一种可减毒增效的美白组合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种可减毒增效的美白组合物及其制备方法和应用 (Whitening composition capable of reducing toxicity and enhancing efficacy and preparation method and application thereof ) 是由 赵力民 赵平 王艳 唐子溦 裴永艳 李占潮 林洁柔 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种可减毒增效的美白组合物及其制备方法和应用。该美白组合物是具有美白功能的中药材经益生菌发酵和提取两个步骤获得的有效成分；具体地,其为先提取具有美白功能的中药材的有效成分后经益生菌发酵获得的产物,和/或具有美白功能的中药材先经益生菌发酵后再提取有效成分获得的产物。本发明通过益生菌发酵中药材,并通过调整合适的发酵时间来获得更有效的目标成分,这种做法符合新产品的新趋势。由于很多低毒性的中药也有很好的美白,保湿,抗炎等功效,而中药发酵可以进一步增强中药的药效或者降低它的毒性,且消费者更愿意相信天然成分更安全,故将发酵的中药运用于化妆品具有良好的前景。(The invention provides a whitening composition capable of reducing toxicity and improving efficacy, and a preparation method and application thereof. The whitening composition is an effective component obtained by fermenting and extracting traditional Chinese medicinal materials with whitening function through probiotics; specifically, the whitening composition is a product obtained by extracting active ingredients of traditional Chinese medicinal materials with whitening function and then fermenting the active ingredients, and/or a product obtained by extracting active ingredients of traditional Chinese medicinal materials with whitening function after fermenting the active ingredients. The invention obtains more effective target components by fermenting the traditional Chinese medicinal materials with probiotics and adjusting proper fermentation time, and the method accords with the new trend of new products. Because many low-toxicity traditional Chinese medicines also have good whitening, moisturizing, anti-inflammatory and other effects, the traditional Chinese