具体实施方式

鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例的一个方面提供了一种siRNA递送载体，其包括纳米囊泡以及负载于所述纳米囊泡内的siRNA，所述纳米囊泡由红细胞膜制得。

在一些较为具体的实施方案中，所述siRNA包括PDL1siRNA，且不限于此。

进一步的，所述siRNA的包封率为70％～90％，siRNA的载药率为1wt％～3wt％。

进一步的，所述纳米囊泡的粒径为100～400nm。

进一步的，所述纳米囊泡表面保留有红细胞膜功能分子。

进一步的，所述红细胞膜功能分子包括功能膜蛋白CD47，且不限于此。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的siRNA递送载体的制备方法，其包括：

将红细胞膜制备成纳米囊泡；

将siRNA与阳离子脂质体通过孵育的方式，制得siRNA/阳离子脂质体复合物；

以及，将所述siRNA/阳离子脂质体复合物负载于纳米囊泡内，获得siRNA递送载体。

在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将siRNA与阳离子脂质体共同孵育 20～30min，制得所述siRNA/阳离子脂质体复合物。

在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将所述siRNA/阳离子脂质体复合物与纳米囊泡超声处理1.0～15min，获得所述siRNA递送载体。

在一些较为具体的实施方案中，所述siRNA、阳离子脂质体与纳米囊泡的质量比为1∶ (3～5)∶(30～160)。

在一些较为具体的实施方案中，所述红细胞膜是采用低渗处理法处理红细胞形成的。

进一步的，所述红细胞膜的制备方法具体包括：将红细胞置于PBS溶液中震荡孵育1～3h，之后于12000～14000rpm离心10～20min，获得所述红细胞膜。

在一些较为具体的实施方案中，所述纳米囊泡是采用薄膜水化法和挤压过膜的方式处理所述红细胞膜形成的。

进一步的，所述纳米囊泡的制备方法具体包括：将红细胞膜进行冷冻干燥，采用薄膜水化法和超声处理，再挤压过膜10～30次，获得所述纳米囊泡。

进一步的，所述薄膜水化法具体包括：将冷冻干燥所获红细胞膜分散于水中，再与无水乙醇、氯仿混合。

进一步的，所述超声处理使用超声破碎仪，功率为20～60W，频率为20～25KHz，超声时间为1～5min。

进一步的，所述挤压过膜采用脂质体挤出装置(脂质体挤出器)，采用的滤膜是孔径为 100～400nm的聚碳酸酯膜。

在一些更为具体的实施方案中，所述siRNA递送载体的制备方法具体包括：

将红细胞在低渗条件下制备成红细胞膜；

将红细胞膜通过薄膜水化法制备成水溶液中分散性更好的红细胞膜；

将红细胞膜通过挤压过膜制备成纳米囊泡；

利用阳离子脂质体与小干扰RNA孵育，使小干扰RNA通过静电吸附作用将小干扰RNA 负载至阳离子脂质体表面；

将小干扰RNA/阳离子脂质体复合物与纳米囊泡在缓冲液中超声、孵育，使小干扰RNA 通过阳离子脂质体负载到红纳米囊泡内，即siRNA递送载体。

作为优选方案，所述制备方法包括：将红细胞置于0.25×PBS中，冰上震荡孵育1～3h， 12000～14000rpm离心10～20min收集红细胞膜。

作为优选方案，所述红细胞膜可置于冷冻干燥机中冷冻干燥2～3天。

作为优选方案，所述冷冻干燥后红细胞膜可于-80℃长期储存。

作为优选方案，所述制备方法包括：将红细胞膜水溶液、无水乙醇和氯仿体积比为1∶5∶10，搅拌，过滤，旋蒸，干燥，加水超声分散。

作为优选方案，搅拌前，红细胞膜水溶液应置于超声波中处理5～30min。

作为优选方案，所述超声处理包括超声波浴和超声破碎仪，但不限于此。

作为优选方案所述制备方法包括：使用Avanti miniextruder脂质体挤出器将红细胞膜挤压通过聚碳酸酯膜10～30次，制备得到纳米囊泡。

作为优选方案，挤压前，红细胞膜应置于超声波中处理5～10min。

作为优选方案，所述超声处理包括超声波浴和超声破碎仪，但不限于此。

作为优选方案，所述聚碳酸酯膜孔径包括100～400nm，但不限于此。

作为优选方案，所述siRNA递送载体具有均一粒径，且大小可控，100～400nm。

进一步的，所述纳米囊泡保留红细胞膜上一些蛋白分子，如CD47分子。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体，其包括纳米囊泡，负载于所述纳米囊泡内的siRNA，以及负载于所述纳米囊泡表面的胆固醇修饰的核酸适配体，所述纳米囊泡由红细胞膜制得。

