以与本领域中公知的其它方法一样使用(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen et al.,J.Exp. Med.190(9):13191328,1999；Garland etal.,J.Immunol Meth.227(l-2):53-63,1999)。

在一些实施方案中，可以使用烧瓶或容器或本领域技术人员已知的透气容器进行扩增，并且可以进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天，或14天、约7 天至约14天、约8天至约14天、约9天至约14天、约10天至约14天、约11天至约14天、约12天至约14天或约13天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可以进行约14天。

在某些实施方案中，可以在白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)的存在下使用非特异性T-细胞受体刺激进行扩增。非特异性T-细胞受体刺激可以包括例如抗 CD3抗体，例如约30ng/ml的OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil, Raritan,N.J.或Miltenyi Biotech,Auburn,Calif.商购获得)或UHCT-1(可从BioLegend,San Diego,Calif.,USA商购获得)。可以通过包含一种或更多种抗原(包括其抗原部分，例如癌症的表位)在体外扩增CoStAR细胞，所述抗原可以可选地从载体表达，例如人类白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如，0.3.mu.M MART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217 (210M)，可选地在T-细胞生长因子的存在下，例如300IU/mL IL-2或IL-15。其它合适的抗原可以包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2 和VEGFR2，或其抗原性部分。也可以通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌抗原再次刺激来快速扩增CoStAR细胞。或者，可以用例如经辐射的自体淋巴细胞或经辐射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步刺激CoStAR细胞。在一些实施方案中，刺激作为扩增的一部分发生。在一些实施方案中，在存在经辐射的自体淋巴细胞或具有经辐射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的情况下发生扩增。

在某些实施方案中，细胞培养基包括IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包括约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约 6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL，或1000 和2000IU/mL之间、2000和3000IU/mL之间、3000和4000IU/mL之间、4000和5000 IU/mL之间、5000和6000IU/mL之间、6000和7000IU/mL之间、7000和8000IU/mL 之间或8000IU/mL之间的IL-2。

在某些实施方案中，细胞培养基包括OKT3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包括约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5 ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35 ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90 ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL、约1μg/mL，或0.1ng/mL和1 ng/mL之间、1ng/mL和5ng/mL之间、5ng/mL和10ng/mL之间、10ng/mL和20ng/mL 之间、20ng/mL和30ng/mL之间、30ng/mL和40ng/mL之间、40ng/mL和50ng/mL之间或50ng/mL和100ng/mL之间的OKT3抗体。

在某些实施方案中，在扩增期间IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合用作组合。在一些实施方案中，在扩增期间可以包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21及其任何组合。在一些实施方案中，在扩增期间IL-2、IL-15和IL-21的组合用作组合。在一些实施方案中，可以包括IL-2、IL-15和IL-21及其任何组合。

在某些实施方案中，可以在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞的补充细胞培养基中进行扩增。

在某些实施方案中，扩增培养基包括约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL 的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160 IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15、或约100IU/mL的IL- 15、或约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15、或约400IU/mL的IL-15至约100 IU/mL的IL-15、或约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15、或约200IU/mL的 IL-15、或约180IU/mL的IL-15。

在一些实施方案中，扩增培养基包括约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的 IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的 IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21、或约0.5IU/mL 的IL-21、或约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21、或约15IU/mL的IL-21至约 0.5IU/mL的IL-21、或约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21、或约10IU/mL的 IL-21至约0.5IU/mL的IL-21、或约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21、或约2 IU/mL的IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包括约1IU/mL的IL-21或约0.5IU/mL 的IL-21。

在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)是PBMC。在实施方案中，扩增中CoStAR细胞与PBMC和/或抗原呈递细胞的比例为约1比25、约1比50、约1 比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400、或约1比 500、或1比50和1比300之间、或1比100和1比200之间。

在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案 (protocol)提供。例如，提供每种信号的试剂可以在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，试剂可以偶联至相同表面(即以“顺式”形式)或偶联至单独的表面(即以“反式”形式)。或者，一种试剂可以偶联至表面，而另一种试剂在溶液中。一方面，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，提供初级活化信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些方面，两种试剂都可以在溶液中。一方面，试剂可以是可溶形式，然后交联至表面，例如表达Fc受体的细胞或将与试剂结合的抗体或其它粘合剂。在这点上，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810中的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于在本发明中激活和扩增T细胞。

一方面，两种试剂固定在珠粒上，或者固定在相同珠粒上，即“顺式”，或者固定在单独的珠粒上，即“反式”。举例来说，提供初级活化信号的试剂是抗CD3 抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子量共同固定在相同珠粒上。一方面，使用1:1比例的与珠粒结合的每种抗体用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与珠粒结合的抗CD3:CD28抗体的比例，使得与使用1:1比例观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定方面，与使用1:1比例观察到的扩增相比，观察到约1倍至约3倍的增加。一方面，与珠粒结合的CD3:CD28抗体的比例范围为100:1至1:100以及介于两者之间的所有整数值。在本发明的一个方面，与颗粒结合的抗CD28抗体多于抗 CD3抗体，即CD3:CD28的比例小于1。在本发明的某些方面，结合珠粒的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个特定方面，使用1:100的CD3:CD28比例的与珠粒结合的抗体。一方面，使用1:75的CD3:CD28比例的与珠粒结合的抗体。在进一步的方面，使用1:50的CD3:CD28比例的与珠粒结合的抗体。一方面，使用1:30的 CD3:CD28比例的与珠粒结合的抗体。在一个优选的方面，使用1:10的CD3:CD28比例的与珠粒结合的抗体。一方面，使用1:3的CD3:CD28比例的与珠粒结合的抗体。在又一方面，使用3:1的CD3:CD28比例的与珠粒结合的抗体。

粒子与细胞的比例从1:500到500:1以及介于两者之间的任何整数值都可用于刺激T细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员可以容易地理解，粒子与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的粒子大小。例如，小尺寸的珠粒只能结合少数细胞，而较大的珠粒可以结合许多细胞。在某些方面，细胞与粒子的比例范围从1:100到100:1以及介于两者之间的任何整数值，并且在进一步的方面，比例包括1:9至9:1以及介于两者之间的任何整数值，也可以用于刺激T细胞。如上所述，导致T细胞刺激的抗CD3和抗 CD28偶联颗粒与T细胞的比例可以变化，但是某些优选值包括1:100、1:50、1:40、 1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、 6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一种优选比例是每个T细胞至少1:1粒子。一方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比例。在一个特定方面，优选的粒子与细胞比例为 1:5。在进一步的方面，粒子与细胞的比例可以根据刺激的天数而变化。例如，一方面，第一天粒子与细胞的比例从1:1到10:1，并且之后每天或每隔一天将另外的粒子添加到细胞中长达10天，最终比例从1:1到1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定方面，粒子与细胞的比例在刺激的第一天为1:1，并在刺激的第三天和第五天调整为 1:5。一方面，以每天或每隔一天的基础添加粒子，使得在第一天的最终比例为1:1，并在刺激的第三天和第五天的最终比例为1:5。一方面，粒子与细胞的比例在刺激的第一天为2:1，并在刺激的第三天和第五天调整为1:10。一方面，以每天或每隔一天的基础添加粒子，使得在第一天的最终比例为1:1，并在刺激的第三天和第五天的最终比例为 1:10。本领域技术人员将理解，多种其它比例可以适用于本发明。具体来说，比例将根据粒子大小和细胞大小和类型而变化。一方面，在第一天最典型的使用比例大约为 1:1、2:1和3:1。

