具体实施方式

为克服现有技术中存在的问题，本发明公开了一种稳定性、耐用性更强、保质期更长的集成固定的牛心包组织的制造方法。进一步地，本发明还公开了一种低氧环境下集成固定的牛心包生物假体的制造方法，涉及心血管修复、重建，特别是心脏瓣膜置换修复等领域。

研究发现，低氧环境有助于增强组织与处理化学品的化学反应性，并通过去除死菌落、有毒材料等来避免腐败变化；还可以防止固定组织的氧化应激和保存化学溶液的降解。

本发明的方法包括在卫生条件和低氧环境下收集和采获生心包组织，连续喷淋盐水，碱性盐水溶液冲洗过程，化学固定使交联组织稳定，避免结构恶化和剥夺，固定组织激光切割过程，醛保存以防止酶促降解，基于AAS的液体化学灭菌和低浓度保存溶液。

该方法的各个步骤在下文中描述。

生心包收集和采获：

生牛心包通常可以从经过FDA检查和批准的屠宰场收集和采获，并符合ISO 13485和ISO 22442-1、-2、-3中描述的程序。

在一个实施例中，从当地屠宰场获得生牛心包，置于温度范围在2-8℃之间的冷冻磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M，pH 7.4)中，并立即转移到实验室进行进一步处理。用生理盐水冲洗的生组织，并在18-20℃的温度下去除粘附的脂肪。

在另一个实施例中，从FDA批准的屠宰场收集具有完整心包膜的生牛心脏，其中按照标准和监管规范维护动物的历史记录和数据。通过沿着心脏底部切割，将生心包组织解剖并从心脏中取出，使剩余的组织完好无损。将厚度均匀的生心包组织在缓冲盐水中转移到实验室，以保持组织结构的完整性和电解平衡。冲洗生组织，并在实验室中去除外部脂肪、粘附材料。

在优选的实施例中，从年龄上限低于24个月且身体健康(传染性海绵状脑病-TSE/牛海绵状脑病-无BSE水平)的牛收集生牛心包膜。屠宰场对健康数据和记录进行监控和维护。将牛心立即转移到低氧室中，柜内温度控制在优选15-25℃，更优选18-20℃。生组织通常通过从动物心脏中手术切割获得。将其修剪或切割成一定尺寸并用去离子水、碱性盐水溶液、盐水或其他合适的洗涤液洗涤。在执行收集和采获程序的同时，保持连续的冷冻盐水喷淋，以避免剥夺并防止活细胞发生腐败变化。冷冻盐水的喷淋在这段时间内保持电解pH值平衡，并避免生组织发生腐败变化

图1示出了能够在收集和采获过程中在心脏瓣膜或心脏瓣膜心包组织上连续喷淋冷冻盐水的装置(1)。该装置包括具有盐水罐(3)的气密容器。盐水罐(3)连续供应盐水至收集的保持在装置内预定距离处的合适位置的牛心脏或心包组织(2)。装置中还设有氮气入口(4)、温度分析仪(5)、氧气分析仪(6)和排气管线(7)，以维持适宜的低氧环境。

将生牛心包置于磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M，pH 7.4±0.2)中并立即运送到实验室。整个操作在范围为5–15％、优选为8–10％的低氧环境中优选地在20-40分钟内完成；更优选地在30分钟内完成。使用传统的氧气分析仪测量周围环境的氧气含量，其可选择的测量范围为0.1-25％体O₂。低氧条件可防止对活细胞的氧化应激并保持胶原纤维的结构完整性。采获的生组织用生理盐水进一步冲洗并去除粘附的脂肪。在去除粘附的脂肪和脂肪材料的同时，保持磷酸盐缓冲盐水的连续喷淋，然后在8-10℃的温度下保存在冷冻的0.9％盐水溶液中直到进行固定。冷冻盐水的使用通过为细菌和其他微生物提供拮抗剂环境来减少微生物生长。由于盐水中的低温，微生物的生命周期受到阻碍并避免活组织发生腐败变化。

冲洗过程：

一旦从心包组织中去除脂肪、血管和凝块等粘附材料，在交联过程之前，用碱性盐水溶液反复冲洗以保持电解质平衡并防止对活细胞的损伤。在一个实施例中，用碱性盐水溶液冲洗生组织三次以去除粘附材料的痕迹。