进一步的，所述siRNA包括但不限于本发明提供的PDL1siRNA。

进一步的，所述siRNA的包封率为70％～90％，siRNA的载药率为1wt％～3wt％。

进一步的，所述纳米囊泡的粒径为100～400nm。

进一步的，所述纳米囊泡表面保留有红细胞膜功能分子，所述红细胞膜功能分子包括功能膜蛋白CD47。

进一步的，所述核酸适配体具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明中基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体的示意图如图1所示。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体的制备方法，其包括：

将红细胞膜制备成纳米囊泡；

将siRNA与阳离子脂质体通过孵育的方式，制得siRNA/阳离子脂质体复合物；

将所述siRNA/阳离子脂质体复合物与纳米囊泡进行负载，获得siRNA递送载体；以及，将胆固醇修饰的核酸适配体与所述siRNA递送载体通过孵育进行负载，获得基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体。

在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将siRNA与阳离子脂质体孵育20～30min，制得所述siRNA/阳离子脂质体复合物。

在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将所述siRNA/阳离子脂质体复合物与纳米囊泡超声处理1.0～15min，获得siRNA递送载体。

在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将胆固醇修饰的核酸适配体与所述 siRNA递送载体共同孵育0.5～1.0h，获得基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体。

在一些较为具体的实施方案中，所述siRNA、阳离子脂质体与纳米囊泡的质量比为1∶ (3～5)∶(30～160)。

在一些较为具体的实施方案中，所述红细胞膜是采用低渗处理法处理红细胞形成的。

进一步的，所述红细胞膜的制备方法具体包括：将红细胞置于PBS溶液中震荡孵育1～3h，之后于12000～14000rpm离心10～20min，获得所述红细胞膜。

在一些较为具体的实施方案中，所述纳米囊泡是采用薄膜水化法和挤压过膜的方式处理所述红细胞膜形成的。

进一步的，所述纳米囊泡的制备方法具体包括：将红细胞膜进行冷冻干燥，采用薄膜水化法和超声处理，再挤压过膜10～30次，获得所述纳米囊泡。

进一步的，所述薄膜水化法具体包括：将冷冻干燥所获红细胞膜分散于水中，再与无水乙醇、氯仿混合。

进一步的，所述超声处理使用超声破碎仪，功率为20～60W，频率20～25KHz，超声时间 1～5min。

进一步的，所述挤压过膜采用脂质体挤出器，使用的滤膜采用孔径为100～400nm的聚碳酸酯膜。

在一些更为具体的实施方案中，所述基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体的制备方法具体包括：

将红细胞在低渗条件下制备成红细胞膜；

将红细胞膜通过薄膜水化法制备成水溶液中分散性更好的红细胞膜；

将红细胞膜通过挤压过膜制备成纳米囊泡；

利用阳离子脂质体与小干扰RNA孵育，使小干扰RNA通过静电吸附作用将小干扰RNA 负载至阳离子脂质体表面；

将小干扰RNA/阳离子脂质体复合物与纳米囊泡在缓冲液中超声、孵育，使小干扰RNA 通过阳离子脂质体负载到红纳米囊泡内，即siRNA递送载体；

将胆固醇修饰于核酸适配体末端获得胆固醇修饰的核酸适配体；

将胆固醇修饰的核酸适配体与siRNA递送载体孵育，获得基于核酸适配体靶向的siRNA 递送载体。

作为优选方案，所述制备方法包括：将siRNA加入HN buffer中，浓度为20～40μg/mL，将阳离子脂质体加入HN buffer中，浓度为80～160μg/mL，二者等体积混合，并孵育30min，制备siRNA/阳离子脂质体复合物。其中HN buffer为用DEPC配制的10Mm HEPES，150mM 氯化钠，pH为7.4的缓冲液。

作为优选方案，siRNA与阳离子脂质体的质量比为1∶4，但不限于此。

作为优选方案，所述阳离子脂质体与小干扰RNA的孵育温度为25～37℃。

进一步地，加入siRNA后应加入1～4μM的RNA酶抑制剂，以防止siRNA降解。

作为优选方案，所述制备方法包括：将纳米囊泡加入HN buffer中，浓度为0.8～1.6mg/mL，将其与siRNA/阳离子脂质体复合物等体积混合，超声1～5min，孵育30min。