medicine fermentation can further enhance the efficacy of the traditional Chinese medicines or reduce the toxicity of the traditional Chinese medicines, and consumers prefer to believe that natural ingredients are safer, the fermented traditional Chinese medicines have good prospects when applied to cosmetics.)
技术领域
本发明涉及一种可减毒增效的美白组合物及其制备方法和应用。
背景技术
传统的中药炮制，其加工条件复杂，对中药的利用率极低。
而益生菌在生长和代谢过程中产生的一系列酶代谢产物，如：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，这些酶可以破坏植物的细胞壁，促进活性成分的溶解，并可以进一步将中药中的糖，蛋白质，纤维和其他成分分解并转化为易于被人体吸收的小分子，从而使中药有效成分在很大程度上保留，同时提高了药效。同时，这些酶物质可以和中药中的某些特殊成分相互作用，并对其有效成分进行修饰，以促进新物质的形成，并降低中药中有毒成分的含量。
七白散曾是宫廷的不传配方，用来制备可以美容的面膜。七白分别指：白术、白芍、白芨、白鼓、白芷、白茯苓和珍珠粉混合一起制成的美白面膜。后来，后代医家对七白散的配方进行了更改，就出现了各种不同药方组成。比如在《永类铃方》卷二将其改为供洗脸用的洗面七白散(又名七白子，七子白)，洗面七白散的配方为白僵蚕、白蔹、白术、白芍、白牵牛、白附子、白芷，将其共研成粉末，洗面用。主治皮肤粗糙，面部黑斑，蝴蝶斑，皱纹多。其中，白牵牛、白芷、白附子已被《化妆品安全技术规范》(2015年)列入禁用化妆品中，故围绕着余下的四白，即：白蔹、白术、白芍、白僵蚕开展益生菌发酵中药材对药效提升上的影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可减毒增效的美白组合物，其是具有美白功能的中药材经益生菌发酵和提取两个步骤获得的有效成分。进一步地，其为先提取具有美白功能的中药材的有效成分后经益生菌发酵获得的产物，和/或具有美白功能的中药材先经益生菌发酵后再提取有效成分获得的产物。
本发明中所用到的具有美白功能的中药材包括白僵蚕，白蔹，白术，白芍，进一步地，中药材中白僵蚕，白蔹，白术，白芍的用量比优选为1:1:1:1。
所述益生菌选自酵母菌、枯草芽孢杆菌或乳酸杆菌。优选地，所述益生菌为扣囊复膜酵母(如扣囊复膜酵母GMC2.118)、酿酒酵母(酿酒酵母EBY100)、毕赤酵母(如毕赤酵母KM71、毕赤酵母GS115、毕赤酵母X33、毕赤酵母SMD1168)。
白僵蚕来源于蚕蛾科昆虫家蚕4～5龄的幼虫感染白僵菌而致死的干燥体，白僵蚕含有丰富的蛋白质、多糖、黄酮等生物活性成分。它是常用大宗动物药之一，具有祛除黄褐斑，化老年斑，晒斑的功效。《本草纲目》记载：“蜜和擦面，灭黑黯好颜色，或加白牵牛，白僵蚕末，水和掺之”。《神农本草经》中则载有：“灭黑斑，令人面色好”的功效。虽然白僵蚕有良好的美白效果，但白僵蚕体内的白僵菌素有细胞毒性，白僵菌素为白色针状晶体，可致细胞核变形，组织崩解。
白蔹为葡萄科植物白蔹的干燥块根，含有酚酸类、黄酮类、葱醌类等成分，具有美白、治疗面部雀斑、清热祛风的功效。《药性论》记载：“可治面上疮疱”。白蔹具有非常好的美白作用，曾经应用于七子白美白面膜中。《药性论》还有记载其“味苦，平，有毒”。不仅如此，复旦大学附属华山医院静安分院肾脏科收治1例服用白蔹后并发急性肾损伤的患者。
