具体实施方式

可能涉及的英文缩略词

2材料与方法

如无特别注释，具体实施方式中所涉材料/方法均为本领域常规材料/方法，英文缩写参照上表。

2.1部分实验材料注释

2.1.1HBV标准质粒合成

HBV P编码区(GenBank:MN683731.1)的标准质粒，使用PUC57载体质粒与HBV P区序列重组合成(上海生工生物合成)。

2.1.2试剂LwCas13a蛋白同文献公开的Cas13a蛋白(Cas13a from Leptotrichiawadei)

2.2实验步骤及方法

2.2.1 HBV序列的收集与序列比对

收集所有HBV序列，用Clustal X生物信息软件将收集的HBV序列进行序列比对，序列比对结果的可视化使用MEGA7.0软件进行筛选突变相对较少的保守区域，筛选出的保守区域作为后续Cas13a检测的靶区和通用型等温扩增引物的设计区域。

2.2.2临床血清HBV DNA核酸提取

临床血清样本提取HBV DNA使用HiPure Viral DNA Kits柱式病毒DNA提取试剂盒(美基生物)按照常规步骤进行试验操作。

2.2.3等温扩增引物的设计与筛选

经上述的序列比对后，我们将保守的区域作为后续的Cas13a检测的候选靶序列。然后，在候选的Cas13a靶序列上下游的保守区进行设计重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA法)的引物。等温扩增的引物按照RAA核酸扩增试剂(基础型)说明书中所要求的标准，使用NCBI中Primer-BLAST和Oligo7.0进行设计。

设计RAA引物见表2.5。然后将设计的5对引物先经RAA 37℃等温扩增30min 后，再进行琼脂糖凝胶电泳实验。琼脂糖凝胶电泳试验使用配置的1.5％琼脂糖凝胶。DYY-6C型电泳仪的设置是电压U：120V，时间T：30min。使用Gene Genius Bio凝胶成像系统对凝胶电泳后的电泳胶成像。然后根据电泳条带筛选最佳的 RAA引物进行后续RAA-Cas13a检测。根据电泳胶的条带筛选出扩增效果最优的引物作为后续检测中RAA扩增的引物。此外，由于Cas13a系统检测的是RNA，因此，我们巧妙的在RAA上游引物加入T7序列，在后续T7 RNA聚合酶的作用下能够转录成单链RNA(ssRNA)。

表2.5本研究中用于RAA等温扩增的引物序列(上游引物前均加入了T7序列)

2.2.4重组酶介导链替换核酸等温扩增(RAA)

HBV DNA等温扩增将使用基础型RAA核酸扩增试剂盒(杭州众测)进行。按照试剂说明书步骤配置表2.6中扩增体系，然后将配置好的混合液放入恒温金属浴中37℃孵育30-60min。将扩增好的HBV产物，放置于冰上或者-20℃冰箱中备后续Cas13a检测使用。

表2.6 RAA等温扩增加样体系

2.2.5 crRNA的设计的原则

本专利设计的crRNA既可以连接LwCas13a蛋白又可以与HBV的靶序列可以互补配对，为Cas13a检测实验的方便，在设计的crRNA序列的上游另加入了 T7序列，融合后的总序列见下节的表格。

2.2.6 crRNA合成的试验步骤

根据上述琼脂糖凝胶电泳筛选出最佳的RAA引物，以及按照上述crRNA的标准设计两条相应的crRNA(表2.7)。考虑到直接合成RNA的不必要，我们采用通过体外转录方式(IVT)从crRNA的DNA模板中转录产生。所以我们在crRNA上游加入T7序列，这使crRNA基因片段在后续的T7 RNA聚合酶作用下即可转录成单链的crRNA。

表2.7本研究中所设计的crRNA与合成crRNA的模板(本表crRNA均指上游加了T7序列的)

具体crRNA合成试验步骤如下，首先将T7 Primer与crRNA模板按照crRNA合成体系配置混合液，然后将混合液放置在PCR仪进行高温融合，反应条件为 95℃，10min。反应结束后关闭PCR仪，让PCR仪自然降温至室温，这样缓慢退火延伸融合成crRNA与T7互补配对的双链DNA。

2.2.7合成后进行crRNA的T7转录

接下来，将上一步合成的双链crRNA DNA使用试剂盒HiScribe^TMT7 Quick HighYield RNA Synthesis Kit(NEB,E2050S)进行T7转录，按照说明书步骤以及所需体系配置T7转录混合液。然后，将配置好的混合液放置到37℃恒温孵箱中孵育8-10小时。这样就可以使得双链crRNA DNA转录成单链crRNA。

2.2.8转录后进行crRNA的纯化

然而，上述经T7转录后的crRNA可能含有杂质(混合液中可能含有一些未转录的DNA或者上述步骤存在的试剂)，因此，我们对T7转录后的产物进行 RNA纯化得到纯度和浓度更佳的crRNA，我们使用试剂盒RNA Cleanup Kit(NEB)进行crRNA纯化。

2.2.9评估crRNA的检测效率

将上述纯化好的crRNA使用无RNA酶的水梯度稀释到300ng/μL和30ng/μL 备后续Cas13a检测使用。在进行Cas13a检测之前，我们需要评估crRNA的检测效率：首先使用RAA引物对所述HBV标准质粒(浓度为10⁸copies/μL)进行等温扩增，然后将RAA扩增产物加入到crRNA-Cas13a的混合液中。 crRNA-Cas13a的混合液的配置按照表2.10 CRISPR/Cas13a检测体系进行，然后将混合液放置到Fast 7500荧光定量PCR机器中进行Cas13a荧光检测收集荧光。根据crRNA-Cas13a检测后荧光表达量(RFU)起伏高低，以及荧光曲线的平台期到达的早晚判定crRNA是否为最优的crRNA。结果如图1所示。。