在一个实施例中，通过将生心包组织在相对湿度为55％的室温下置于不锈钢(SS)浴中，用冷冻的0.9％盐水溶液冲洗组织。最初，将冷冻的0.9％盐水溶液倒入不锈钢浴中，并将牛心包放置在那里，在收集时已经修剪和洗涤过牛心包。然后，反复冲洗生心包组织，直到洗掉所有碎片和剩余的脂肪材料。冲洗过程后，再次将新鲜和冷冻的盐水溶液倒入SS浴中，然后从两侧冲洗组织。

在一个优选的实施例中，在18-20℃温度下将生牛心包置于磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M，pH 7.4±0.2)中。此外，用冷冻的0.9％盐水冲洗组织三次，并在修剪和切割生组织之前放置在SS浴中，以完全去除粘附的脂肪以完全去除脂肪材料。一旦去除了多余的材料并用冷冻的0.9％盐水进行了冲洗，就检查冲洗过的心包组织是否有孔、损坏的表面和组织的厚度。

用传统的厚度计测量冲洗过的组织的厚度。该组织再次用生理盐水洗涤，并进一步进行交联或GA固定过程。用冷冻的0.9％盐水冲洗可去除活细胞中的异味，并增强组织中活细胞的电解平衡。整个用盐水溶液冲洗过程在05-15分钟内完成，优选在09-12分钟内完成。

冲洗过的牛心包组织的交联：

戊二醛固定是一种用于制造生物人工心脏瓣膜的组织保存过程。交联过程的目的是生产适合医疗植入的完整、稳定、耐用和生物惰性的固定组织。胶原蛋白是一种主要的组织蛋白，可提供强度和抵抗组织断裂应力的能力，并在其长期耐用性方面发挥关键作用。

冲洗过的牛组织的固定通常使用戊二醛水溶液进行，因为戊二醛具有双醛基，与胶原纤维复合材料具有最高的交联稳定性。戊二醛处理会改变胶原蛋白的特性，并使组织成为人类宿主可接受的组织。交联过程被证明可以增加固定的心包组织的稳定性和强度，因此适用于制作或制造生物假体。

然而，可以加入许多其他交联剂/化学品来固定冲洗过的牛心包或任何其他生物组织，如下表所示，作为固定剂以制造非反应性组织；

表：1交联剂列表

在一个实施例中，制备新鲜的0.625％戊二醛(CHO(CH₂)₃CHO)水溶液，然后在常氧环境下真空过滤以去除任何不需要的颗粒。

图2示出了一块冲洗过的心包组织(2)，该组织位于带有锁定系统(10)的固定架(9)中的SS托盘(8)上。

如图3所示，在带有氮气入口(4)、温度分析仪(5)、氧气分析仪(6)、排气管(7)和循环泵(12)的扁平凸缘(FF)(11)中进行固定。

循环泵连接在FF罐的一个凸缘的入口和另一端的溶液出口。在另一个凸缘上，连接医用级氮气(N₂)气管以去除FF罐中的空气和氧气，而氧气(O₂)分析仪和温度传感器连接到其他探头。通过将医用级N₂气流吹入FF罐，在腔室内的整个过程中，氧气水平保持在5-15％之间，优选保持在8-10％之间。温度和氧含量百分比对冲洗过的组织和交联溶液具有功能影响。

在气氛的常氧环境下，将大约5升溶液倒入扁平凸缘(FF)罐中。循环泵连接到FF罐，以实现交联溶液的适当循环，因为它增强了与冲洗过的组织的交联能力，并提供了组织蛋白与固定剂的稳定结合。溶液的循环还提供了冲洗过的组织对上表面和下表面的更好的粘附/接触。此外，循环机制增强了冲洗过的牛心包的漂浮能力，将其放置在固定架中，并在18-20℃的温度下保持30分钟-50分钟。之后，用0.9％盐水溶液冲洗以除去未反应的戊二醛，并在室温下进一步在0.625％戊二醛溶液中保存06天-10天。交联过程后，所得组织呈金黄色，厚度在0.32mm-0.48mm之间。可选地，其他厚度范围(例如0.40mm-0.55mm或0.30mm-0.50mm等)的组织可以利用相同的过程实现。