在本发明的进一步的方面，将细胞(例如T细胞)与涂覆试剂的珠粒组合，随后将珠粒和细胞分离，然后培养细胞。在可选的方面，在培养之前，不将涂覆试剂的珠粒和细胞分离，而是一起培养。在进一步的方面，首先通过施加力(例如磁力)来浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。

CoStAR细胞的制备

基于病毒和非病毒的基因工程工具可用于产生CoStAR T细胞，引起治疗基因的永久或瞬时表达。基于逆转录病毒的基因传递是成熟的、特征明确的技术，已被用于将CAR永久整合到宿主细胞基因组中(Scholler J.,e.g.Decade-long safety and function ofretroviral-modified chimeric antigen receptor T cells.Sci.Transl.Med.2012；4:132ra53； Rosenberg S.A.et al.,Gene transfer into humans—immunotherapy ofpatients with advanced melanoma,using tumor-infiltrating lymphocytes modifiedby retroviral gene transduction.N. Engl.J.Med.1990；323:570–578).

也可以使用非病毒DNA转染方法。例如，Singh等人描述了使用开发的睡美人(SB)转座子系统来工程化CAR T细胞(Singh H.,et al.,Redirecting specificity of T-cellpopulations for CD19 using the Sleeping Beauty system.Cancer Res.2008；68:2961–2971)并且正在临床试验中使用(参见例如，ClinicalTrials.gov：NCT00968760和NCT01653717)。相同的技术适用于工程化CoStAR细胞。

多种SB酶已被用于传递转基因。Mátés描述了极度活跃的转座酶 (SB100X)，与第一代转座酶相比，其效率提高了大约100倍。SB100X在造血干细胞或祖细胞中富集的人类CD34(+)细胞中支持35-50％的稳定基因转移(Mátés L.et al., Molecular evolution ofa novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable genetransfer in vertebrates.Nat.Genet.2009；41:753–761)并且可以从多顺反子单质粒递送多个转基因(例如，Thokala R.et al.,Redirecting specificity of T cells usingthe Sleeping Beauty system to express chimeric antigen receptors by mix-and-matching of VL and VH domains targeting CD123+tumors.PLoS ONE.2016；11:e0159477)或多个质粒(例如， Hurton L.V.et al.,Tethered IL-15augments antitumoractivity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2016；113:E7788–E7797)。这种系统与本发明的CoStAR一起使用。

Morita等人描述了piggyBac转座子系统以整合更大的转基因(Morita D.et al.,Enhanced expression of anti-CD19 chimeric antigen receptor in piggyBactransposon- engineered T cells.Mol.Ther.Methods Clin.Dev.2017；8:131–140)。Nakazawa等人描述了使用该系统产生表达HER2特异性嵌合抗原受体的EBV特异性细胞毒性T-细胞 (Nakazawa Y et al,PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T- cells expressing HER2-specific chimeric antigenreceptor.Mol.Ther.2011；19:2133–2143)。 Manuri等人使用该系统产生CD-19特异性T细胞(Manuri P.V.R.et al.,piggyBac transposon/transposase system to generateCD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.Hum.GeneTher.2010；21:427–437)。

转座子技术既简单又经济。一个潜在的缺点是目前使用的较长的扩增方案可能导致T细胞分化、活性受损和输注细胞的持久性较差。Monjezi等人描述了开发微环载体，其通过更高效的整合将这些困难降至最低(Monjezi R.et al.,Enhanced CAR T-cellengineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicirclevectors.Leukemia. 2017；31:186–194)。这些转座子技术可用于本发明的CoStAR。

药物组合物

本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的载体或表达CoStAR的细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，以及可选的一种或更多种进一步的药学活性多肽和/或化合物。

在一些实施方案中，提供了包含上述CoStAR和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，提供了包含编码根据上述任一实施方案的CoStAR的核酸和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，提供了包含表达上述 CoStAR的效应细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。这样的制剂可以，例如是适合于静脉输注的形式。

如本文所使用的，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指并非生物学上或其它方面不需要的材料，例如，材料可以并入施用给患者的药物组合物中，而不会引起任何显著的不需要的生物效应或以有害方式与含有所述材料的组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选符合毒理学和生产测试的要求标准和/或包含在美国食品和药物管理局编制的非活性成分指南中。

本发明的一方面提供了表达重组CoStAR的修饰T细胞群。合适的群体可以通过上述方法产生。

修饰的T细胞群可用作药物。例如，如本文所述的修饰的T细胞群可用于癌症免疫治疗，例如过继T细胞治疗。

本发明的其它方面提供了如本文所述的修饰的T细胞群在制备用于治疗癌症的药物中的用途、如本文所述的修饰的T细胞群用于治疗癌症的用途，并且治疗癌症的方法可以包括向需要的个体施用如本文所述的修饰的T细胞群。

修饰的T细胞群可以是自体的，即修饰的T细胞最初是从与随后施用的个体相同的个体中获得的(即供体和受体个体相同)。可以通过以下方法产生用于施用于个体的合适的修饰的T细胞群，所述方法包括提供从个体获得的初始T细胞群、修饰T细胞以表达cAMP PDE或其片段和与个体中的癌细胞特异性结合的抗原受体并培养修饰的 T细胞。

修饰的T细胞群可以是同种异体的，即修饰的T细胞最初是从与随后施用的个体不同的个体中获得的(即供体和受体个体不同)。供体和受体个体可能是HLA匹配的，以避免GVHD和其它不良免疫效应。可以通过以下方法产生用于施用于受体个体的合适的修饰的T细胞群，所述方法包括提供从供体个体获得的初始T细胞群、修饰T细胞以表达与受体个体中的癌细胞特异性结合的CoStAR并培养修饰的T细胞。

在施用修饰的T细胞后，受体个体可能表现出针对受体个体中的癌细胞的T 细胞介导的免疫反应。这可能对个体的癌症疾病产生有益作用。

癌症疾病的特征可能在于恶性癌细胞的异常增殖，并且癌症疾病可能包括白血病，例如AML、CML、ALL和CLL，淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤，以及实体癌，例如肉瘤、皮肤癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈部肿瘤、食道癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊癌和胆管癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌，以及不明原发肿瘤(CUP)。

个体内的癌细胞在免疫学上可能与个体中的正常体细胞不同(即癌性肿瘤可能具有免疫原性)。例如，癌细胞可能能够引发个体中针对由癌细胞表达的一种或更多种抗原的全身性免疫反应。引发免疫反应的肿瘤抗原可能对癌细胞具有特异性，或者可能为个体中的一种或更多种正常细胞所共有。

适合如上所述治疗的个体可以是哺乳动物，例如啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长类动物、猿猴(例如猴或猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。