白术为菊科植物白术的干燥根茎，含有白术内酯、苍术醇、蛋白质等成分。古籍《药性论》中记载它有“主面光悦，驻颜祛斑”的作用。明代医学著作《医学入门》中的三白汤将其包含在内。在中医理论中，白术性温，味甘、苦，有延缓衰老之效；现代的药理研究，也证实了白术具有美容作用：白术既可增强免疫功能，又能扩张血管。王等发现白术提取液对肺生长有影响，蔡等用浓度为0.5g/kg的白术提取物对大鼠灌胃，给药14d后，大鼠白细胞中度减少，给药2个月，大鼠出现轻度贫血。
白芍为毛莫科植物芍药的干燥根，含有芍药苷、没食子酸、儿茶素、鞣质等成分，具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗等功效。现代的药理表明，白芍具有抗炎、镇痛、镇静等作用。且实验表明，白芍单独应用时，美白功效不强。白芍中有少量的苯甲酸，苯甲酸是白芍中的无效成分，但长期食用会引起慢性苯中毒，严重的话，还会造成再生障碍性贫血。
本发明的可减毒增效的美白组合物的制备方法中，先提取具有美白功能的中药材的有效成分后经益生菌发酵获得的产物的步骤包括：
粉碎中药材后先用乙醇溶液浸泡，提取有效成分，抽滤后滤液旋蒸至无醇味，加水稀释；在超净工作台上对稀释后的溶液加入益生菌后恒温发酵；发酵后的提取液加无水乙醇进行醇沉，静置后取上清液进行旋蒸浓缩。
本发明的可减毒增效的美白组合物的制备方法中，具有美白功能的中药材先经益生菌发酵后再提取有效成分获得的产物的步骤包括：
粉碎中药材后混合，加去离子水后在超净工作台上在中药材中加入益生菌后恒温发酵；用乙醇溶液浸泡，提取有效成分，抽滤后滤液旋蒸至无醇味；旋蒸后的提取液加无水乙醇进行醇沉，静置后取上清液进行旋蒸浓缩。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
上述方案中，通过益生菌发酵中药材，并通过调整合适的发酵时间(提取与发酵的时间顺序)来获得更有效的目标成分，这种做法符合新产品的新趋势。由于很多低毒性的中药也有很好的美白，保湿，抗炎等功效，而中药发酵可以进一步增强中药的药效或者降低它的毒性，且消费者更愿意相信天然成分更安全，故将发酵的中药运用于化妆品具有良好的前景。
通过实验结果表明，发酵对于细胞有一定的减毒作用，且细胞毒性十分小；四白发酵后提取和提取后发酵较其同等浓度的四白仅提取的提取液而言，功效差异不大而安全性更高；发酵对于四白提取液得到抗炎功效有一定的增效效果，且发酵后再进行提取增效效果更强。
附图说明
图1为等浓度梯度下，四白发酵后提取、仅提取和提取后发酵对酪氨酸酶活性的抑制率曲线图；
图2为VB3，α-熊果苷，传明酸在建议浓度范围下对酪氨酸酶活性抑制率曲线图；
图3为等浓度梯度下，四白发酵后提取、仅提取和提取后发酵对B16细胞作用后细胞存活率曲线图；
图4为等浓度梯度下，四白发酵后提取、仅提取和提取后发酵对B16细胞的黑色素生成抑制率图；
图5为等浓度梯度下，四白发酵后提取、仅提取和提取后发酵对透明质酸酶的抑制率曲线图；
图6为鸡胚尿囊绒膜刺激性实验中阴性对照组加样(生理盐水)前后结果图；
图7为鸡胚尿囊绒膜刺激性实验中阳性对照组加样(氢氧化钠溶液)前后结果图；
图8为鸡胚尿囊绒膜刺激性实验中0.3g/mL四白发酵后提取物加样前后的结果图；
图9为鸡胚尿囊绒膜刺激性实验中0.3g/mL四白仅提取物加样前后的结果图；
图10为鸡胚尿囊绒膜刺激性实验中0.3g/mL四白提取物后发酵加样前后的结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
本发明涉及一种可减毒增效的美白组合物，是通过益生菌发酵具有美白功能的中药材获得的有效成分；具体为先提取具有美白功能的中药材的功能成分后再用益生菌发酵获得有效成分，或先用益生菌对具有美白功能的中药材共同发酵后再提取获得有效成分。
