一种紫锥菊提取物及其制备方法和在代谢组学中的应用
阅读说明：本技术 一种紫锥菊提取物及其制备方法和在代谢组学中的应用 (Echinacea purpurea extract, preparation method thereof and application thereof in metabonomics ) 是由 石达友 杨嘉丽 关钰澄 刘翠 郭世宁 于 2021-05-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种紫锥菊取物,由紫锥菊粉碎后通过加入体积比浓度为20-50％乙醇溶液进行两次以上的回流提取,然后将提取液合并后先浓缩后干燥得到。本发明还公开所述紫锥菊取物的制备方法及其在调节免疫抑制大鼠肠道内容物代谢组学和改变免疫抑制大鼠磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇号系统、抗坏血酸和醛糖酸盐代谢通路领域的应用。本发明具有以下有益效果：紫锥菊提取物具有调节免疫抑制大鼠肠道菌群代谢组学的作用,经动物试验证明,紫锥菊提取物能提高生长性能,增强免疫细胞活性,通过改变磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇号系统、抗坏血酸和醛糖酸盐代谢通路调节免疫系统。(The invention discloses an echinacea extract, which is prepared by crushing echinacea, adding 20-50% ethanol solution with volume ratio concentration for reflux extraction for more than two times, then combining the extracting solutions, concentrating and drying. The invention also discloses a preparation method of the echinacea purpurea extract and application of the echinacea purpurea extract in the fields of regulating the metabonomics of intestinal contents of immunosuppressed rats and changing the metabolic pathways of phosphoinositides, phosphatidylinositol number systems, ascorbic acid and aldonate of the immunosuppressed rats. The invention has the following beneficial effects: the echinacea purpurea extract has the function of regulating the metabonomics of intestinal flora of immunosuppressed rats, and animal experiments prove that the echinacea purpurea extract can improve the growth performance and enhance the activity of immunocytes, and can regulate the immune system by changing the metabolism of phosphoinositide, the number system of phosphatidylinositol and the metabolic pathways of ascorbic acid and aldonate.)
技术领域
本发明涉及天然药物化学领域，具体地，是一种紫锥菊提取物及其制备方法和在代谢组学中的应用，特别是在改变免疫抑制大鼠肠道菌群代谢通路的应用。
背景技术
肠道菌群是人类健康的重要环境因素，在机体代谢、免疫、发展和行为方面具有进化保护作用。在哺乳动物中，宿主-微生物的共生作用主要发生在粘膜表面，最重要的是肠道粘膜。肠道中有大量的共生微生物，它们的数量是宿主体细胞的10倍，具有多种代谢和保护功能。免疫系统是由微生物控制的，肠道菌群调节碳水化合物、脂类和氨基酸的代谢，在维持机体健康与代谢疾病中发挥重要作用，菌群失衡必然造成代谢异常。