在优选的实施方案中，个体是人类。在其它优选的实施方案中，可以使用非人类哺乳动物，尤其是通常用作证明人类中治疗功效的模型的哺乳动物(例如鼠科动物、灵长类动物、猪科动物、犬科动物或兔科动物)。

治疗方法

术语“治疗有效量”是指本文公开的CoStAR或包含CoStAR的组合物有效“治疗”个体中的疾病或病症的量。在癌症的情况下，本文公开的治疗有效量的 CoStAR或包含CoStAR的组合物可以减少癌细胞的数量；减少肿瘤大小或重量；抑制 (即在一定程度上减缓并优选停止)癌细胞浸润到外周器官；抑制(即在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或更多种症状。就本文公开的CoStAR或包含CoStAR的组合物可以防止生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一些实施方案中，治疗有效量是生长抑制量。在一些实施方案中，治疗有效量是改善患者无进展存活的量。在传染病(例如病毒感染)的情况下，本文公开的治疗有效量的CoStAR或包含CoStAR的组合物可以减少被病原体感染的细胞数量；减少病原体衍生抗原的产生或释放；抑制(即在一定程度上减缓并优选停止)病原体向未感染细胞的传播；和/或在一定程度上缓解与感染相关的一种或更多种症状。在一些实施方案中，治疗有效量是延长患者存活的量。

在本发明的方法中使用的表达CoStAR的细胞(包括T细胞和NK细胞)可以从患者自身的外周血(自体)或在来自供体外周血(同种异体)的造血干细胞移植的环境中或从未连接的供体(同种异体)的外周血体外产生。或者，T-细胞或NK细胞可能来源于可诱导祖细胞或胚胎祖细胞向T-细胞或NK细胞的离体分化。在这些情况下，表达CoStAR和可选的CAR和/或TCR的T-细胞是通过引入编码CoStAR和可选的CAR和/或 TCR的DNA或RNA，通过包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染在内的多种手段之一产生的。

表达本发明的CoStAR和可选地表达TCR和/或CAR的T细胞或NK细胞可用于治疗血液肿瘤或实体瘤。

用于治疗疾病的方法涉及本发明的载体或细胞(包括T细胞或NK细胞)的治疗用途。在这方面，可以将载体或T细胞或NK细胞施用于患有现有疾病或病症的受试者，以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。本发明的方法可以引起或促进T-细胞介导的癌细胞杀伤。根据本发明的载体或T细胞或NK细胞可以与一种或更多种另外的治疗剂一起施用于患者。一种或更多种另外的治疗剂可以共同施用于患者。“共同施用”是指在时间上足够接近施用一种或更多种另外的治疗剂和本发明的载体或T细胞或NK细胞，使得载体或T细胞或NK细胞可以增强一种或更多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在这点上，可以首先施用载体或细胞，然后施用一种或更多种另外的治疗剂，或反之亦然。或者，载体或细胞和一种或更多种另外的治疗剂可以同时施用。一种可能有用的共同施用的治疗剂是IL-2，因为它目前用于现有的细胞治疗中以提高施用的细胞的活性。但是，IL-2治疗与毒性和耐受性问题有关。

如上所述，对于施用于患者，CoStAR效应细胞可以是患者同种异体的或自体的。在某些实施方案中，同种异体的细胞被进一步遗传修饰，例如通过基因编辑，以最小化或防止GVHD和/或患者针对CoStAR细胞的免疫反应。

CoStAR效应细胞用于治疗与靶抗原相关的癌症和肿瘤疾病。可以使用本文所述的任何方法治疗的癌症和肿瘤疾病包括未血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。用本发明的CoStAR效应细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤和恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也包括在内。

血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌症的示例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。

实体瘤是异常的组织块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤的示例(例如肉瘤和癌)包括肾上腺皮质癌、胆管癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胃癌、淋巴肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌和乳头状甲状腺癌)、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌(例如，宫颈癌和浸润前宫颈发育不良)、结肠直肠癌、肛门、肛管或肛门直肠的癌症、阴道癌、外阴的癌症(例如，鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌和纤维肉瘤)、阴茎癌、口咽癌、食道癌、头部癌症 (例如鳞状细胞癌)、颈部癌症(例如鳞状细胞癌)、睾丸癌(例如，精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤和脂肪瘤)、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、子宫癌(例如子宫内膜癌)、尿路上皮癌(例如，鳞状细胞癌、移行性细胞癌、腺癌、输尿管癌和膀胱癌)和中枢神经系统肿瘤(例如，胶质瘤 (例如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannoma)、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤(meningioma)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

当显示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明的组合物的准确施用量可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的个体差异来确定。一般可以规定，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量施用，在一些情况下为10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。可以通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，例如 Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988).

联合治疗

本文所述的表达CoStAR的细胞可以与其它已知的药剂和治疗联合使用。如本文所使用的，“联合”施用是指在受试者患有疾病的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同治疗，例如，在受试者被诊断患有疾病之后或者在疾病治愈或消除或治疗因其它原因停止之前递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当第二种治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍在发生，从而在施用方面存在重叠。这有时在本文中被称为“同时”或“并发递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，与在没有第一种治疗的情况下实施第二种治疗相比，第二种治疗较少时观察到等效效果，或者第二种治疗在更大程度上减轻了症状，或者第一种治疗观察到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得与疾病相关的症状或其它参数的减少大于在没有另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的。递送可以使得递送的第一种治疗的效果在递送第二种治疗时仍然是可检测的。

本文所述的表达CoStAR的细胞和至少一种另外的治疗剂可以同时在相同或分开的组合物中施用或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的表达CAR 的细胞，然后可以施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。

CoStAR治疗和/或其它治疗剂、程序或方式可以在活动性疾病期间、或在缓解期或活动度较低的疾病期间施用。CoStAR治疗可以在其它治疗之前、与治疗同时、治疗后或疾病缓解期间进行。

当联合施用时，治疗和另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部可以以高于、低于或相同于单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量的量或剂量施用。在某些实施方案中，CoStAR治疗、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的施用的量或剂量低于(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)单独使用 (例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量。在其它实施方案中，导致期望效果(例如，癌症治疗)的CoStAR治疗、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量低于(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)达到相同的治疗效果所需的单独使用(例如作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量。

在进一步的方面，本文所述的表达CoStAR的细胞可以在治疗方案中与手术、化疗、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和 FK506)、抗体或其它免疫消融剂(immunoablative agent)(例如CAMPATH)、抗CD3抗体或其它抗体治疗、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和放射、肽疫苗联合使用，例如Izumoto等人2008J Neurosurg 108:963-971中描述的那些。

在某些情况下，本发明的化合物与其它治疗剂联合，例如其它抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐剂)、镇痛剂、细胞保护剂及其组合。

在一个实施方案中，本文所述的表达CoStAR的细胞可以与化学治疗剂联合使用。示例性的化学治疗剂包括蒽环类药物(例如，阿霉素(例如，脂质体阿霉素))、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺(temozolomide))、免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab))、抗代谢物(包括例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A (aclacinomycin A)、胶霉毒素(gliotoxin)或硼替佐米(bortezomib))、免疫调节剂例如沙利度胺(thalidomide)或沙利度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))。