作为优选方案之一，阳离子脂质体与纳米囊泡的质量比为1∶20，但不限于此。

作为优选方案，所述制备方法包括：使用Avanti miniextruder脂质体挤出器将红细胞膜挤压通过聚碳酸酯膜10～30次，制备得到纳米囊泡。

作为优选方案，挤压前红细胞膜应置于超声波中处理1～5min。

作为优选方案，所述超声处理包括超声波浴和超声破碎仪，但不限于此。

作为优选方案，所述聚碳酸酯膜孔径包括100～400nm，但不限于此。

作为优选方案，所述制备方法包括：将胆固醇修饰的核酸适配体与siRNA递送载体共孵育，制得基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体。

作为优选方案，胆固醇修饰的核酸适配体的浓度为2～5μM，但不限于此。

进一步地，所述胆固醇修饰于核酸适配体末端的孵育温度为25～37℃。

作为优选方案之一，所述基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体中siRNA包封率可达 70％～90％。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的siRNA递送载体或基于核酸适配体靶向的 siRNA递送载体在制备抗肿瘤药物领域中的应用。

本发明实施例还提供了前述的基于核酸适配体靶向的小干扰RNA递送载体于制备用于抑制肿瘤细胞的免疫逃逸功能的产品中的用途。

进一步的，所述的用途包括：利用肿瘤靶向性的纳米囊泡载体负载PDL1siRNA，对肿瘤细胞的免疫逃逸功能进行抑制，从而促进T细胞杀伤肿瘤。进一步的，基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体在治疗时的siRNA浓度为20～40μg/mL。

藉由上述技术方案，本发明利用天然生物材料红细胞膜，采用简便、快捷的挤压过膜方法，大量、低成本的制备粒径均一、可控的纳米囊泡载体。所述方法制备的纳米囊泡生物相容性好，同时保留有红细胞上功能膜蛋白CD47，能够有效逃逸体内循环系统清除，延长血液循环时间。利用阳离子脂质体介导的小干扰RNA负载方法，负载效率高、操作简单快捷。利用胆固醇介导的方式对纳米囊泡进行核酸适配体的修饰，使其具备肿瘤靶向性。该方式简便、快捷、高效，利于工艺放大。所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体具有对肿瘤细胞的特异性，并能够沉默免疫逃逸相关基因PDL1的表达，有效抑制肿瘤细胞的免疫逃逸能力，提高T细胞对肿瘤细胞的有效杀伤。

下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。

实施例1

(1)将红细胞加入1×PBS中，800g，4℃离心5min，收集红细胞，重复两次。然后将红细胞加入0.25×PBS中，冰上震荡孵育1h，14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜。再加入0.25×PBS，冰上震荡孵育1h，14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜。然后将红细胞膜水溶液、无水乙醇和氯仿体积比为1∶5∶10，搅拌，过滤，旋蒸，干燥，加水超声分散，制备得水分散性更好的红细胞膜；其中，红细胞与0.25×PBS的体积比为1∶9。

(2)将收集的红细胞膜置于超声波破碎仪中超声破碎，条件为60W功率，25KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声1min。然后通过Avantiminiextruder脂质体挤出器，装备200nm孔径聚碳酸酯膜，将薄膜水化法处理后的红细胞膜过膜挤压30次，获得纳米囊泡。

本实施例所获纳米囊泡可用于siRNA负载及靶向修饰等。

实施例2

(1)将红细胞加入1×PBS中，800g，4℃离心5min，收集红细胞，重复两次。然后将红细胞加入0.25×PBS中，冰上震荡孵育过夜，14000rpm，4℃离心10min，收集红细胞膜。再加入0.25×PBS，冰上震荡孵育1h，12000rpm，4℃离心20min，收集红细胞膜。然后将红细胞膜水溶液、无水乙醇和氯仿体积比为1∶5∶10，搅拌，过滤，旋蒸，干燥，加水超声分散，制备得水分散性更好的红细胞膜。其中，红细胞和0.25×PBS的体积比为1∶9。

(2)将收集的红细胞膜置于超声波破碎仪中超声破碎，条件为20W功率，20KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声5min，然后使用Avantiminiextruder脂质体挤出器，装备200nm孔径聚碳酸酯膜，将薄膜水化法处理后的红细胞膜过膜挤压10次，获得纳米囊泡。

