具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指 明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发 明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图 包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其 指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例的一个方面主要是提供了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病 毒疫苗，该干细胞可在体内长时间滞留，高效分泌新型冠状病毒棘突蛋白，启动人体针对新 型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，避免病毒对人体的感染。

例如，在本发明实施例的一个具体实施方案中提供了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞 的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗包含前述棘突蛋白、重组腺病毒载体、宿主细胞，或者免疫 组合物。

在一些实施方式中，所述新型冠状病毒疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白编码基 因修饰的间充质干细胞，所述新型冠状病毒疫苗可应用于预防新型冠状病毒。

在一些具体实施方式中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其经过棘突蛋白重组 腺病毒感染来获得棘突蛋白编码基因修饰，能够表达棘突蛋白，并以三聚体形式表达于细胞 的表面。

进一步的，所述棘突蛋白由腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST的CMV启动子调控表达，表达棘突蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。

进一步的，所述棘突蛋白与新型冠状病毒的表面糖蛋白相同，新型冠状病毒的表面糖蛋 白编码核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒 疫苗的制备方法，其主要包括构建表达棘突蛋白的腺病毒载体、制备棘突蛋白重组腺病毒颗 粒、纯化富集腺病毒颗粒、获取间充质干细胞、获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质 干细胞等步骤。

在一些实施方式中，所述制备方法包括：

(1)通过自由重组分别构建表达棘突蛋白的腺病毒载体；

(2)采用步骤(1)构建的腺病毒载体转染细胞，制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒；

(3)纯化富集步骤(2)所获棘突蛋白重组腺病毒颗粒；

(4)采用富集的棘突蛋白重组腺病毒颗粒对间充质干细胞进行感染，获得棘突蛋白编码 基因修饰的间充质干细胞。

在本发明实施例的一个更具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

(1)构建表达棘突蛋白的腺病毒载体：通过自由重组分别构建表达棘突蛋白的腺病毒载 体；

(2)制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒：用步骤(1)中的表达棘突蛋白的腺病毒载体分别 转染人胚肾细胞HEK293T制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒；

(3)纯化富集腺病毒颗粒：把步骤(2)中可表达棘突蛋白的重组腺病毒颗粒进行纯化 富集；

(4)获取间充质干细胞：从脐带分离间充质干细胞，选择第2-3代处于对数生长期的间 充质干细胞；

(5)获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞：待步骤(4)中的间充质干细 胞生长至70-80％汇合度时，用富集的腺病毒颗粒混合物进行感染，获得棘突蛋白编码基因修 饰的间充质干细胞。

本发明实施例的该具体实施方案中，将细胞治疗和基因治疗相结合，以三聚体形式的棘 突蛋白修饰的间充质干细胞作为疫苗的活性成分，具有方便获取的优势，其可以补充局部干 细胞数量，并高效分泌三聚体棘突蛋白及人源性生长因子(如EGF、bFGF等)，在来改善 局部微环境及免疫调节的同时，刺激机体产生针对新型冠状病毒的中和性抗体，安全、可靠、 有效，具有良好的应用前景。

本发明实施例的该具体实施方案中，通过基因修饰的手段使得脐带来源间充质干细胞高 效表达三聚体棘突蛋白，以最接近病毒棘突蛋白的天然形态对个体进行免疫，从而有效防御 病毒。

本发明实施例的该具体实施方案中，从脐带中分离间充质干细胞，能大量扩增治疗用细 胞的数量，并克服从骨髓获取间充质干细胞数量少、取材具有创伤性等特点，降低了生产及 使用成本。

综上所述，本发明的基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗通过棘突蛋白的 基因重组型间充质干细胞表达棘突蛋白来启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒 中和性抗体，从而避免病毒对人体的感染，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景，为新 型冠状病毒的预防提供了全新的选择。

下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使发明的优点和特征能更易于被 本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，但并不因此将本 发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注 明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非 另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子 生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域 的常规技术。

实施例1

本发明实施例的一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，所述新型冠状 病毒疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白基因修饰的间充质干细胞，所述新型冠状病毒 疫苗可应用于预防新型冠状病毒。

其中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其经过棘突蛋白重组腺病毒感染来获得棘突 蛋白编码基因修饰，能够表达棘突蛋白，并以三聚体形式表达于细胞的表面。

参照附图1～图2，棘突蛋白为新型冠状病毒的表面糖蛋白(Surfaceglycoprotein)，该 蛋白不包含TMPRSS2蛋白酶切割位点，其密码子经过优化，在真核细胞内可高效翻译，具 体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，新型冠状病毒的氨基酸序列如SEQID NO：3所示，具体 为：

参照附图3，棘突蛋白由腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST的CMV启动子调控表达。具体的，表达棘突蛋白的表达序列从5’端到3’端依次为CMV启动子、密码子优化的棘突蛋白基因开放读码框、HBB基因3`-UTR、胸苷激酶(thymidine kinase，TK)的加尾信号(TKpA)。表达棘突蛋白的表达序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