紫锥菊的应用历史悠久，最初外敷治疗伤口、烧伤、昆虫叮咬、牙龈疼痛和咽喉感染，内服治疗疼痛、咳嗽、胃痉挛和蛇咬伤。紫锥菊因具有免疫活性、抗炎活性、抗氧化活性、抗病毒及抗肿瘤活性，受到国内外的极大关注。紫锥菊含有的主要活性物质为多糖和糖蛋白、咖啡酸衍生及烷基酰胺类化合物等，在免疫调节和抗炎等方面发挥重要作用。
现治疗疾病大多采取服用一定剂量的传统西药，但是存在一定的安全隐患，包括耐药性和药物残留。近年来采用中药调节机体免疫力的研究越来越引起人们的注意，但紫锥菊提取物改变肠道内容物代谢方面研究的未见有报道。
发明内容
本发明的第一目的是针对以上所述现有技术存在的不足，提供一种紫锥菊提取物，其要解决的技术问题是克服现有化学药对疾病治疗效果不佳和安全隐患。本发明的第二目的是提供上述紫锥菊提取物的制备方法。本发明的第三目的是提供所述紫锥菊提取物在调节免疫抑制大鼠肠道内容物代谢组学的应用。
为了实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现。
一种紫锥菊取物，由紫锥菊粉碎后通过加入体积比浓度为20-50％乙醇溶液进行两次以上的回流提取，然后将提取液合并后先浓缩后干燥得到。
一种紫锥菊取物的制备方法，其包括的步骤如下：
(1)取紫锥菊粉碎，过50-80目筛；
(2)将步骤(1)得到的紫锥菊粗粉加入体积比浓度为20-50％乙醇溶液，加热回流提取1-3次，第一次回流乙醇溶液添加量为紫锥菊粗粉体积的12-18倍，第二次回流乙醇溶液添加量为紫锥菊粗粉体积的6-10倍，每次回流提取的时间为20-40分钟；
(3)将步骤(2)所得的各次回流所得的提取液合并，滤液减压浓缩至相对密度为1.15～1.20(75～80℃)的清膏，80℃以下真空干燥，粉碎。
优选的，(2)将步骤(1)得到的紫锥菊粗粉加入体积比浓度为30％乙醇溶液，加热回流提取2次，第一次回流乙醇溶液添加量为紫锥菊粗粉体积的15倍，第二次回流乙醇溶液添加量为紫锥菊粗粉体积的8倍，每次回流提取的时间为30分钟。回流加热温度为100℃左右。
上述紫锥菊取物在调节免疫抑制大鼠肠道内容物代谢组学的应用。使用时所述紫锥菊取物的份数是以中药材生药重量计算，以g为单位。该紫锥菊取物以1g/kg·BW灌胃大鼠。
其中，免疫抑制由环磷酰胺造成。
所述紫锥菊提取物能增加免疫抑制大鼠肠道内容物葡萄糖、2-羟异丁酸、4-羟基苯乙酸、3,4二羟基苯基丁酸、对甲酚、苯醋酸、乙醇酸、4-羟基吡啶、棕榈酸、硬脂酸代谢物水平，减少肌醇、丝氨酸、假尿嘧啶核苷、脯氨酸、次黄嘌呤、苏氨酸、甘氨酸、尿嘧啶、焦谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、乳清酸、组氨酸、肌酐、尿酸、氨基乙醇、3-羟丁酸、柠檬酸、油酸、4-羟脯氨酸、乳酸、氨基丙二酸、黄嘌呤、亚油酸、4-羟基苯乙醇、3-羟丙酸、半胱氨酸、γ-氨基丁酸、氨基乙酸、谷氨酸代谢物水平。
所述紫锥菊提取物能改变免疫抑制大鼠磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇号系统、抗坏血酸和醛糖酸盐代谢通路领域的药物应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：紫锥菊提取物具有调节免疫抑制大鼠肠道菌群代谢组学的作用，经动物试验证明，紫锥菊提取物能提高生长性能，增强免疫细胞活性，通过改变磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇号系统、抗坏血酸和醛糖酸盐代谢通路调节免疫系统。
附图说明
图1为IS组与EE-IS组样本PLS-DA和OPLS-DA得分图；
图2为IS组和EE-IS组肠道内容物差异性代谢物；
图3为IS组和EE-IS组肠道内容物代谢通路分析图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明技术方案，而不用于限定本发明的范围。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种紫锥菊提取物的制备方法，其包括的步骤如下：取紫锥菊1000g，粉碎过65目筛，得到的紫锥菊粗粉；在紫锥菊粗粉钟加入体积比浓度为30％乙醇溶液，回流提取2次，第一次加入15L，第二次8L，每次30分钟；所得的两次提取液合并，滤液减压浓缩至相对密度为1.15～1.20(75～80℃)的清膏，80℃以下真空干燥，粉碎，即得。
实施例2
紫锥菊提取物对免疫抑制大鼠生长体况的影响
试验分组与处理