本实施例所获纳米囊泡可用于siRNA负载及靶向修饰等。

实施例3

将siRNA加入HN buffer中，浓度为20μg/mL，将阳离子脂质体加入HN buffer中，浓度为60μg/mL，二者等体积混合，并室温孵育30min，制备siRNA/阳离子脂质体复合物，然后将实施例1制备的纳米囊泡加入HN buffer中，浓度为0.6mg/mL，将其与siRNA/阳离子脂质体复合物等体积混合，条件为20W功率，20KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声2min，室温孵育30min，制得siRNA递送载体；最后加入胆固醇修饰的核酸适配体室温孵育30min，获得基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体(即适配体修饰后的靶向载药纳米载体，或者记为靶向纳米载体)。

其中，siRNA、阳离子脂质体和纳米囊泡的质量比为1∶3∶30，胆固醇修饰的核酸适配体终浓度为2μM。

本实施例所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体可用于免疫逃逸肿瘤细胞治疗。

实施例4

将siRNA加入HN buffer中，浓度为30μg/mL，将阳离子脂质体加入HN buffer中，浓度为120μg/mL，二者等体积混合，并室温孵育30min，制备siRNA/阳离子脂质体复合物，然后将实施例1制备的纳米囊泡加入HN buffer中，浓度为3mg/mL，将其与siRNA/阳离子脂质体复合物等体积混合，条件为20W功率，20KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声2min，室温孵育30min，制得siRNA递送载体；最后加入胆固醇修饰的核酸适配体室温孵育30min，获得基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体(即适配体修饰后的靶向载药纳米载体，或者记为靶向纳米载体)。

其中，siRNA、阳离子脂质体和纳米囊泡的质量比为1∶4∶100，胆固醇修饰的核酸适配体终浓度为2.5μM。

本实施例所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体可用于免疫逃逸肿瘤细胞治疗。

实施例5

将siRNA加入HN buffer中，浓度为40μg/mL，将阳离子脂质体加入HN buffer中，浓度为200μg/mL，二者等体积混合，并室温孵育30min，制备siRNA/阳离子脂质体复合物，然后将实施例1制备的纳米囊泡加入HN buffer中，浓度为6.4mg/mL，将其与siRNA/阳离子脂质体复合物等体积混合，条件为20W功率，20KHz频率，变幅杆型号Φ2，超声2min，室温孵育30min，制得siRNA递送载体；最后加入胆固醇修饰的核酸适配体室温孵育30min，获得基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体(即适配体修饰后的靶向载药纳米载体，或者记为靶向纳米载体)。

其中，siRNA、阳离子脂质体和纳米囊泡的质量比为1∶5∶160，胆固醇修饰的核酸适配体终浓度为5μM。

本实施例所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体可用于免疫逃逸肿瘤细胞治疗。

实施例6

(1)将实施例3所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体与肿瘤细胞孵育4h，对细胞进行药物递送，然后替换为完全培养基继续培养48h；其中，基于核酸适配体靶向的siRNA 递送载体中siRNA的浓度为20～40μg/mL；

(2)收集细胞利用TRIzol法提取细胞总RNA，对PDL1基因表达量进行实时定量PCR分析；

其中，具体方法为：将细胞用1mL TRIzol总RNA提取试剂于冰上消化5分钟，并吸入离心管中，静置5分钟后，加入200μL三氯甲烷并立刻涡旋15秒。然后室温静置10分钟，使液面充分分层。将样品放入离心机，4℃，12000转/分钟，离心15分钟；小心吸取上层清液约400μL，再加入500μL预冷的异丙醇，充分混合后放于-20℃沉淀20分钟；然后将样品放入离心机，4℃，12000rpm/min，离心15分钟，小心倒去上清液，再加入1mL DEPC配置的75％乙醇，充分混合后放入离心机，于4℃，7500rpm，离心5min，小心倒去上清液，并吸干管壁和管底部的液体保留沉淀，随后放入烘箱烘干。最后向烘干的沉淀中加入40μL DEPC处理水，55℃水浴加热15min，并于紫外分光光度计260nm处测量总RNA浓度；

利用反转录试剂盒，将提取的总RNA反转录成cDNA，取总RNA 500ng，按照反转录试剂盒说明加入各种试剂，混合均匀后于PCR仪上进行反转录PCR，程序为37℃，15min； 86℃，6s；4℃保存。