考虑用于联合治疗的一般化疗剂包括白消安白消安注射液克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体阿糖胞苷注射剂盐酸柔红霉素枸橼酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨羟基脲伊达比星米托蒽醌吉妥珠单抗奥佐米星

在实施方案中，考虑用于联合治疗的一般化疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-pentoxycarbonyl-5-deoxy-5- fluorocytidine、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体阿糖胞苷注射剂达卡巴嗪放线菌素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素枸橼酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康左旋天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌吉妥单抗(mylotarg)、紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、以聚苯丙生20为载体的卡莫司汀植入膜剂柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、噻替哌、替拉扎明注射用盐酸拓扑替康长春碱长春新碱和长春瑞滨

例如，可以通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、进展时间、存活持续时间、无进展存活、总体反应率、反应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评价治疗。可以采用确定治疗功效的方法，包括例如通过放射成像测量反应。

本发明在以下非限制性条款中进一步描述：

1.一种嵌合共刺激受体(CoStAR)，包括与肿瘤相关抗原特异性结合结构域融合的全长共刺激受体，其中全长暗含着整个成熟蛋白缺少前导序列，并且在成熟蛋白质的N端有多达5个氨基酸缺失或突变，这是将共刺激结构域最佳剪接成嵌合受体的关键过程。

2.根据条款1的CoStAR，其中所述共刺激受体选自CD2、CD9、CD26、CD27、 CD28、CD29、CD38、CD40、CD43、CD46、CD49d、CD55、CD73、CD81、CD82、 CD99、CD100、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD150(SLAM)、CD270(HVEM)、 CD278(ICOS)、CD357(GITR)或EphB6的组。

3.条款1和2中概述的CoStAR融合受体，其中共刺激结构域由融合成单个受体形式的两个或更多个共刺激受体结构域组成，其中连接区域是直接融合，或包含接头区域，例如多达50个氨基酸长度的接头。

4.根据任何前述条款的CoStAR，其中所述抗原特异性结合结构域来源于：

I.结合肿瘤相关抗原的单链抗体片段，包括但不限于癌胚抗原(CEA)、5T4、黑色素转铁蛋白(CD228)、黑色素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP/CSPG4)、CD71、叶酸受体或CA125；或者

II.结合肿瘤特异性肽(p)-主要组织相容性(MHC)复合体的单链抗体片段；或者

III.肿瘤特异性pMHC复合体抗原特异性单链T-细胞受体(scTCR)；或者

IV.天然抗原结合多肽，例如但不限于转铁蛋白；或者

V.结合抗体的结构域(例如Fc结合结构域，例如但不限于CD16、CD32或CD64)，或其它间接的抗原识别方法。

5.一种融合蛋白，其包括根据任何前述条款的多肽，所述多肽与目标蛋白(POI)融合，例如标记基因(例如DYKDDDDK(SEQ ID NO:14)表位标签、CD34、CD19等)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或用于过继细胞治疗的免疫治疗的另一种受体。

6.根据条款5的融合蛋白，其包括多肽和目标蛋白之间的自切割肽。

7.一种核酸序列，例如：

I.SEQ ID NO:1所示的核酸序列，能够编码根据条款1和2的多肽，例如SEQ ID NO:2所示的多肽，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；或者

II.融合蛋白，例如SEQ ID NO:2所示的融合蛋白，其融合至根据条款5的肽，例如SEQ ID NO:3至12所示的肽，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

8.一种包括根据条款7的核酸序列的载体。

9.根据条款8的载体，其还包括目标转基因。

10.根据条款9的载体，其中目标转基因编码嵌合抗原受体、T-细胞受体或用于过继细胞治疗的免疫治疗的另一种受体，使得当载体用于转导靶细胞时，靶细胞共表达根据条款1中任一项的多肽和嵌合抗原受体、T-细胞受体或另一种免疫治疗目标受体。

11.一种表达根据条款1的多肽的细胞。

12.根据条款11的细胞，其在细胞表面共表达条款1中概述的多肽和POI。

13.一种包括根据条款7的核酸序列的细胞。

14.根据条款11-13中任一项的细胞，其是T细胞。

15.一种制备根据条款11-14任一项的细胞的方法，其包括用根据条款8至10任一项的载体转导或转染细胞的步骤。

16.一种选择表达POI的细胞的方法，其包括以下步骤：

I.检测用根据条款10的载体转染或转导的细胞表面上的POI表位的表达；和

II.选择被鉴定为表达POI表位的细胞。

17.一种制备富含表达POI的细胞的纯化细胞群的方法，其包括使用根据条款16的方法从细胞群中选择表达POI的细胞的步骤。

18.根据条款17的方法，其包括从组织或细胞供体中分离的细胞群的离体转导或转染，其通过：

I.根据条款7中任一项所述的载体；和

II.通过根据条款16的方法从转导/转染的细胞群中选择表达POI的细胞。

19.一种细胞群，其富含表达根据条款1的多肽的细胞，并因此富含表达POI的细胞。

20.一种追踪体内经转导的细胞的方法，其包括检测根据条款1的多肽在细胞表面表达的步骤。

21.一种治疗受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用根据条款11至14中任一项的细胞或根据条款19的细胞群的步骤。

22.根据条款21的方法，其包括以下步骤：

I.用根据条款9的载体转导或转染从受试者分离的细胞样品，和

II.将经转导/转染的细胞返回患者。

23.根据条款22的方法，所述方法用于治疗癌症。

24.根据条款11至14中任一项的细胞或根据条款19的细胞群在过继细胞转移中的用途。

25.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人CD137的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:4所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

26.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人CD134的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:5所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

27.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人CD2的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:6所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

28.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人CD29的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:7所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

29.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人GITR的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:8所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

30.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人IL2Rγ的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:9所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

31.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人CD40的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:10所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

32.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人CD150的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:11所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

33.由根据条款4的肿瘤相关抗原结合结构域组成的CoStAR受体，所述CoStAR受体融合至：

I.由全长人CD28组成的融合信号传导结构域，例如SEQ ID NO:2所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体；和

II.来自人CD2和人CD40的细胞内结构域，例如SEQ ID NO:12所示的结构域，或其在蛋白质水平上具有至少80％序列同一性的变体。

实施例在以下非限制性实例中进一步说明本发明。

实施例1-表达CoStAR的T-细胞的产生

材料和方法

构建体设计-MFE23 CoStAR由MFE23衍生的单链抗体片段核苷酸序列组成，其中抑瘤素M1(oncostatin M1)前导序列与整个人CD28核酸序列融合。CoStAR核苷酸序列由Genewiz Inc.进行密码子优化和基因合成。通过XbaI和NheI位点将构建体克隆到pSF.Lenti(Oxford Genetics)中。

慢病毒生产-使用三质粒包装系统(Cell Biolabs,San Diego,USA)进行慢病毒生产，方法是将10μg的每种质粒和10μg含有转基因的pSF.Lenti慢病毒质粒混合在含有50mMCaCl₂的无血清RPMI中。将混合物逐滴加到75cm²烧瓶中的50％汇合单层的293T细胞中。根据制造商的说明，在转染后48和72小时收集病毒上清液，使用 LentiPac慢病毒上清液浓缩(GeneCopoeia,Rockville,Maryland,USA)溶液进行合并和浓缩。将慢病毒上清液浓缩10倍，并在4μg/ml聚凝胺((Sigma-Aldrich,Dorset,UK)存在下用于直接感染原代人类T-细胞。在加入慢病毒上清液之前，根据制造商的说明，在使用T-细胞活化和扩增珠粒(Invitrogen)活化24小时之前，从正常健康供体中分离外周血单核细胞。