SD大鼠，30只，适应期3天以上，随机平均分为3组，分别为空白对照组(NC组)、模型组(IS组)和紫锥菊提取物组(EE-IS组)，IS组和EE-IS组以40mg/kg环磷酰胺，隔日灌胃给药，共3次，NC组以等量生理盐灌胃。造模结束后，EE-IS组每日以1g/kg紫锥菊提取物灌胃，其余组给予等量生理盐水，饲养于华南农业大学实验动物中心，试验期间饲喂大鼠全价饲料，自由采食，室温控制在20℃～25℃，相对湿度为30％～70％，自然光照。
样品采集
在给予紫锥菊提取物后的第14天，随机抽取的6只大鼠，记录体重，并采取其胸腺和脾脏，称量并记录，计算体重和免疫器官指数。
检测与分析
观察临床症状，计算体重和免疫脏器指数。试验数据采用SPSS22.0软件统计分析，结果以“平均数±标准差”(X±SD)表示，两组数据比较通过独立样本T检验进行分析，多组数据比较采用单因素ANOVA分析各组间差异性，通过最小显著差数法(LSD)和Duncan’s新复极差检验法进行各组间的多重比较。
临床观察
免疫抑制导致大鼠精神沉郁、毛色暗淡、口鼻分泌物增加，活动力减少，甚至出现死亡。紫锥菊提取物能改善临床症状，减少死亡率。
体重和免疫脏器指数
如表1，IS组体重比NC组显著降低(P<0.05)，IS组和EE-IS组体重差异不显著(P>0.05)；IS组比NC组脾脏指数显著升高(P<0.05)，IS组和EE-IS组脾脏指数差异不显著(P>0.05)；三组胸腺指数差异不显著(P>0.05)。
表1各组大鼠的体重和免疫器官指数
同一天数据不同肩标字母表示彼此间差异显著(P<0.05)；同一天数据不标肩标表示差异不显著(P>0.05)。
实施例3
紫锥菊提取物对免疫抑制大鼠血清生化和细胞因子的影响
试验分组与处理同实施例2。
样品采集
在给予紫锥菊提取物后的第14天，每组随机抽取6只大鼠采样，采样前禁食12小时。在采血之前记录每只大鼠的重量，从腹主动脉抽取2mL血液，3000rpm/min离心10min，将所得血清用于测量血清生化和细胞因子浓度。
检测与分析
全自动生化分析检测血清谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(T-Bil)、总蛋白(TP)、尿素氮(UREA)、碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、血糖(GLU)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(CREA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)水平。
血清生化结果见下表2，与NC组相比，IS组血清T-Bil显著升高(P<0.05)，TP、ALP、AST、TG和ALB显著降低(P<0.05)，其余血清生化指标差异不显著(P>0.05)；与IS组对比，EE-IS组血清TP和ALB显著升高(P<0.05)，其余血清生化指标差异不显著(P>0.05)。
表2各组大鼠血液生化指标(n＝6)
同一天数据不同肩标字母表示彼此间差异显著(P<0.05)；同一天数据不标肩标表示差异不显著(P>0.05)。
血清TP包括ALB和GLO，ALB具有增强机体免疫力作用，其减少可归咎于合成减少、蛋白量摄入量减少和丢失增加。肝脏是合成蛋白质和血浆ALB的重要器官，肝脏功能障碍时可导致血清ALB含量减少。IS组比NC组的血清T-Bil水平显著升高提示免疫抑制可能影响到肝脏功能，免疫蛋白合成减少。EE-IS组相比IS组的血清TP和ALB显著升高，表示紫锥菊提取物可提高免疫抑制大鼠免疫力。
采用酶联免疫试剂盒测定血清中细胞因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的浓度。
血清中细胞因子结果见表3，三组血清IL-6差异不显著(P>0.05)，但EE-IS组相对NC组和IS组增加；IS组血清IFN-γ比NC组显著降低(P<0.05)，EE-IS组血清IFN-γ比IS组增加，但差异不显著(P>0.05)；IS组血清TNF-α比NC组降低，EE-IS组血清TNF-α比IS组增加，但差异不显著(P>0.05)。
表3各组大鼠血清细胞因子
同一天数据不同肩标字母表示彼此间差异显著(P<0.05)；同一天数据不标肩标表示差异不显著(P>0.05)。
IL-6参与B淋巴细胞、T淋巴细胞和细胞毒性T细胞等增殖和分化，在炎性反应中发挥重要作用。IFN-γ属于Ⅱ型干扰素，是由活化的T细胞产生的可溶性糖蛋白，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。TNF-α是巨噬细胞产生的细胞因子，在体外可对部分肿瘤细胞产生直接的细胞毒性，在体内导致肿瘤出血性坏死，而正常组织则不受影响。EE-IS组血IL-6、IFN-γ和TNF-α比IS组增加，提示紫锥菊提取物可以促进IL-6、IFN-γ和TNF-α的分泌，增强免疫细胞活性，改善机体免疫抑制状态。