在一个优选的实施例中，交联过程利用低氧室中的中性压力和固定剂(即戊二醛)的连续循环。该低氧室有助于保持胶原基质的天然弹性并增强冲洗过的牛组织中存在的胶原分子的交联稳定性。过程中使用的戊二醛为分析级试剂，含量不低于25％。交联过程允许戊二醛与赖氨酸链的胶原蛋白分子形成稳定的交联，从而形成耐用的纤维组织结构，具有适合生物假体心脏瓣膜和心包贴片应用的长期性能特性。

最初，将冲洗过的牛心包置于含有0.9％生理盐水溶液的SS浴中。冲洗过的组织用盐水反复洗涤，优选在18-20℃温度下洗涤三次，每次03分钟，并放置在固定架中。将冲洗过的组织块光滑的一面朝上放在夹具(即固定架)底部。将光滑表面置于上侧的优点在于它增强了交联能力、效率并且还增加了组织的鲁棒性。固定在框架中时，冲洗过的组织应牢固，以使整个表面可用于与固定剂/溶液接触。如有必要，可以修剪多余的组织。所有含有冲洗过的组织的框架都被放置在FF罐中进行交联过程。

在清洁和低氧柜中制备以注射用水(WFI)为溶剂的0.625％戊二醛水溶液，如表2所示，以避免戊二醛的污染和降解，以保持其物理和化学特性。使用低氧柜制备交联溶液的意义在于通过保持18-20℃的工作区温度来保持戊二醛溶液的化学性质，并防止毒素污染会影响冲洗过的组织的交联结果。WFI可增强戊二醛的稳定性并减少降解并避免任何有害的微生物生长。对于交联过程，将大约5升过滤后的固定液倒入FF罐中，并放置8-10个装有冲洗过的组织的圆形框架。框架可能会漂浮在FF罐中。交联溶液保持循环，以与冲洗过的牛心包组织进行更有效的交联过程。流速保持在0.5-2L/分钟，优选1.3L/分钟-2.2L/分钟，更优选0.8L/分钟-1.1L/分钟。组织浸渍时间设定为约20分钟-50分钟，优选30分钟-40分钟或更优选35分钟。FF罐和周围环境的温度保持在15℃-25℃，优选18℃-23℃或更优选18℃-20℃。之后，交联的组织在0.625％戊二醛缓冲水溶液中保存6天-10天，优选7天-9天或更优选08天，以增强固定组织的耐久性和稳定性。保持固定温度会增加固定液扩散到组织中的速度，并加快固定液与组织成分(如-NH₂基团的蛋白质)之间的化学反应速度，从而提供“集成(integrated)”和“持久(durable)”的固定的牛心包组织。戊二醛与蛋白质的侧链反应形成活性羟甲基。戊二醛还会与不饱和脂质中的某些基团发生反应。

以下方案1表示固定反应。

方案1

经过化学交联过程后，固定的组织在低氧环境下放置在新鲜配制的0.625％戊二醛溶液中直至进一步使用。

表2：1升0.625％戊二醛水溶液的配制体积

固定组织的激光切割：

激光切割系统用于切割用于心脏瓣膜制造的固定组织小叶。

图4示出了激光切割托盘，其中提供了SS托盘(9')用于激光切割固定组织(2')。

切割材料的方法在低氧环境下采用绘图激光切割系统。激光切割系统由计算机控制，包括带有运动系统的激光器。激光根据计算机指定的预定模式精确切割组织，该模式与心脏小叶设计中指定的标准相匹配。在激光切割过程中，激光能量转化为热能，从而产生特定形状的小叶，可以放置在心脏瓣膜框架中以构建装置。