参照附图4，本实施例中一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗的制备 方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)构建表达棘突蛋白的腺病毒载体：从NCBI GenBank中下载棘突蛋白的基因序列 (MN908947：nt21563-25384)，用GeneOptimizer对棘突蛋白的开放读码框进行密码子优化， 把优化后的棘突蛋白编码序列通过人工合成的方法导入pENTR1A载体(A10462，ThermoFisher)的BamHI和XhoI酶切位点之间，分别命名为pENTR1A-_COV19Spike；使用Gateway LR Clonase II Enzyme(11791-020，ThermoFisher)把棘突蛋白从pENTR1A-_COV19Spike 转移到pAd/CMV/V5-DEST腺病毒表达载体(V493-20，ThermoFisher)中，分别命名为 pAd-CMV-_COV19Spike。

(2)制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒：用限制性内切酶PacI(R0547S，New EnglandBiolabs) 分别对5μg pAd-CMV-_COV19Spike进行酶切，使质粒线性化，用异丙醇纯化线性化的DNA片 段。利用Lipofectamine 2000(11668-019，ThermoFisher)把线性化pAd-CMV-_COVl9Spike转染 HEK293细胞；转染的HEK293在培养过程中要观察细胞生长情况，约2周后可观察到细胞 病变(cytopathic effect，CPE)出现。转染10-14天后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS 混悬，反复冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃；取30-50％上清，感染70％汇合度的T25 细胞培养瓶中的293细胞，培养2-3天后出现明显细胞病变；3-5天后，当1/3的细胞漂浮时 收集细胞沉淀，PBS重悬后反复冻融，离心后收集上清并保存于-80℃环境中；

(3)纯化富集腺病毒颗粒：取5μl病毒上清加入5μl 2×PBS，煮沸5分钟，离心后取1-2μl 作为模板进行PCR，检测棘突蛋白的编码基因，然后将步骤(2)中可表达棘突蛋白的腺病毒 颗粒进行纯化富集；

(4)获取间充质干细胞：无菌条件下，用无血清低糖DMEM培养基(11885092，Lowglucose DMEM，ThermoFisher)冲洗5-10克正常脐带组织，去除血污，在灭菌处理过的培养皿中把脐带组织剪碎为细颗粒状，再用低糖DMEM培养基清洗3次，直至组织碎块变为灰白色。将剪碎的组织碎块转入含有1mg/ml胶原酶(C1639，Collagenase，Sigma)的低糖DMEM 培养基中，完全浸没组织碎块，置于37℃细胞培养箱中充分消化2小时。常温下1000rpm离 心5分钟，弃上清，用低糖DMEM重悬沉淀。将组织碎块悬液转入T25细胞培养瓶(430168，Corning)，用含20％胎牛血清(10438026，Fetal Bovine Serum，ThermoFisher)的低糖DMEM培养，置于37℃5％CO₂恒温细胞培养箱。当细胞约80％汇合时用0.25％胰酶消化细胞进行传代培养。取第2-3代细胞，使用流式细胞术检测细胞表面分子标志(CD14-、CD34-、CD45-、CD73+、CD90+、CD105+)，来验证所培养的细胞是否具有间充质干细胞的表型。本发明中 脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14-、CD34-和CD45-，由此可见 培养的细胞为间充质干细胞。

(5)获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞：用T175cm²培养瓶(431080， Corning)培养人脐带间充质干细胞，当细胞汇合度达到70％时，把表达棘突蛋白的腺病毒颗 粒加入到T175cm²培养瓶中，混匀，37℃、5％CO₂恒温培养箱中继续培养24-48小时，加入 胰酶进行消化，制备细胞悬液。

实施例2

本实施例通过小鼠实验来对本发明做进一步说明。

将10只小鼠分成两组，A组5只，B组5只，将它们放置在相同的环境下生活：

A组注射疫苗：把1×10⁷个棘突蛋白编码基因修饰人脐带间充质干细胞用胰酶消化，充 分吹打成单细胞悬液，2000rpm离心收集细胞沉淀，用2ml医用生理盐水把沉淀重新悬浮； 用微量注射器把棘突蛋白编码基因修饰间充质干细胞分别注入5只小鼠腹腔，每次注射100μl， 每隔1-2周注射一次，注射3次；

B组注射生理盐水：用微量注射器把医用生理盐水分别注入另外5只小鼠腹腔，每次注 射100μl，每隔1-2周注射一次，注射3次；

最后，分别取A、B组的小鼠血清，通过ELISA法检测中和抗体，其抗体检测情况如表1所示：

表1：中和抗体浓度检测结果

由上表数据可看出，注射本发明的基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗， 能够有效地对机体进行免疫，诱导机体产生针对棘突蛋白的中和抗体，并且抗体能够长期稳 定保存在机体内，本发明的疫苗通过棘突蛋白的基因重组型间充质干细胞表达棘突蛋白来启 动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，从而避免病毒对人体的感染， 安全、可靠、有效，具有良好的应用前景，为新型冠状病毒的预防提供了一个全新的选择。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术 领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 李丁