进行qPCR，将上一步的反转录产物用去离子水稀释5倍。将每组反转录产物分为PDL1 基因组和β-actin内参组。按照qPCR试剂盒说明，加入各种试剂。再分别向各组体系中加入对应的PDL1基因和β-actin基因的上、下游引物，最后加入2μL反转录产物作为PCR模板。混匀后放入qPCR仪进行qPCR。程序为95℃，10分钟Hold阶段；95℃，1min变性，60℃，1min退火延申，这两步作为一个循环共进行40循环；最后进入溶解曲线阶段。

采用ΔΔCt法计算PDL1基因的相对表达量。

(3)收集细胞，利用蛋白免疫印迹法，对细胞PDL1蛋白表达量进行分析。

其中，具体方法为：细胞分别加入50μL细胞裂解液进行裂解。裂解后的细胞碎片通过 14000g，10分钟离心去除。上清液加入BCA蛋白试剂盒进行蛋白浓度测定，通过酶标仪读取标准蛋白和样本蛋白吸收，并计算得出样本蛋白浓度。各组取30μg蛋白，加入LoadingBuffer后煮沸10分钟以充分变性待用。配制12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel， PAGE)和5％的浓缩胶，先将12％的PAGE灌入制胶槽，加入去离子水液封。待PAGE胶凝固后，吸干液封的去离子水，再加入5％的浓缩胶；

跑胶和转膜：PAGE胶制备完成后，放入电泳槽，上样后先在80V电压下将样品跑至浓缩胶分界面，再调100V电压，电泳1.5h。电泳结束后，取出PAGE胶待转膜。取PVDF膜，甲醇活化15秒后，将PVDF膜，PAGE胶叠放在转膜夹板中。用滤纸夹紧并放入转膜槽中进行转膜。由于转膜中温度过高，因此使用乙醇循环冷却装置为转膜过程降温。转膜电压为100V，时间1.5小时。

封闭和一抗的孵育：转膜结束后，用TBST轻轻清洗PVDF膜，然后加入丽春红染色。通过染色并根据标准蛋白Ladder的定位，剪出目的蛋白PDL1和内参β-actin条带的大概位置。将条带放入5％的脱脂奶粉中封闭2h，然后用TBST清洗未结合的脱脂奶粉。将清洗后的条带放入对应的PDL1一抗和β-actin一抗中，4℃孵育过夜。

二抗的孵育和显影：用TBST清洗一抗孵育后的条带，洗去未结合的一抗。将条带与二抗在室温孵育2小时后洗去未结合的二抗。清洗后的条带滴入ECL显影液后用凝胶成像系统成像。

实施例7

(1)将实施例3所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体肿瘤细胞孵育4h，对细胞进行药物递送，然后替换为完全培养基继续培养24h。然后与CD3/CD28激活的jurkat细胞共培养72h。

其中，纳米载体中siRNA的浓度为20μg/mL。

(2)收集细胞培养无上清，然后IL-2含量进行ELISA分析。

其中，具体方法为：将细胞培养液上清1000g/min离心10分钟，留上清备用。取出所用微孔板条，每孔添加300μL洗涤缓冲液，保持40秒后吸出。重复该过程两次，共洗涤3次。然后在每孔加入100μL不同浓度的标准样品或细胞培养上清，盖上胶条，37℃孵育2h。然后重复上述的冲洗操作。在每个孔加入100μL生物素结合抗体工作液，盖上新胶条，37℃孵育1h。然后重复上述的冲洗操作。在每个孔加入100μL链霉素-HRP工作液，盖上新胶条，37℃孵育30min。然后重复上述的冲洗操作。在每个孔加入100μL TMB底物，避光条件下， 37℃孵育15～20min。加入50μL终止液，使用设置为450nm的酶标仪在5分钟内检测每个孔的吸光度。

本实施例所介绍的为基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体在免疫逃逸肿瘤细胞治疗中的应用。

下面，通过几种项目性能测试展示上述各实施例所获纳米囊泡以及基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体的应用优势。

(1)利用蛋白免疫印迹法测试上述实施例1所获纳米囊泡的膜蛋白CD47的保留情况，结果可由图2表示，通过结果可知，纳米囊泡能够保留红细胞膜表面的CD47分子；

(2)通过流式细胞术和共聚焦荧光显微镜对适配体修饰后的上述实施例1所获纳米囊泡其肿瘤细胞特异性进行分析，其结果可通过图3和图4表示，经过DiO荧光修饰后的纳米囊泡，对其分别进行靶向性和非靶向修饰，并递送肿瘤细胞。非靶向组细胞的荧光强度低于靶向组，说明靶向性修饰能够使纳米囊泡具有肿瘤特异性；