本发明中所用到的具有美白功能的中药材包括白僵蚕，白蔹，白术，白芍，且白僵蚕，白蔹，白术，白芍的用量比优选为1:1:1:1。
所述益生菌为酵母菌、枯草芽孢杆菌或乳酸杆菌。优选为扣囊复膜酵母(如扣囊复膜酵母GMC2.118)、酿酒酵母(酿酒酵母EBY100)、毕赤酵母(如毕赤酵母KM71、毕赤酵母GS115、毕赤酵母X33、毕赤酵母SMD1168)。
试验部分
四种有美白功效中药材有效成分的三种提取方法
A：先发酵后提取四种有美白功效中药材的有效成分
【发酵】1.粉碎各药材，过60目筛；2.四味药各取7.5g，共30g药粉置于150mL锥形瓶中；3.加入72mL去离子水，在超净台中加入4.320mL毕赤酵母KM71，加入1.530mL甲醇；4.空气摇床恒温30℃发酵24h，24h后加入0.780mL甲醇再发酵12h。
【提取】1.转移至500mL锥形瓶中，加入288mL乙醇(配成80％乙醇溶液)；2.浸泡24h，超声0.5h，重复三次；3.提取完后布氏漏斗减压抽滤，滤液50℃旋蒸至无醇味。
【纯化】1.将旋蒸后浓缩的提取液置于量筒内，加入四倍量的无水乙醇进行醇沉；2.置于锥形瓶中，放冰箱静置过夜；3.静置后离心，取上清液，55℃旋蒸浓缩至不能继续浓缩为止，加水定容至50mL。
B：单提取四种有美白功效中药材的有效成分
【提取】1.粉碎各药材，过60目筛；2.四味药各取7.5g，共30g药粉置于150mL锥形瓶中；3.加入72mL去离子水，转移至500mL锥形瓶中，加入288mL乙醇(配成80％乙醇溶液)；3.浸泡24h，超声0.5h，重复三次；4.提取完后布氏漏斗减压抽滤，滤液50℃旋蒸至无醇味。
【纯化】1.将旋蒸后浓缩的提取液置于量筒内，加入四倍量的无水乙醇进行醇沉；2.置于锥形瓶中，放冰箱静置过夜；3.静置后离心，取上清液，55℃旋蒸浓缩至不能继续浓缩为止，加水定容至50mL。
C：先提取四种有美白功效中药材的有效成分后发酵
【提取】1.粉碎各药材，过60目筛；2.四味药各取7.5g，共30g药粉置于500mL锥形瓶中；3.加入72mL去离子水，加入288mL乙醇(配成80％乙醇溶液)；4.浸泡24h，超声0.5h，重复三次；5.提取完后布氏漏斗减压抽滤，滤液50℃旋蒸至无醇味，加水至80mL。
【发酵】1.提取液转移至锥形瓶，在超净台中加入4.80mL毕赤酵母KM71，加入1.696mL甲醇；2.空气摇床恒温30℃发酵，24h后加入0.848mL甲醇再发酵12h。
【纯化】1.将发酵后的提取液转移至量筒，加入四倍量的无水乙醇进行醇沉；2.转移至锥形瓶，冰箱静置过夜；3.静置后离心，取上清液，55℃旋蒸浓缩至不能继续浓缩为止，加水定容至50mL。
四白提取物发酵增效验证实验
四白提取物对酪氨酸酶的抑制实验
如果黑素在皮肤表皮层内均匀过量沉积，那么肤色就会变黑；如果黑素局部过量沉积，那么就会形成雀斑，黄褐斑。酪氨酸酶可以催化黑素合成过程的多个反应，所以它是黑素生成的关键酶和限速酶。所以酪氨酸酶的抑制率可以作为评判美白功效强弱的标准。
实验中试剂的配制及样品预处理：
①磷酸缓冲液配置：称取8.8g Na2HPO4·12H2O，4.0g NaH2PO4·2H2O溶于800mL蒸馏水中，调pH至6.8，转移至1L容量瓶中并定容至1L。
②0.1moL/L盐酸溶液：量取盐酸溶液0.862mL，蒸馏水定容至100mL。
③0.05％L-酪氨酸溶液：称取0.1g L-酪氨酸，先溶于70mL 0.1moL/L的盐酸溶液，再加入130mL pH 6.8的PBS磷酸缓冲液，共200mL。
④酪氨酸酶溶液：取酶活力为25000U的部分酪氨酸酶粉末，溶于适量PBS缓冲液中并混匀，制成酶活力为200U/mL的酪氨酸酶溶液。
⑤待测样品液配制：将四白溶液用PBS缓冲液(pH＝6.8)分别稀释至0.005g/mL，0.010g/mL，0.015g/mL，0.020g/mL，0.025g/mL，0.030g/mL。