如图4所示，将固定的心包组织放置在SS激光切割板上，并且在低氧环境下提供如图5所示的激光束(13)源。

在激光切割过程中，组织的光滑表面向上放置并与激光束直接接触。它可以防止对固定组织的灼烧作用并增强组织的边缘到边缘切割，从而涉及固定组织小叶的精确切割并降低血栓形成的风险。激光切割后，固定的组织小叶用碱性盐水溶液/0.9％冷冻盐水溶液冲洗，以消除低氧环境(即氧气含量为8-10％，工作区温度为18-20℃)下的痕迹。进行激光切割组织的重复洗涤步骤，以避免任何不必要的污染。在盐水洗涤步骤之后，激光切割组织用0.625％戊二醛水溶液冲洗3次，以去除存在于激光切割组织边缘的烧伤碎片痕迹。此外，用固定液冲洗可减少激光切割步骤中产生的有毒元素并去除死菌落或其他毒素等。冲洗激光切割的小叶后，将其再次在低氧环境下浸入0.625％戊二醛缓冲溶液中，直至进一步使用，即心脏瓣膜制造。激光切割组织小叶在同一溶液中的保存将涉及组织的基本特征和特性。激光切割的牛心包小叶厚度保持在0.32mm至0.48mm，用于心脏瓣膜制造和外科血管重建和修复。

表3：激光切割参数

激光切割组织的保存：

将激光切割的牛心包保存在0.625％戊二醛中保持湿润，在含氧量为5-15％、优选为8-10％且温度为8-10℃的低氧环境下保存。在一个优选实施例中，激光切割的牛心包在8-10℃的温度下与80ml的0.625％戊二醛溶液一起在真空密封保存罐中保存，用于在低氧环境下保存直至其进一步使用。

激光切割组织小叶的AAS处理：

生物组织的磷脂可以作为钙化的底物，从而缩短组织的保质期，因此使用各种醇溶液与醛和表面活性剂组合来消除这些可钙化材料。在一个优选的实施例中，乙醇用于提取与醛(即甲醛)和表面活性剂(例如吐温80)组合的磷脂。

在一些示例性实施例中，还掺入诸如甲醇和异丙醇等其他低分子量醇以有效减少激光切割组织小叶的钙化，这增加了生物假体的稳定性、完整性和性能。存在于磷脂内的磷是钙提取磷脂的潜在结合位点，可减轻植入后的体内钙化。由于AAS含有与磷脂具有相似结构的醇，因此可以从激光切割的组织小叶中提取。更长链的醇与磷脂具有更相似的结构，并且已知它们替代磷脂分子，从而更有效地去除磷脂分子。去除磷脂和脂质含量也减少了身体对胆固醇的吸收，从而避免了钙化，这是生物组织的主要缺点。使用AAS作为抗钙化处理和减少生物负荷的步骤可延长生物假体的保质期。

i.甲醛的作用：

甲醛是来自具有单个醛部分的交联类别的材料。它还具有杀菌特性，因此可用作杀菌剂。

在一些示例性实施例中，交联剂不限于甲醛或戊二醛，而是可以选自各种类别，例如碳二亚胺、环氧化物和与醛的其他组合，例如甘油醛等。

ii.乙醇的作用：

加入有机溶剂(乙醇、辛醇和辛二醇)进行组织处理，以去除残留的磷脂含量，后者是钙的结合底物。

iii.聚山梨醇酯-80的作用：

聚山梨醇酯80/吐温80是一种非离子表面活性剂和乳化剂，源自聚乙氧基化脱水山梨糖醇和油酸。表面活性剂的特征在于它倾向于吸附在表面和界面上。吐温-80还可以去除组织中与组织保质期直接相关的酸性磷脂。

在另一个示例性实施例中，表面活性剂可以选自阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂或其混合物的类别。阴离子表面活性剂的各种示例是十二烷基硫酸钠、十二烷基磺基乙酸钠，非离子表面活性剂的示例是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚氧乙烯、吐温80或吐温60。

表4：AAS溶液的体积

将激光切割的组织小叶在低氧环境中浸入AAS溶液中1小时至20小时，其中聚丙烯(PP)保存罐内的氧含量保持在5-15％之间，优选保持在8-10％之间。在此浸泡期间，AAS溶液的温度保持在25℃-45℃。升高温度会增强化学反应，从而去除易于钙化的磷脂。

在优选的实施例中，AAS溶液在低氧气氛下制备；激光切割的组织小叶进一步进行生物负荷减少过程，也称为AAS处理。将激光切割的组织放置在真空密封的保存罐中，该罐含有大约50ml-90ml、更优选75-85ml的AAS溶液，在轨道振动器下用于温和的流体运动。在5℃至45℃、更优选37℃至40℃的温度下将该罐置于定轨振荡器中3小时至6小时，并伴随温和的流体运动。由于轻轻摇动，生物负荷减少过程通常在短时间内完成。处理后，AAS处理(固定)的组织用去离子水或盐水溶液或磷酸盐缓冲盐水洗涤，并在低氧环境下进一步保存在0.625％戊二醛溶液中，以保持固定的牛心包组织的结构完整性和特性。

