一种基于磁性纳米颗粒的微流控式即时免疫检测方法
阅读说明：本技术 一种基于磁性纳米颗粒的微流控式即时免疫检测方法 (Microfluidic immediate immunodetection method based on magnetic nanoparticles ) 是由 何赛灵 支正良 于 2021-09-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于磁性纳米颗粒(MNP)的微流控式即时免疫检测方法。该方法通过采用MNP或MNP@Au作为抗体载体直接捕获复杂样品环境中的目标物,仅需要施加磁场即可实现目标物的分离,并采用配套的固体试剂快速溶解配方,缩短测试时间,延长免疫试剂的保质期。为提高检测的灵敏度和精准度,采用时间分辨荧光检测方法降低背景信号,MNP表面的金层可以对拉曼标记物进行表面增强拉曼散射增强,并且将微流控芯片与共聚焦光谱显微成像系统、差分检测结合。为降低检测成本,将比色反应内置于微流控芯片中,然后与手机APP结合研发显色微流控芯片检测仪。为提高诊断的准确性,提出了一个微流控芯片陈列结构方案,实现对多种疾病标志物的同时检测。(The invention discloses a microfluidic immediate immunodetection method based on Magnetic Nanoparticles (MNP). According to the method, MNP or MNP @ Au is used as an antibody carrier to directly capture the target object in a complex sample environment, the separation of the target object can be realized only by applying a magnetic field, and a matched solid reagent rapid dissolving formula is adopted, so that the testing time is shortened, and the quality guarantee period of the immunoreagent is prolonged. In order to improve the sensitivity and the accuracy of detection, a time-resolved fluorescence detection method is adopted to reduce background signals, a gold layer on the surface of the MNP can perform surface-enhanced Raman scattering enhancement on a Raman marker, and the microfluidic chip is combined with a confocal spectrum microscopic imaging system and differential detection. In order to reduce the detection cost, the colorimetric reaction is arranged in the microfluidic chip, and then the colorimetric reaction is combined with a mobile phone APP to research and develop the chromogenic microfluidic chip detector. In order to improve the accuracy of diagnosis, a scheme of a microfluidic chip array structure is provided, and the simultaneous detection of multiple disease markers is realized.)
技术领域
本发明属于光学传感领域，涉及一种基于磁性纳米颗粒的微流控式即时免疫检测方法。
背景技术
微流控芯片，又称为芯片实验室（Lab-on-a-chip）或微流控芯片实验室，是微流控技术（microfluidics）实现的主要平台。芯片实验室具有将生物、化学等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上的能力，可以完成样品的预处理、分离、稀释、混合、化学反应和检测等所有步骤。在复杂样品环境中实现针对一些生物标志物的免疫痕量分析最大的挑战在于目标分析物与抗体复合物的分离。而固定有抗体的磁性纳米粒子具有与磁体相吸的固有属性，根据此特性可以利用其在复杂环境样品中直接捕获、分离、预浓缩目标物并为免疫分析技术提供了新的发展机遇。将磁性纳粒子与微流控芯片相结合与传统的基于胶体金的侧向流免疫分析方法相比，在灵敏度、精准度、重现性等方面都有压倒性的优势。
传统的分析检测往往是通过测定纳米颗粒的荧光强度来表征目标分析物的浓度。此方法忽略了颗粒本身光学性质对信号的影响，比如在纳米磁颗粒的存在下，其对于某些波长的光会有较强的吸收会导致信号的减弱。而且在痕量分析物的情况下，由于仪器自身的限制往往会测不到信号，致使不能达到更低的检测限。
时间分辨荧光分析是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术，它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点。使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了酶标或放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、对被标记物的生物活性和结构无影响、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、可实现多种标记及多元测试、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。
气体微秒脉冲激光器与传统的光纤和固体激光器相比，该激光器无需通过复杂的非线性变频手段（倍频、合频）就能直接激发波长位于337 nm的高相干光束，在连续工作下可输出功率为100毫瓦的337 nm激光。通过外部的TTL信号调制，连续激光工作模式可以转变为脉冲工作模式。脉冲工作模式下，该激光器可输出持续时间为微秒，脉冲重复频率在100 Hz到1 kHz之间连续可调的脉冲激光，激光器功率稳定性RMS指标小于3%，能够保证时间荧光分辨系统的高稳定性。
荧光微流控式即时免疫检测产品的研发在国内外已十分流行。国内公司有深圳微点，南京岚煜，华迈兴微，中新科炬，石家庄禾柏，浙江普施康，成都微康等；但目前只有2家海外研发厂家（LumiraDx和Quidel）的产品的检测新冠病毒抗原能达到97%以上；而国内研发的病毒抗原即时检测产品的灵敏度和精准度存在明显不足，极少能符合FDA严格的检测要求，所以，在这领域非常有必要开展技术创新研发。
拉曼散射起源于分子或晶体内原子之间相对位置的改变，即振动和转动，是研究分子和固体材料结构的一种重要分析手段。拉曼光谱作为分子光谱技术能够实现非接触、无损伤检测已经被广泛应用于生物检测领域。显微技术与拉曼光谱仪的结合是拉曼实验技术的一次革命性突破，显微拉曼系统利用显微物镜将激光束聚焦在样品上，并利用同一物镜收集拉曼散射光，一方面减少测试所需要的样品量，另一方面也减小测量需要的激光功率，从而大大扩宽拉曼光谱技术的应用范围。更为重要的是，显微技术使得拉曼测量的空间分辨率提升到亚微米和微米尺度，从而为拉曼光谱技术引入一项崭新的实验技术方法，即拉曼光谱成像。这有利于实现把传统的单点分析扩展到对一定空间范围内的样品进行同时对比分析。
肿瘤是单一变异细胞多次克隆的结果，其发生是多步骤、多基因的癌变过程。肿瘤细胞生物学特性具有复杂性及多态性，表现为癌变后不同种肿瘤病理类型的差异、同种病例类型的肿瘤细胞的一直想、肿瘤细胞基因型及细胞表型的差异等。在一个肿瘤中存在着不同特性的细胞，在生长速率、表面受体、免疫特性、浸润性、转移性、对药物毒性方面均可能不同。因此，同一种肿瘤可含一种或多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型，既可有共同的肿瘤标志物，也可有不同的肿瘤标志物。为了提高肿瘤标志物检测的阳性率，选用一些特异性较高的肿瘤标志物进行联合检测，可以提高肿瘤标志物的应用价值。