(3)利用马尔文粒径仪测试上述实施例3所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体水动力学粒径和表面电位，结果可通过图5a-图5b表示，通过结果可以看出，纳米囊泡粒径均一，在100nm左右，表面电荷为负；

(4)利用透射电镜测试上述实施例3所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体的形貌，其结果可通过图6表示，按上述实施例中制备方法描述，能够制得粒径均一的100nm直径的纳米囊泡；

(5)通过WST试剂对上述实施例3所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体的细胞毒性进行测试。其结果可通过图7表示，如图所示，靶向载药纳米囊泡具有良好的生物相容性，较低的细胞毒性。

(6)通过测试和计算上述实施例3所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体的载药率。其结果可通过图8表示。如图所示，利用上述阳离子脂质体介导的药物负载方法和孵育的方式，其siRNA包封率可达70％～90％，siRNA的载药率为1wt％～3wt％。说明该方法具有较高的包封效率。

(7)通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术对上述实施例3所获基于核酸适配体靶向的 siRNA递送载体其肿瘤细胞特异性的药物递送能力进行分析，其结果可通过图9和10表示，基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体展现出了较良好的靶向递送能力。

(8)通过qPCR和蛋白免疫印迹法对上述实施例6所获siRNA递送载体其肿瘤细胞特异性的PDL1基因和蛋白特异性沉默的能力进行分析。其结果可通过图11和12表示。适配体修饰后的载药纳米囊泡展现出了较良好的基因和蛋白表达的沉默效果。

(9)通过ELISA对上述实施例7所获siRNA递送载体处理的肿瘤细胞其肿瘤免疫逃逸能力进行分析。其结果可通过图13表示。靶向载药纳米囊泡处理后的肿瘤细胞显示其肿瘤免疫逃逸能力得到抑制。

(10)通过流式细胞术对对照例3所述囊泡载体递送siRNA与实施例3所获基于核酸适配体靶向的siRNA递送载体进行对比分析。其结果可通过图14表示。囊泡载体单独递送siRNA效率低。

对照例1

一般情况下，常规方法获得囊泡类载体如外泌体等，需要大量培养细胞，收集大量细胞上清液，并需要超高速离心机长时间(16h左右)离心分离。且分离得到的外泌体大小不均。整个过程费时，费力，成本极高。因此限制了囊泡类载体在临床中的应用。

与对照例1相比，本发明实施例1和2所述纳米囊泡的制备方式简便快捷，所需设备小巧，价格低廉，同时能够大量、低成本制备得到。所制备纳米囊泡的粒径均一，大小可调控，且本身保留有红细胞膜功能蛋白，能够有效降低囊泡类载体的获取成本，提高质量，并易于大规模标准化、自动化生产。

对照例2

一般情况下，常规方法对囊泡类载体进行药物装载多采用点穿孔的方式。使用电穿孔进行siRNA药物装载需要特定的仪器设备进行操作。且在电穿孔的过程中，siRNA易形成不溶性聚集体，产生大量沉淀，使得siRNA装在效率很低。且电转染的方式单次转染的量有限，不利于扩大化制备。

与对照例2相比，本发明实施例3中所述阳离子脂质体介导的siRNA装载方式更为简单，阳离子脂质体通过经典吸附作用可包封约90％的siRNA。且阳离子脂质体具有与细胞膜相似的结构，通过膜融合的方式就可以对阳离子脂质体进行修饰。

对照例3

一般情况下，常规方法对囊泡类载体进行靶向修饰多采用化学偶联或静电吸附的方式。例如利用活性基团形成化学键修饰靶向分子；或利用阳离子介导吸附靶向分子。这些方法需要引入非天然的高分子聚合物、无机物、有机试剂等杂质，因此生物相容性难以保证。

与对照例3相比，本发明实施例3中所述阳离子脂质体介导，将siRNA包裹在内，形成 siRNA/阳离子脂质体的复合物，再通过超声将纳米囊泡与siRNA/阳离子脂质体的复合物共混发生融合重排，将siRNA负载于纳米囊泡内，胆固醇介导的适配体修饰，实施简便快捷，不引入非天然化学试剂，保证纳米囊泡载体具有较高的生物相容性。

此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。

应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

<120> siRNA递送载体及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

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