<120> 基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗、其制备方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2685

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒（novel coronavirus）(新型冠状病毒（novel coronavirus）)

<400> 1

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660

gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag 720

tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat 780

ccacagacac ttgagattct tgacattaca ccatgttctt ttggtggtgt cagtgttata 840

acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt gctgttcttt atcaggatgt taactgcaca 900

gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa cttactccta cttggcgtgt ttattctaca 960

ggttctaatg tttttcaaac acgtgcaggc tgtttaatag gggctgaaca tgtcaacaac 1020

tcatatgagt gtgacatacc cattggtgca ggtatatgcg ctagttatca gactcagact 1080

aattctcctc ggcgggcacg tagtgtagct agtcaatcca tcattgccta cactatgtca 1140

cttggtgcag aaaattcagt tgcttactct aataactcta ttgccatacc cacaaatttt 1200

actattagtg ttaccacaga aattctacca gtgtctatga ccaagacatc agtagattgt 1260

acaatgtaca tttgtggtga ttcaactgaa tgcagcaatc ttttgttgca atatggcagt 1320

ttttgtacac aattaaaccg tgctttaact ggaatagctg ttgaacaaga caaaaacacc 1380

caagaagttt ttgcacaagt caaacaaatt tacaaaacac caccaattaa agattttggt 1440

ggttttaatt tttcacaaat attaccagat ccatcaaaac caagcaagag gtcatttatt 1500

gaagatctac ttttcaacaa agtgacactt gcagatgctg gcttcatcaa acaatatggt 1560

gattgccttg gtgatattgc tgctagagac ctcatttgtg cacaaaagtt taacggcctt 1620

actgttttgc cacctttgct cacagatgaa atgattgctc aatacacttc tgcactgtta 1680

gcgggtacaa tcacttctgg ttggaccttt ggtgcaggtg ctgcattaca aataccattt 1740

gctatgcaaa tggcttatag gtttaatggt attggagtta cacagaatgt tctctatgag 1800

aaccaaaaat tgattgccaa ccaatttaat agtgctattg gcaaaattca agactcactt 1860

tcttccacag caagtgcact tggaaaactt caagatgtgg tcaaccaaaa tgcacaagct 1920

ttaaacacgc ttgttaaaca acttagctcc aattttggtg caatttcaag tgttttaaat 1980

gatatccttt cacgtcttga caaagttgag gctgaagtgc aaattgatag gttgatcaca 2040

ggcagacttc aaagtttgca gacatatgtg actcaacaat taattagagc tgcagaaatc 2100

agagcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtcagagt gtgtacttgg acaatcaaaa 2160

agagttgatt tttgtggaaa gggctatcat cttatgtcct tccctcagtc agcacctcat 2220

ggtgtagtct tcttgcatgt gacttatgtc cctgcacaag aaaagaactt cacaactgct 2280

cctgccattt gtcatgatgg aaaagcacac tttcctcgtg aaggtgtctt tgtttcaaat 2340

ggcacacact ggtttgtaac acaaaggaat ttttatgaac cacaaatcat tactacagac 2400

aacacatttg tgtctggtaa ctgtgatgtt gtaataggaa ttgtcaacaa cacagtttat 2460

gatcctttgc aacctgaatt agactcattc aaggaggagt tagataaata ttttaagaat 2520

catacatcac cagatgttga tttaggtgac atctctggca ttaatgcttc agttgtaaac 2580

attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gttgccaaga atttaaatga atctctcatc 2640

gatctccaag aacttggaaa gtatgagcag tatataaaat ggcca 2685

<210> 2

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gccaccatgc tggtcatggc gccccgaacc gtcctcctgc tgctctcggc ggccctggcc 60

ctgaccgaga cctgggccgg ctcccactcc atgagg 96

<210> 3

<211> 895

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒（novel coronavirus）(新型冠状病毒（novel coronavirus）)

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

260 265 270

Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn

275 280 285

Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val

290 295 300

Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr

305 310 315 320

Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu

325 330 335

His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile

340 345 350

Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser

355 360 365

Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu

370 375 380

Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe

385 390 395 400

Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr

405 410 415

Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser

420 425 430

Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala

435 440 445

Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe

450 455 460

Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly

465 470 475 480

Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys

485 490 495

Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp

500 505 510

Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala

515 520 525

Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro

530 535 540

Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu

545 550 555 560

Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu

565 570 575

Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly

580 585 590

Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln

595 600 605

Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala

610 615 620

Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala

625 630 635 640

Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser

645 650 655

Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu

660 665 670

Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr

675 680 685

Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala

690 695 700

Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

705 710 715 720

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln

725 730 735

Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala

740 745 750

Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys

755 760 765

Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp

770 775 780

Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp

785 790 795 800

Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn

805 810 815

Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu

820 825 830

Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu

835 840 845

Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu

850 855 860

Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile

865 870 875 880

Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro

885 890 895