在受控环境条件下，即在层流(LAF)下，固定组织进一步用于心脏瓣膜制造。在心脏瓣膜的制作过程中，固定组织必须时刻保持湿润，定期喷洒生理盐水，以在制作过程中保持组织湿润。然后使用液体化学(LC)灭菌过程对心脏瓣膜或生物假体进行灭菌。从组织收集到固定过程在18-20℃之间的温度下的暴露时间如图6所示。低氧环境下的暴露时间阻止了组织的形态、化学特性，从而增强了固定的牛心包组织/生物假体的完整性。然后将经过消毒的生物假体包装并保存在低氧环境中，以增强生物假体的稳定性。

工作示例1

从FDA批准的屠宰场收集心包完好的新鲜牛心脏。屠宰场根据标准和监管规范(即ISO 13485和ISO 22442)维护动物的历史记录和数据。通过沿着心脏底部切割来解剖并从心脏中取出新鲜的心包组织，使剩余的组织完好无损。将厚度均匀的生心包组织在缓冲盐水中运送到实验室。在实验室中冲洗新鲜组织，并修剪掉外部脂肪、粘附材料。

通过在室温和湿度为55％的常氧空气环境中将收集的心包组织放入不锈钢(SS)浴中，用冷冻的0.9％盐水溶液冲洗组织。最初，将100ml冷冻的0.9％盐水溶液倒入不锈钢浴中，并放置在收集时预先修剪和洗涤的牛心包。然后，反复冲洗心包组织，直到洗掉所有碎片和剩余的脂肪材料。多次冲洗后，再次将体积为500ml的新鲜冷冻盐水溶液倒入SS浴中，然后从组织的两个表面冲洗组织并运送用于交联过程。

根据表5新鲜制备5升0.625％戊二醛(CHO(CH₂)₃CHO)水溶液，然后在常氧空气环境中真空过滤以去除任何不需要的碎片。将10块冲洗过的心包组织放置在固定架中。将固定液倒入固定浴中，放入10片心包膜。循环泵连接到FF罐，用于适当地循环交联溶液。流速维持在1.3L/分钟-2.2L/分钟。组织浸泡时间在温度为18℃-20℃的气氛常氧环境下设置为35分钟。之后，交联的组织在0.625％的戊二醛缓冲水溶液中保存8天。此外，它被激光切割成小叶并进行AAS处理以去除生物负荷。

表5：配制5升0.625％戊二醛水溶液的体积

交联的组织还经过生物负荷减少步骤的处理，以去除不需要的碎片、死菌落、毒素和提取胆固醇，从而减少钙化并提高完整性，从而延长固定心包组织的保质期。AAS溶液是在常氧环境下的干燥柜中制备的。将交联的组织放置在真空密封的保存罐中，该罐含有大约50ml-90ml、更优选80ml的AAS溶液，在轨道振荡器下用于温和的流体运动。在37℃至40℃的温度下将该罐置于定轨振荡器中03小时，并伴随温和的流体运动。处理完成后，用去离子水或盐水溶液或磷酸盐缓冲盐水洗涤经AAS处理(固定)的组织，并保存在0.625％戊二醛溶液中。