根据样品数量，针对每个浓度的样品都进行如下实验，实验操作步骤如下：
①将4mL EP管按A、B、C、D(做3个平行样)进行分组并标记好，放入试管架。
②打开水浴锅，将温度设定为37℃。
③B、D组按照表1将试剂添加到EP管中，A、C组按表1将除L-酪氨酸外其他三种试剂添加到EP管中，混合摇匀。
④待水浴锅温度稳定为37℃后，将试管架置于水浴锅中，恒温10min。
⑤每隔3分钟，往A、C组加入L-酪氨酸。
⑥待A、C组反应40min后，用紫外-可见分光光度计在波长为475nm处测定吸光值。
以测得的各组吸光值计算酪氨酸酶抑制率。
A为空白样品有酶体系吸光值；B为空白样品无酶体系吸光值；C为样品组有酶体系吸光值；D为样品组无酶体系吸光值。
表1反应液组成
图1为等浓度梯度下，四白溶液的不发酵提取产物、发酵后提取产物、提取后发酵产物对酪氨酸酶的抑制率曲线图。四白混合提取产物中，三种提取工艺产物对酪氨酸酶的抑制率均随着浓度的增加而增大。在提取液浓度为0.02g/mL以前，发酵对于四白提取液有一定的酪氨酸酶活性抑制的增效效果，且提取后发酵较发酵后提取效果稍好一些。到了0.02g/mL以后，发酵对于提取液的增效没有提取液本身效果好，且发酵后提取和提取后发酵没有太大的差异。故可推测：低浓度时(指0.02g/mL以下)，发酵对于提取液有一定的增效作用。
用本实验提取物与市售美白剂比较，按市售美白剂厂家的建议用量设置浓度梯度，VB3设置的质量浓度分数分别是：0.2％，0.9％，1.6％，2.3％，3％；α-熊果苷设的质量浓度分数分别是：1.0％，1.5％，2.0％，2.5％，3.0％；传明酸设的质量浓度分数分别是：0.5％，0.875％，1.25％，1.625％，2.0％。结果：由图2可得，厂家给的建议用量是平台值，故会有上下波动的现象。传明酸在建议用量对酪氨酸酶的抑制率在15.01％附近波动，VB3的在21.25％附近波动，α-熊果苷的在97.69％附近波动。
故可得出结论：发酵后提取(浓度为0.005g/mL至0.03g/mL)、提取后发酵(浓度为0.005g/mL至0.03g/mL)和四白仅提取(浓度为0.01g/mL至0.03g/mL)对酪氨酸酶的抑制率均超过了传统美白剂维生素VB3和传明酸在建议用量时的抑制率。
其中，发酵后提取(浓度为0.03g/mL)和仅提取(浓度为0.03g/mL)对酪氨酸酶的抑制率与传统美白剂α-熊果苷(1.0％-3.0％)的抑制率相近。
四白提取物对B16黑色素瘤细胞黑色素含量的抑制实验
细胞毒性：
样品对B16细胞毒性测定采用MTT法检测供试物对B16-F10细胞存活率的影响。取指数生长期的细胞，用质量分数0.25％胰蛋白酶-EDTA消化并吹打均匀，将细胞按2×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔200μL，于37℃，质量分数5％CO2的培养箱中培养过夜。
弃去上清液，加入含不同浓度供试物的培养液200μL，每个浓度做3个复孔，孵育24h。用MTT法检测细胞活力，用酶标仪测定在490nm处的吸光度(OD值)，计算细胞存活率：
等浓度梯度下，四白发酵后提取、仅提取和提取后发酵对B16细胞的细胞毒性作用结果如图3所示。细胞经受试药物作用后，可能会引起细胞生长抑制甚至是细胞死亡，或是产生细胞增殖促进效果。当药物作用于细胞24h后细胞存活率≥60％，则视为细胞毒性小或是无较大细胞毒性。由图3可知，发酵后提取和提取后发酵在0.005g/mL至0.03g/mL时，细胞存活率均在60％以上，且均在80％以上，可视作细胞毒性较小；仅提取在0.005g/mL至0.02g/mL时，细胞存活率在60％，而在0.02g/mL至0.03g/mL时细胞存活率在60％以下，且在0.005g/mL至0.03g/mL时细胞存活率一直低于发酵后提取和提取后发酵，故可推测得知：发酵对于细胞有一定的减毒作用，且细胞毒性十分小。