感染后96小时，使用CEA.hFc蛋白和抗hFc-PE二级抗体加上抗CD34-APC 抗体或单独使用抗CD34-PE抗体评估细胞转导。然后使用x10供体错配的经辐照的 PBMC饲养层在RPMI+10％FCS中以1:20-1:200的比例进一步扩增，并添加1μg/ml PHA和200IU/ml IL-2。14天后，细胞如先前一样染色并储存以备测定。

通过将CoStAR阳性或阴性细胞与野生型或OKT3工程化的CEA阳性LoVo 或LS174T细胞混合进行功能测定。简而言之，在96孔板中将T-细胞与LoVo细胞以不同的比例混合，并通过ELISA测量IFNγ或IL-2。剩余的细胞与WST-1试剂(Sigma,UK) 的1:10稀释液一起温育30分钟，然后在450nm处读取吸光度。使用以下等式＝100-((实验读数-单独的T-细胞)/(单独的肿瘤))×100来确定％细胞毒性。

增殖试验通过在37℃下以1×10⁷个细胞/ml的浓度用10μM eFluor450增殖染料(eBioscience,UK)第一次加载T-细胞10分钟，然后在5体积的冷的T-细胞培养基中在冰上温育细胞5分钟。然后过度洗涤细胞以去除未结合的染料并加入含有肿瘤细胞的共培养物中。在第2、6和10天取出细胞，加入1:200稀释的DRAQ7，并使用 MACSQuant血细胞计数器和MACSQuantify软件分析细胞。

通过从孔中取出细胞并用抗CD2 PerCP eFluor710抗体(eBioscience,UK)在黑暗中染色20分钟，然后通过DRAQ7染色并使用MACSQuant分析仪计数，来进行增殖测定的细胞计数。

结果-从NHSBT获得的血沉棕黄层(Buffy coat)中分离出原代人类T-细胞。通过Ficoll介导的分离和T-细胞阴性分离试剂盒(StemCell Technologies)分离T-细胞。分离的T-细胞用人T-细胞活化和扩增珠粒(Invitrogen,UK)进行活化。细胞与浓缩的慢病毒颗粒一起温育并扩增数天。慢病毒含有MFE.CoStAR.2A.tCD34构建体(MFE23.scFv与全长人CD28融合，通过2A切割序列与截短的人CD34共表达)的DNA序列。如材料和方法中所述，使用经辐照的饲养层进一步扩增成功转导的细胞。供体1转导测量为22.69％ (17.15％CD34+/CoStAR+加上5.53％CD34-/CoStAR+)，供体2测量为20.73％，供体3为 13.34％。使用抗CD34抗体富集细胞的CoStAR表达，以获得大于90％CoStAR阳性的 T-细胞群。

为了产生生理相关的体外模型来测试CoStAR对T-细胞活性的影响，对未转导和转导的细胞进行了针对CEA+肿瘤细胞系LoVo和LS174T的测试。为了激活T-细胞对错配肿瘤系的反应，我们工程化了肿瘤细胞使其表达抗CD3单链抗体片段，所述抗体片段通过合成跨膜结构域锚定在细胞膜上，并使用IRES元件从GFP标记基因中分离，使用流式细胞术来可视化转导的细胞。

LoVo和LS174T的单细胞克隆是从大量转染子中产生的。未转导和CoStAR 转导的T-细胞以不同的效应物：靶标比值与野生型未转导或OKT3工程化的LS174T或 LoVo细胞混合。24小时后，取出共培养基进行IL-2ELISA测量。在三个供体的 CoStAR+和CoStAR-T-细胞群中观察到激活依赖性IL-2分泌，以响应OKT3工程化的 LS174T细胞，在转导和未转导的T-细胞中只观察到响应于未工程化的肿瘤细胞的背景 IL-2分泌(图3A-C)。在所有测试的三个供体中都发现CoStAR增强了对OKT3工程化的肿瘤细胞的IL-2分泌。当E:T比值为8:1和16:1时，效果最为明显，并且在较高的E:T 比值下，IL-2分泌太低而无法准确测量。在较低的效应物与靶标比值下，未转导细胞的 IL-2分泌似乎已饱和。这些观察在LoVo细胞中重复进行，三个供体中的两个针对 LS174T进行了测试，结果相似(图3D&E)。

为了确定CoStAR对T-细胞扩增的影响，将转导或未转导的T-细胞与野生型或OKT3-GFP工程化的LoVo细胞混合，计算3天后的总细胞数。CoStAR增强了工程化的T-细胞响应于LoVo-OKT3的存活和/或增殖，而不是在存在IL-2(图4A)和不存在IL- 2(图4B)下的野生型LoVo细胞。为了进一步研究这种现象，使用增殖染料对来自两个供体的T-细胞进行细胞增殖分析，以计算每个群体在6天内经历的细胞周期数(图 4C&D)。与非工程化的细胞相比，更大比例的CoStAR工程化的细胞响应于LoVo-OKT3 在6天内经历了5、6或7个增殖周期，而CoStAR转导和未转导的细胞响应于野生型 LoVo在相同的持续时间内经历了平均大约2个周期。

产生了多种融合受体，由融合到N端另外的共刺激结构域的CD28组成。选择从：CD137、CD2、CD29、CD134、CD150、CD40、GITR获得的共刺激结构域和来自IL-2受体γ链(IL2Rγ)的信号传导结构域。包括与先前可诱导的共刺激研究中使用的受体接近的受体。这种命名为CD28(IEV)的受体被截短，使得CD28的C端基序是氨基酸三联体‘IEV’。序列由Genewiz从头生成，并在EF1α启动子下克隆到慢病毒载体中，同时通过2A自切割肽从融合CoStAR分离出CD34标记基因。使用EasySep珠粒(StemCell Technologies)分离原代CD8+T-细胞，并在添加慢病毒颗粒之前用抗CD3/抗 CD28激活/扩增Dynabeads进行激活。在短暂的扩增期后，将细胞与LoVo或LoVo-OKT3 细胞混合，包括抗CD107a抗体和布雷菲德菌素(brefeldin)和莫能菌素(monensin)，并在 16小时温育后固定并用标记基因(CD34)的抗体以及IL-2、IFNγ和bcl-xL的抗体染色。使用MACSQuant分析仪和MACSQuantify软件进行分析。图5显示了来自CD34- (CoStAR未转导)和CD34+(CoStAR转导)的IL-2反应。统计分析表明，当携带变体 CoStAR受体时，所有测试的受体都诱导产生IL-2的细胞比例显著增加。同时测量了三个其它读数：IFNγ，在正常信号1条件下释放但通过共刺激增强的细胞因子；CD107a，脱粒标志物；和bcl-xL，通过共刺激上调的抗凋亡蛋白。CoStAR的参与在不同程度上增强了所有分析的效应物功能。CD28.CD2和CD28.CD40融合受体似乎引发了所有测试受体中最强烈的反应(见图6)。