在如下各种温度条件下将得到的组织进一步保存在新鲜制备的0.625％戊二醛溶液中；

1.将固定的组织在25-30℃低氧环境下保存在0.625％戊二醛溶液中。

2.将固定的组织在25-30℃常氧气氛环境保存在0.625％戊二醛溶液中。

3.将固定的组织在8-10℃低氧环境下保存在0.625％戊二醛溶液中。

4.将固定的组织在8-10℃常氧气氛环境下保存在0.625％戊二醛溶液中。

在初始、03个月、06个月、09个月和12个月的时间间隔内定期测试固定组织的机械强度(组织拉伸强度)。结果在下表6中提供。

表6

根据上述数据，可以得出结论，在8-10℃温度的低氧环境下保存的固定组织具有更好的组织稳定性、完整性和耐用性。

工作示例2

在FDA批准的屠宰场，从年龄上限小于24个月的无TSE/BSE动物中收集新鲜牛心包。根据ISO标准(即ISO 22442)对心包进行解剖，并在0.9％冷冻盐水溶液的连续喷淋下与心脏分离。将具有相同厚度的新鲜心包组织在冷冻盐水中运送到实验室，以维持活细胞中的电解质平衡，以避免组织发生腐败变化。然后冲洗生组织，并在实验室中在低氧柜下用冷冻盐水连续喷淋在组织上修剪外部脂肪、血管和其他粘附材料。检查所得组织表面是否有孔、裂缝和其他碎屑。经批准的优质生心包组织进一步保存在低氧环境下，以防止对组织的氧化损伤，并运送到实验室进行交联过程。

配备低氧环境和温度传感器的扁平凸缘罐组件用于改进交联过程，以提高组织的固定能力和性能。FF罐内保持低氧环境，即周围环境氧含量为8-10％，工作温度保持在18-20℃之间。低氧室有助于保持胶原蛋白基质的自然弹性并增强胶原蛋白分子的交联稳定性。在低氧气氛柜下新鲜制备5升0.625％戊二醛(CHO(CH₂)₃CHO)水溶液，以防止戊二醛溶液降解和氧化反应，然后真空过滤以去除任何不需要的颗粒。将10块心包组织放置在固定架中，以将组织固定在拉伸架中。将固定液倒入FF罐中并放置10片心包。FF罐进一步与泵相连，用于交联溶液循环，并附接有O₂分析仪和温度传感器。流速保持在1.3升/分钟和2.2升/分钟之间。组织浸泡时间设置为18℃-20℃温度下35分钟。之后，交联的组织在低氧环境中保存在0.625％戊二醛水溶液中08天。交联的组织还经过生物负荷减少步骤的处理，以去除不需要的碎片、死菌落、毒素和提取磷脂，减少胆固醇摄取，从而抑制钙化并增强固定心包组织的完整性。将组织放置在真空密封的保存罐中，该罐含有大约50ml-90ml、更优选80ml的AAS溶液，在轨道振荡器下用于温和的流体运动。在37℃至40℃的温度下将该罐置于定轨振荡器中03小时，并伴随温和的流体运动。处理后，用去离子水或盐水溶液或磷酸盐缓冲盐水洗涤经AAS处理(固定)的组织，并在如下所述的各种条件下保存在0.625％戊二醛溶液中。

1.将固定的组织在25-30℃低氧环境下保存在0.625％戊二醛溶液中。

2.将固定的组织在25-30℃常氧气氛环境下保存在0.625％戊二醛溶液中。

3.将固定的组织在8-10℃低氧环境下保存在0.625％戊二醛溶液中。

4.将固定的组织在8-10℃常氧气氛环境保存在0.625％戊二醛溶液中。

在初始、03个月、06个月、09个月和12个月的时间间隔内定期测试固定组织的机械强度(组织拉伸强度)。结果在下表7中提供。

根据上述数据，已经得出结论，与在常氧环境下处理并在相同的气氛中保存的固定组织相比，在8-10℃的低氧空气环境下保存的固定组织具有更好的组织稳定性、完整性和耐用性。综合以上数据可知，在低氧环境和8-10℃的温度下，01年保存期间固定组织的拉伸性能没有观察到显著变化。在长期保存期间，假定拉伸性能将保持，因此固定组织在一段时间内保持其完整性、稳定性和性能。

因此，与在示例1中描述的在常氧空气环境下处理的牛组织相比，如上所述在低氧环境下处理牛心包组织提供的组织在其完整性方面显示出明显的优势，具有更高的拉伸强度、最小的裂缝和破裂、清洁和光滑的表面、颜色较浅，从而提供更高的稳定性。之后，通过制造心脏瓣膜，按照ISO-5840进一步测试在低氧环境下处理的固定组织的体外血流动力学性能。

已经基于一些优选实施例和非限制性示例描述了本发明。在不脱离如先前在所附权利要求中描述和限定的本发明的范围的情况下，可以进行各种修改。