实施例4
紫锥菊提取物对免疫抑制大鼠肠道内容物代谢组学的影响
试验分组与处理同实施例2。
样品采集
在给予紫锥菊提取物后第14天随机每组取6只大鼠，在无菌状态下采集盲肠部位的肠道内容物样本，然后按0.5g/管分装到2mL离心管，-80℃保存。
检测与分析
称取40mg置于冷冻的肠道内容物，加入500μL含内标10μg/mL正亮氨酸的预冷水，超声冰水浴处理10min，-20℃静置过夜；4℃，14000g离心15min，取上清，重复提取残渣一次，将两次得到的上清液合并，从中取100μL上清提取液，在氮气下加50μg/mL正缬氨酸10μL挥干，将30μL的甲氧胺盐酸盐吡啶加入干燥物中，37℃孵育90min后再加入30μL含1％TMCS的BSTFA，涡旋振荡30s，之后进行衍生。利用气相色谱-质谱联用仪进行检测分析。
肠道内容物多维统计分析
将以上得到的数据文件导入SIMCA 14.1进行多维统计分析如主成分分析(Principal component analysis，PCA)、偏最小二乘方-判别分析(Partial leastsquares discriminant analysis，PLS-DA)和正交过滤偏最小二乘方-判别分析(Orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)。
结果见图1。IS组和EE-IS组的PLS-DA模型参数为R2X＝0.462，R2Y＝0.924，Q2＝0.726，置换检验表明当前模型质量可靠，OPLS-DA模型参数为R2X＝0.829，R2Y＝1，Q2＝0.844。
肠道内容物差异性代谢物
采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(阈值＞1)结合单维检验的p值(阈值＜0.05)寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索标准物质数据库，包括色谱保留时间和质谱。
结果见图2。筛选并定性到38个差异性代谢物，其中28个物质下降，10个物质上升。与IS组相比，EE-IS组大鼠肠道内容物中葡萄糖、2-羟异丁酸、4-羟基苯乙酸、3,4二羟基苯基丁酸、对甲酚、苯醋酸、乙醇酸、4-羟基吡啶、棕榈酸、硬脂酸水平上升，肌醇、丝氨酸、假尿嘧啶核苷、脯氨酸、次黄嘌呤、苏氨酸、甘氨酸、尿嘧啶、焦谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸、乳清酸、组氨酸、肌酐、尿酸、氨基乙醇、3-羟丁酸、柠檬酸、油酸、4-羟脯氨酸、乳酸、氨基丙二酸、黄嘌呤、亚油酸、4-羟基苯乙醇、3-羟丙酸、半胱氨酸、γ-氨基丁酸、氨基乙酸、谷氨酸水平下降。
肠道内容物代谢通路分析
纵坐标p值越小表示分类与该途径代谢物相关的可能性越大，而由于本处纵坐标用其-log(p)表示，所以p越小就表示-log(p)越大，因此，一个点如果纵坐标越大即该途径与组间差异的关联越大，颜色越红关联越大；横坐标(Pathway impact value)值基于路径拓扑结构分析，圆圈越大该途径与差异的关联越大。
结果见图3以及表4。IS组和EE-IS组的代谢通路异常主要包括磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇号系统、抗坏血酸和醛糖酸盐代谢。这个三个代谢通路均涉及肌醇，而EE-IS组肌醇含量下降，提示紫锥菊提取物降低磷酸肌醇相关代谢，减少其介导的系列反应。
表4IS组和EE-IS组肠道内容物代谢途径比较结果
total表示该途径所含的代谢物总数，hits表示该途径含有差异性代谢物数，-log(p)表示纵坐标值，表明该代谢途径与两组差异的相关性大小；Impact表示横坐标值，表明该代谢途径对两组差异贡献值的大小(即重要性)。
上述结果表明，紫锥菊提取物可提高免疫抑制大鼠生长性能，增强免疫细胞活性，通过改变磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇号系统、抗坏血酸和醛糖酸盐代谢通路调节免疫系统。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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