细胞黑色素生成抑制：
细胞培养：检测样品对B16细胞黑色素生成的影响。取指数生长期的细胞，用质量分数0.25％胰蛋白酶-EDTA消化并吹打均匀，将细胞按1×105个/mL的密度接种于96孔板，于37℃、质量分数5％CO2环境中培养过夜。
加样：弃去上清液，加入含不同质量浓度供试物的培养液200μL，以不加药物孵育为空白组，每组3个复孔，在质量分数5％CO2、37℃环境中孵育24h。
测定细胞内黑色素含量：将孔板中培养基弃去，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次后，加入100μL含质量分数10％DMSO的NaOH溶液(1moL/L)，置于90℃下恒温1h，至细胞块完全溶解。置于酶标仪中，于450nm下测吸光值。按下式计算出黑色素相对含量。
等浓度梯度下，四白发酵后提取、仅提取和提取后发酵对B16细胞的黑色素生成抑制作用结果如图4所示。由图4可知，在等浓度梯度0.005g/mL至0.03g/mL中，发酵后提取、仅提取和提取后发酵的B16细胞黑色素抑制率均在18％附近波动。在浓度0.02g/mL时提取后发酵较仅提取和发酵后提取的效果都要好，且黑色素抑制率超过20％；在0.015g/mL和0.03g/mL时仅提取较发酵后提取和提取后发酵的效果稍好一些。总体而言，四白发酵后提取、仅提取和提取后发酵对B16细胞的黑色素生成抑制作用的差距不是特别的大，结合细胞毒性实验结果可得知，四白发酵后提取和提取后发酵较其同等浓度的四白仅提取的提取液而言，功效差异不大而安全性更高。
四白提取物的对透明质酸酶的抑制实验
因为透明质酸酶为I型过敏反应参与者，所以透明质酸酶与炎症、过敏有着强相关性，研究发现各种肥大细胞可以释放组胺的药物，它能调节透明质酸酶的活性，而一些抗敏药物可以强抑制透明质酸酶的活性，因此抑制透明质酸酶的活性程度作为研究抗过敏作用的指标。
实验中试剂的配制及样品预处理：
①准备0.03g/mL的样品。
②透明质酸酶：500U/mL，1.5mL，用醋酸缓冲液做溶剂。
③醋酸缓冲液(pH 5.6)：在合适的容器中加入0.353g乙酸，加入800mL蒸馏水，加入7.719g乙酸钠(无水)。使用HCL或NaOH将溶液调节至5.6，加入蒸馏水直至体积为1升。
④透明质酸钠(0.4mg/mL)：准确称量1.2mg(0.0012g)，加入3mL醋酸缓冲液。
⑤2.5mmoL/L CaCL2：准确称量0.0022g无水氯化钙，加8mL水(用10mL试管装)。
⑥5.0moL/L的NaOH溶液：准确称量1.6g，加水8mL。
⑦1.25moL/L碳酸钠：准确称量6.6244g，加水50mL。
⑧乙酰丙酮溶液：取乙酰丙酮2mL，溶于50mL 1.25moL/L碳酸钠溶液中(即直接取2mL乙酰丙酮加入⑦)。
⑨EhrLich试剂：1.6g对二甲氨基苯甲醛(P-DAB)溶于30mL浓盐酸和30mL无水乙醇中。
实验步骤：
用丙二醇将供试品原液稀释为生药浓度0.03g/mL的待测样液。取4支4mL试管，分别记为：A、B、C、D；按表2所示组成，准确量取所需溶液。然后在37℃水浴中反应20min；
向4支试管中分别加入2.5mmoL/L的CaCL2溶液0.025mL，继续在37℃水浴中反应20min；
向A、C试管中加入0.4m g/mL的透明质酸钠溶液0.125mL，向B、D试管中加入pH5.6醋酸缓冲溶液0.125mL，37℃水浴中反应20min后，在室温下放置10min；
向4支试管中分别加入去离子水1.0mL、5.0moL/L的NaOH溶液0.025mL、乙酰丙酮溶液0.125mL；沸水浴反应15min、冰水浴反应10min；室温放置10min；