实施例2

比较了基于CD28和CD28.CD40的CoStAR对基于群体的细胞因子分泌的影响。来自三个供体的原代T-细胞用CD28(IEV)截短的CoStAR、全长CD28 CoStAR 或CD28.CD40CoStAR(具有如SEQ ID NO:10所示的全长CD28，但缺少N末端N和K 残基)进行转导或未转导。使用CD34标记基因富集T-细胞的CoStAR表达，然后将扩增细胞与LoVo-OKT3细胞混合，并通过ELISA分析IL-2分泌(见图7)。未转导的细胞平均产生0.80ng/ml IL-2，CD28(IEV)和全长CD28 CoStAR分别产生4.6和5.0ng/ml IL- 2。而CD28.CD40在三个供体中平均诱导29.0ng/ml IL-2，因此证明将CD40引入基本的基于CD28的CoStAR有明显的好处。

接下来分析了CoStAR对T-细胞扩增的影响。来自七个供体的T-细胞用 CD28或CD28.CD40 CoStAR转导，其具有抗CA125(196-14)或抗叶酸受体(MOV-19) scFv或抗叶酸受体肽(C7)抗原结合结构域。用携带有抗CEA scFv的CD28 CoStAR作为错配对照来转导另外的细胞。然后将细胞与CA125+/叶酸受体+/CEA-细胞系OvCAR3混合，该细胞系被工程化以表达膜结合OKT3(OvCAR-OKT3)。在第7、14和21天后进行 T-细胞计数，并在第7天和第14天添加新鲜的OvCAR-OKT3。观察到携带有抗CA125 scFv的细胞的有限扩增(平均倍数扩增：CD28：15.1；CD28.CD40：69.1)，但是靶向叶酸受体和scFv的细胞确实在CD28和CD28.CD40队列中扩增(平均倍数扩展：CD28： 186.7；CD28.CD40：1295.0)。当C7肽用于靶向叶酸受体时，可以看到更有限的扩增 (平均倍数扩增：CD28：71.5；CD28.CD40：28.0)。对照CEA靶向受体表现出有限的扩增(平均倍数扩增：28.0)。

为了更好地理解信号1和信号2的协同作用，T-细胞被工程化为具有鼠恒定结构域修饰的TCR，其在HLA-A*02以及CD28或CD28.CD40 CoStAR靶向细胞表面 CEA蛋白的情况下识别CEA肽(691-699)。还用CA125特异性CD28 CoStAR转导细胞作为对照。将T细胞与HLA-A*02+/CEA+H508细胞混合，并通过细胞内流式细胞术染色分析细胞因子产生。使用针对鼠TCRβ恒定结构域(标记TCR工程化的细胞)以及DYKDDDDK(SEQ ID NO:14)表位标签(标记CoStAR工程化的细胞)的抗体进行流式细胞术门控。因此，能够分析每个共培养孔中的TCR-/CoStAR-、TCR+/CoStAR-、TCR- /CoStAR+和TCR+/CoStAR+细胞。然后在CD4+或CD8+T-细胞中的每个亚群中绘制细胞因子产生(图9)。在CD4+细胞中，CD28.CD40 CoStAR在单独的TCR刺激之上增强了CD137和TNFα产生，但是由于TCR对CD8的依赖性，CD4+细胞中的TCR反应很差。在CD8+细胞中，IL-2和CD107a具有更强的效应活性，特别是在CD28.CD40 CoStAR组中表现出更强的诱导作用。为了更好地比较受体，仅在TCR+/CoStAR+组中绘制了CD4+和CD8+细胞中的效应物活性(图10)。在CD4+细胞中，与CEA或错配的靶向CD28 CoStAR相比，CD28.CD40显著增强了CD137的诱导。在CD8+细胞中，与 CEA或错配的靶向CD28 CoStAR相比，CD137诱导显著增加，而与对照CoStAR相比， CD107a诱导增加。因此CD28.CD40在广泛的模型和效应物活性中显示出增强的效应物活性。

参考文献

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Bridgeman JS,Hawkins RE,Bagley S,Blaylock M,Holland M,Gilham DE.JImmunol.2010 Jun 15；184(12):6938-49.The optimal antigen response of chimericantigen receptors harboring the CD3zeta transmembrane domain is dependentupon incorporation of the receptor into the endogenous TCR/CD3 complex.

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Rapoport AP,Stadtmauer EA,Binder-Scholl GK,Goloubeva O,Vogl DT,LaceySF,Badros AZ,Garfall A,Weiss B,Finklestein J,Kulikovskaya I,Sinha SK,Kronsberg S,Gupta M,Bond S,Melchiori L,Brewer JE,Bennett AD,Gerry AB,PumphreyNJ,Williams D,Tayton-Martin HK,Ribeiro L,Holdich T,Yanovich S,Hardy N,YaredJ,Kerr N,Philip S,Westphal S,Siegel DL,Levine BL,Jakobsen BK,Kalos M,JuneCH.Nat Med.2015Aug；21(8):914-21.NY- ESO-1-specific TCR-engineered T cellsmediate sustained antigen-specific antitumour effects in myeloma.

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序列

SEQ ID NO:1：具有以粗体突出显示的开放阅读框的完整人CD28 mRNA转录本变体转录本。

LOCUS NM_006139 4900bp mRNA 线性PRI 07-OCT-2016

定义 智人CD28分子(CD28)，转录本变体1，mRNA.

登记号 NM_006139

起点

SEQ ID NO:2：人CD28蛋白序列，具有：

I.以粗体突出显示的信号肽(当根据本发明使用时，这可以从序列中删除)；和

II.加下划线的跨膜区；和

III.细胞外区域位于信号肽和跨膜区之间，细胞质区域在跨膜区之后；和

IV.加框区域代表成熟蛋白质的前5个氨基酸，其在本发明的任何方面中可以存在或不存在或突变。此外，当根据本发明使用时，这些残基中的1、2、3、4或5个 (即N、K、I、L或V)可以从序列中删除。

下面的SEQ ID NO:3至12是CoStAR信号传导结构域的示例性序列，其可以在SEQID NO:2的加框区域(该区域可能会或可能不会突变，但为了图解简单，已保留为其原始形式)与人CD28蛋白融合，具有：

I.双下划线区域代表CD28衍生区域；和

II.下划线区域是第二共刺激受体衍生区域；和

III.斜体序列是第三共刺激受体衍生区域。

注意，加框区域代表成熟CD28蛋白的前5个氨基酸，其在本发明的任何方面中可以存在或不存在或突变。此外，当根据本发明使用时，这些残基中的1、2、3、4或5个(即 N、K、I、L或V)可以从序列中删除。