4支试管中分别加入P-DAB(EhrLich试剂)0.25mL，充分震荡后加无水乙醇(3.3mL)0.95mL。室温放置30min后，用酶标仪测定其在530nm处的吸光度值。
表2抗过敏试验反应液组成
计算样品对透明质酸酶抑制率：
四白提取物的对透明质酸酶的抑制实验结果如图5所示，由图5可知，在等浓度梯度0.005g/mL至0.03g/mL之内，发酵后提取的透明质酸酶活性抑制率整体而言较仅提取和提取后发酵要好；而在0.015g/mL至0.025g/mL时提取后发酵较仅提取的透明质酸酶活性抑制率更好，仅提取在0.03g/mL也就是相对而言比较大的浓度下对透明质酸酶活性抑制效果才优于提取后发酵，但依旧是不如发酵后提取。故可推测：发酵对于四白提取液得到抗炎功效有一定的增效效果，且发酵后再进行提取增效效果更强。
四白提取物的鸡胚尿囊绒膜刺激性实验
实验原理：
绒毛尿囊膜(CAM)是一个呼吸性膜，包围在鸡胚周围。由于鸡胚尿囊膜表面血管丰富，可以看作个完整的生物体，本试验利用孵化的鸡胚中期绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将一定量透明受试物直接与鸡胚尿囊膜接触，记录作用规定时间(5分钟)内CAM各种毒性效应(出血、凝血或血管融解)出现的时间，给予评分，计算数学平均值用于评估受试物的眼刺激性。
实验中试剂的配制及样品预处理：
①0.9％生理盐水：称9g NaCL用少量蒸馏水溶解并转移至1L的容量瓶中，多次用蒸馏水洗涤小烧杯内壁并转移至容量瓶，定容至1L，供阴性对照组加样。
②0.1moL/L氢氧化钠溶液：称0.4g NaOH用少量蒸馏水溶解并转移至100mL的容量瓶中，多次用蒸馏水洗涤小烧杯内壁并转移至容量瓶，定容至100mL，供阳性对照组加样。
③受试物(四白)的处理：用柠檬酸或柠檬酸钠调pH值至5.0-7.5，供各实验组加样。
实验步骤：
本受试物为透明的溶液，采用反应时间法进行测试。
将购买的已受精的鸡蛋在37.3℃、相对湿度为65％下，孵育过程中，孵化机内部自动翻转。气室朝上，孵化9天。
在鸡蛋孵化的第9日开始试验。实验开始前，先画出鸡蛋的气室，用牙科弯镊小心地剥去气室蛋壳部分，在蛋壳膜表面滴几滴生理盐水至蛋壳膜充分润湿，倾出生理盐水后，用镊子小心地除去蛋壳膜，在此过程中暴露的尿囊膜完整不能受到任何损伤。取0.3mL受试物均匀滴加在CAM表面，观察5min内每种毒性效应变化程度，按表3的标准给予评分(IS)。
表3刺激评分标准
采用反应时间法进行的试验计算式：(结果保留小数点后两位)
式中：
sec H(出血时间)——CAM膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒(s)；
sec L(血管融解时间)——CAM膜上观察到开始发生血管融解的平均时间，单位为秒(s)；
sec C(凝血时间)——CAM膜上观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒(s)。
根据计算的IS数值按照表4对受试物眼刺激性进行分类。
表4刺激评分法结果评价
四白提取物的鸡胚尿囊绒膜刺激性实验结果如图6～10所示，通过阴性对照和阳性对照组的对比，说明发酵后提取、仅提取和提取后发酵三种提取工艺在本实验最大浓度(浓度为0.03g/mL)均无刺激性，即其安全系数高。
本发明通过益生菌发酵中药，并通过调整合适的发酵时间来获得更有效的目标成分，这种做法符合新产品的新趋势。由于很多低毒性的中药也有很好的美白，保湿，抗炎等功效，而中药发酵可以进一步增强中药的药效或者降低它的毒性，且消费者更愿意相信天然成分更安全，故将发酵的中药运用于化妆品具有良好的前景。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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