SEQ ID NO:3：截短的细胞质结构域CD28变体

SEQ ID NO:4：CD28.CD137融合

SEQ ID NO:5：CD28.CD134融合

SEQ ID NO:6：CD28.CD2融合

SEQ ID NO:7：CD28.CD29融合

SEQ ID NO:8：CD28.GITR融合

SEQ ID NO:9：CD28.IL2Rγ融合

SEQ ID NO:10：CD28.CD40融合

SEQ ID NO:11：CD28.CD150融合

SEQ ID NO:12：CD28.CD2.CD40融合

SEQ ID NO:13：截短的细胞外结构域CD28(IEV)变体

序列表

<110> 英研生物(英国)有限公司

<120> 为过继细胞治疗提供靶向共刺激的受体

<130> P37029WO1

<150> US62/951,770

<151> 2019-12-20

<150> GB1900858.0

<151> 2019-01-22

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4900

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (223)..(885)

<223> 登记号NM_006139

<220>

<221> sig_肽

<222> (223)..(276)

<220>

<221> 跨膜结构域

<222> (456)..(537)

<400> 1

taaagtcatc aaaacaacgt tatatcctgt gtgaaatgct gcagtcagga tgccttgtgg 60

tttgagtgcc ttgatcatgt gccctaaggg gatggtggcg gtggtggtgg ccgtggatga 120

cggagactct caggccttgg caggtgcgtc tttcagttcc cctcacactt cgggttcctc 180

ggggaggagg ggctggaacc ctagcccatc gtcaggacaa ag atg ctc agg ctg 234

Met Leu Arg Leu

1

ctc ttg gct ctc aac tta ttc cct tca att caa gta aca gga aac aag 282

Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val Thr Gly Asn Lys

5 10 15 20

att ttg gtg aag cag tcg ccc atg ctt gta gcg tac gac aat gcg gtc 330

Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn Ala Val

25 30 35

aac ctt agc tgc aag tat tcc tac aat ctc ttc tca agg gag ttc cgg 378

Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Phe Arg

40 45 50

gca tcc ctt cac aaa gga ctg gat agt gct gtg gaa gtc tgt gtt gta 426

Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys Val Val

55 60 65

tat ggg aat tac tcc cag cag ctt cag gtt tac tca aaa acg ggg ttc 474

Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr Gly Phe

70 75 80

aac tgt gat ggg aaa ttg ggc aat gaa tca gtg aca ttc tac ctc cag 522

Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr Leu Gln

85 90 95 100

aat ttg tat gtt aac caa aca gat att tac ttc tgc aaa att gaa gtt 570

Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile Glu Val

105 110 115

atg tat cct cct cct tac cta gac aat gag aag agc aat gga acc att 618

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile

120 125 130

atc cat gtg aaa ggg aaa cac ctt tgt cca agt ccc cta ttt ccc gga 666

Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly

135 140 145

cct tct aag ccc ttt tgg gtg ctg gtg gtg gtt ggt gga gtc ctg gct 714

Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

150 155 160

tgc tat agc ttg cta gta aca gtg gcc ttt att att ttc tgg gtg agg 762

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

165 170 175 180

agt aag agg agc agg ctc ctg cac agt gac tac atg aac atg act ccc 810

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

185 190 195

cgc cgc ccc ggg ccc acc cgc aag cat tac cag ccc tat gcc cca cca 858

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

200 205 210

cgc gac ttc gca gcc tat cgc tcc tga cacggacgcc tatccagaag 905

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

215 220

ccagccggct ggcagccccc atctgctcaa tatcactgct ctggatagga aatgaccgcc 965

atctccagcc ggccacctca ggcccctgtt gggccaccaa tgccaatttt tctcgagtga 1025

ctagaccaaa tatcaagatc attttgagac tctgaaatga agtaaaagag atttcctgtg 1085

acaggccaag tcttacagtg ccatggccca cattccaact taccatgtac ttagtgactt 1145

gactgagaag ttagggtaga aaacaaaaag ggagtggatt ctgggagcct cttccctttc 1205

tcactcacct gcacatctca gtcaagcaaa gtgtggtatc cacagacatt ttagttgcag 1265

aagaaaggct aggaaatcat tccttttggt taaatgggtg tttaatcttt tggttagtgg 1325

gttaaacggg gtaagttaga gtagggggag ggataggaag acatatttaa aaaccattaa 1385

aacactgtct cccactcatg aaatgagcca cgtagttcct atttaatgct gttttccttt 1445

agtttagaaa tacatagaca ttgtctttta tgaattctga tcatatttag tcattttgac 1505

caaatgaggg atttggtcaa atgagggatt ccctcaaagc aatatcaggt aaaccaagtt 1565

gctttcctca ctccctgtca tgagacttca gtgttaatgt tcacaatata ctttcgaaag 1625

aataaaatag ttctcctaca tgaagaaaga atatgtcagg aaataaggtc actttatgtc 1685

aaaattattt gagtactatg ggacctggcg cagtggctca tgcttgtaat cccagcactt 1745

tgggaggccg aggtgggcag atcacttgag atcaggacca gcctggtcaa gatggtgaaa 1805

ctccgtctgt actaaaaata caaaatttag cttggcctgg tggcaggcac ctgtaatccc 1865

agctgcccaa gaggctgagg catgagaatc gcttgaacct ggcaggcgga ggttgcagtg 1925

agccgagata gtgccacagc tctccagcct gggcgacaga gtgagactcc atctcaaaca 1985

acaacaacaa caacaacaac aacaacaaac cacaaaatta tttgagtact gtgaaggatt 2045

atttgtctaa cagttcattc caatcagacc aggtaggagc tttcctgttt catatgtttc 2105

agggttgcac agttggtctc tttaatgtcg gtgtggagat ccaaagtggg ttgtggaaag 2165

agcgtccata ggagaagtga gaatactgtg aaaaagggat gttagcattc attagagtat 2225

gaggatgagt cccaagaagg ttctttggaa ggaggacgaa tagaatggag taatgaaatt 2285

cttgccatgt gctgaggaga tagccagcat taggtgacaa tcttccagaa gtggtcaggc 2345

agaaggtgcc ctggtgagag ctcctttaca gggactttat gtggtttagg gctcagagct 2405

ccaaaactct gggctcagct gctcctgtac cttggaggtc cattcacatg ggaaagtatt 2465

ttggaatgtg tcttttgaag agagcatcag agttcttaag ggactgggta aggcctgacc 2525

ctgaaatgac catggatatt tttctaccta cagtttgagt caactagaat atgcctgggg 2585

accttgaaga atggcccttc agtggccctc accatttgtt catgcttcag ttaattcagg 2645

tgttgaagga gcttaggttt tagaggcacg tagacttggt tcaagtctcg ttagtagttg 2705

aatagcctca ggcaagtcac tgcccaccta agatgatggt tcttcaacta taaaatggag 2765

ataatggtta caaatgtctc ttcctatagt ataatctcca taagggcatg gcccaagtct 2825

gtctttgact ctgcctatcc ctgacattta gtagcatgcc cgacatacaa tgttagctat 2885

tggtattatt gccatataga taaattatgt ataaaaatta aactgggcaa tagcctaaga 2945

aggggggaat attgtaacac aaatttaaac ccactacgca gggatgaggt gctataatat 3005

gaggaccttt taacttccat cattttcctg tttcttgaaa tagtttatct tgtaatgaaa 3065

tataaggcac ctcccacttt tatgtataga aagaggtctt ttaatttttt tttaatgtga 3125

gaaggaaggg aggagtagga atcttgagat tccagatcga aaatactgta ctttggttga 3185

tttttaagtg ggcttccatt ccatggattt aatcagtccc aagaagatca aactcagcag 3245

tacttgggtg ctgaagaact gttggattta ccctggcacg tgtgccactt gccagcttct 3305

tgggcacaca gagttcttca atccaagtta tcagattgta tttgaaaatg acagagctgg 3365

agagtttttt gaaatggcag tggcaaataa ataaatactt ttttttaaat ggaaagactt 3425

gatctatggt aataaatgat tttgttttct gactggaaaa ataggcctac taaagatgaa 3485

tcacacttga gatgtttctt actcactctg cacagaaaca aagaagaaat gttatacagg 3545

gaagtccgtt ttcactatta gtatgaacca agaaatggtt caaaaacagt ggtaggagca 3605

atgctttcat agtttcagat atggtagtta tgaagaaaac aatgtcattt gctgctatta 3665

ttgtaagagt cttataatta atggtactcc tataattttt gattgtgagc tcacctattt 3725

gggttaagca tgccaattta aagagaccaa gtgtatgtac attatgttct acatattcag 3785

tgataaaatt actaaactac tatatgtctg ctttaaattt gtactttaat attgtctttt 3845

ggtattaaga aagatatgct ttcagaatag atatgcttcg ctttggcaag gaatttggat 3905

agaacttgct atttaaaaga ggtgtggggt aaatccttgt ataaatctcc agtttagcct 3965

tttttgaaaa agctagactt tcaaatacta atttcacttc aagcagggta cgtttctggt 4025

ttgtttgctt gacttcagtc acaatttctt atcagaccaa tggctgacct ctttgagatg 4085

tcaggctagg cttacctatg tgttctgtgt catgtgaatg ctgagaagtt tgacagagat 4145

ccaacttcag ccttgacccc atcagtccct cgggttaact aactgagcca ccggtcctca 4205

tggctatttt aatgagggta ttgatggtta aatgcatgtc tgatccctta tcccagccat 4265

ttgcactgcc agctgggaac tataccagac ctggatactg atcccaaagt gttaaattca 4325

actacatgct ggagattaga gatggtgcca ataaaggacc cagaaccagg atcttgattg 4385

ctatagactt attaataatc caggtcaaag agagtgacac acactctctc aagacctggg 4445

gtgagggagt ctgtgttatc tgcaaggcca tttgaggctc agaaagtctc tctttcctat 4505

agatatatgc atactttctg acatatagga atgtatcagg aatactcaac catcacaggc 4565

atgttcctac ctcagggcct ttacatgtcc tgtttactct gtctagaatg tccttctgta 4625

gatgacctgg cttgcctcgt cacccttcag gtccttgctc aagtgtcatc ttctccccta 4685

gttaaactac cccacaccct gtctgctttc cttgcttatt tttctccata gcattttacc 4745

atctcttaca ttagacattt ttcttattta tttgtagttt ataagcttca tgaggcaagt 4805

aactttgctt tgtttcttgc tgtatctcca gtgcccagag cagtgcctgg tatataataa 4865

atatttattg actgagtgaa aaaaaaaaaa aaaaa 4900

<210> 2

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr

20 25 30

Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser

35 40 45

Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu

50 55 60

Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr

85 90 95

Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys

100 105 110

Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

115 120 125

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

130 135 140

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

165 170 175

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

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Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

210 215 220

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

85 90 95

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

100 105 110

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

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Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

130 135 140

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

145 150 155 160

Val Arg Ser Lys Arg

165

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> 结构域

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<223> CD28

<220>

<221> 结构域

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<223> CD137

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Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

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Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

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Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

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Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

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Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

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Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

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Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

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Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys

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Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

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225 230 235 240

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

245

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

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<223> CD134

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65 70 75 80

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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

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180 185 190

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Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro

210 215 220

Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

225 230 235

<210> 6

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

<222> (203)..(318)

<223> CD2

<400> 6

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

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Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

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Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

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Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Lys Lys Gln Arg

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Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn

305 310 315

<210> 7

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

<222> (202)..(249)

<223> CD29

<400> 7

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Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

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Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

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Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

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65 70 75 80

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Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

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180 185 190

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210 215 220

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225 230 235 240

Val Val Asn Pro Lys Tyr Glu Gly Lys

245

<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

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<223> GITR

<400> 8

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1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

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Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

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Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

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Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

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130 135 140

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

145 150 155 160

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

180 185 190

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gln Leu Gly Leu His Ile

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225 230 235 240

Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly

245 250 255

Asp Leu Trp Val

260

<210> 9

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

<222> (203)..(288)

<223> IL2Rg

<400> 9

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

85 90 95

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

100 105 110

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

115 120 125

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

130 135 140

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

145 150 155 160

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

180 185 190

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Glu Arg Thr Met Pro Arg

195 200 205

Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly

210 215 220

Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu

225 230 235 240

Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro

245 250 255

Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln

260 265 270

His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr

275 280 285

<210> 10

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

<222> (203)..(264)

<223> CD40

<400> 10

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

85 90 95

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

100 105 110

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

115 120 125

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

130 135 140

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

145 150 155 160

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

180 185 190

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Lys Val Ala Lys Lys

195 200 205

Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn

210 215 220

Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu

225 230 235 240

Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser

245 250 255

Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln

260

<210> 11

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白融合

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

<222> (203)..(277)

<223> CD150

<400> 11

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

85 90 95

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

100 105 110

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

115 120 125

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

130 135 140

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

145 150 155 160

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

180 185 190

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Arg Arg Gly Lys Thr

195 200 205

Asn His Tyr Gln Thr Thr Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr Ile Tyr Ala

210 215 220

Gln Val Gln Lys Pro Gly Pro Leu Gln Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro

225 230 235 240

Ala Gln Asp Pro Cys Thr Thr Ile Tyr Val Ala Ala Thr Glu Pro Val

245 250 255

Pro Glu Ser Val Gln Glu Thr Asn Ser Ile Thr Val Tyr Ala Ser Val

260 265 270

Thr Leu Pro Glu Ser

275

<210> 12

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白融合

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(202)

<223> CD28

<220>

<221> 结构域

<222> (203)..(318)

<223> CD2

<220>

<221> 结构域

<222> (319)..(350)

<223> CD40

<220>

<221> 结构域

<222> (319)..(380)

<223> CD40

<400> 12

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

85 90 95

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

100 105 110

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

115 120 125

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

130 135 140

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

145 150 155 160

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

180 185 190

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Lys Lys Gln Arg

195 200 205

Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val Ala

210 215 220

Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro

225 230 235 240

Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His Arg

245 250 255

Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val Gln

260 265 270

His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val His

275 280 285

Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro

290 295 300

Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Lys Lys

305 310 315 320

Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro

325 330 335

Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala

340 345 350

Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp

355 360 365

Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln

370 375 380

<210> 13

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 结构域

<222> (1)..(98)

<223> CD28细胞外截短

<400> 13

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

85 90 95

Glu Val

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白标签

<400> 14

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp His

1 5