2.2.10构建对HBV检测的CRISPR/Cas13a系统

HBV Cas13a检测包括先前RAA等温扩增靶序列，以及CRISPR/Cas13a检测试验两部分，具体的RAA-Cas13a检测步骤：首先对HBV DNA按照上述RAA 扩增试验步骤和条件进行等温扩增，然后将扩增的RAA产物加入到按照表2.10 CRISPR/Cas13a检测体系配置的crRNA-Cas13a混合液中。接着Cas13a检测结果的可视化使用荧光读数和侧向流试纸条检测两种方式呈现。

对于Cas13a荧光读数法，我们使用的是ABI Fast 7500qPCR系统(AppliedBiosystems)收集Cas13a蛋白激活后非特异性剪切荧光探针 (FAM-UUUUUU-BHO)发出的荧光。同样我们也可以使用便携式荧光收集仪进行。

侧向流试纸条法使用的是HybriDetect试纸条(Milenia Biotec，德国)进行，生物素探针为5′-/6-FITC/UUUUUU/Biotin/-3′。侧向流试纸条检测的探针由于一端是荧光素一端是生物素。在侧向流试纸条第一条线(Control线)位置上的链霉亲和素会和探针上的生物结合，那么会与剪切的生物素端结合以及捕获所有完整没剪切的探针。金纳米颗粒(NPs)标记的抗FITC抗体将与FITC结合后会产生肉眼可见的深紫色条带。如果FITC-Biotin RNA探针没有被剪切(检测阴性)，那么会在第一条线留下深紫色条带。当FITC-Biotin RNA探针被裂解(检测阳性)，由于靶标的存在和附属的活性，金颗粒标记的抗体会顺着流向第二条线(Testing线)。试纸条第二条线上标记二抗，它会捕获所有抗体，从而形成深紫色的条带，第二条带的颜色表示目标病原体是否存在以及探针被剪切的程度。此外，侧向流试纸条法在进行测试前，需要在金属浴中37℃的条件下孵育30-60 min。

表2.10 CRISPR/Cas13a检测加样体系

2.2.11 RAA-Cas13a系统检测HBV DNA的灵敏度分析

对新建立的RAA-Cas13a系统进行梯度灵敏度分析，评估RAA-Cas13a的检测下限。首先使用一系列稀释的HBV标准质粒先进行RAA等温扩增，然后使用扩增的产物进行Cas13a的荧光法和侧向流试纸条检测。按照先前描述的实验步骤操作。然后根据荧光曲线和试纸条检测结果判定RAA-Cas13a检测下限。

2.2.12 RAA-Cas13a检测HBV DNA的特异性分析

为了保证仅能检测到HBV不能检测到其他病原体影响检测结果。首先我们进行生物信息学分析，对crRNA中靶序列进行BLAST分析，看检测结果是否除 HBV各亚型外，有没有其他病原体有相似序列。若序列相似差异碱基较少，那么重新设计HBV-Cas13a的靶序列，最终获得特异性靶序列。此外，临床常与乙肝鉴别诊断的其他肝炎病毒进行鉴别检测，包括甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)。HBV和其他肝炎鉴别检测使用序列比对和HBV-Cas13a荧光法检测方法同时进行。

2.2.13临床样本纳入标准与临床验证

临床样本的纳入标准：3个月内送到一医院检验科进行HBV筛查的所有血清样本。样本血清提取核酸使用HiPure Viral DNA Kits柱式病毒DNA提取试剂盒(Magen)按照上述试验步骤进行。将提取的核酸与剩余的血清样本放置于 -80℃冰箱备用。为了避免主观因素对检测结果的干扰，临床血清样本以盲法试验的形式，分别进行RAA-Cas13a检测和qPCR检测。RAA-Cas13a的检测按照先前描述步骤。qPCR检测使用商业化HBV检测试剂盒(HBVNucleic Acid Assay Kit，Sansure Biotech)按照说明书的步骤和标准进行。并且以qPCR检测为金标准评估RAA-Cas13检测效果。此外，灵敏度(sensitivity)、特异性(specificity)、阳性预测值(positive predictive value，PPV)、阴性预测值(negativepredictive value， NPV)和接受者操作特征(ROC)曲线将用于评价RAA-Cas13a检测的效率。对于基于RAA-Cas13a荧光法检测HBV阳性样品的定义，我们设置了信噪比 (signal-to-noise ratio)参数(样品的荧光值与阴性对照的比值，S/N)。取Cas13a 反应30min时间点的荧光值的信噪比S/N>3即定义为HBV阳性样品。

2.2.14数据分析

对于HBV的RAA-Cas13检测方法将进行三次平行实验避免试验误差，数据用均数加减标准误表示。多组独立样本数据比较使用方差分析。试验组与对照组的样本比较使用Dunnett-t检验。数据分析和绘图使用Adobe Illustrator CS 6软件、SPSS21.0(IBM,Chicago,IL,USA)和GraphPad Prism 8.3.0(GraphPad软件, San Diego,CA,USA)。本研究中P＜0.05为具有统计学意义，*为P＜0.05，** 为P＜0.01，***为P＜0.001，ns(notstatistically significant)表示无统计学意义。

2.2.15 RAA-Cas13a试验流程经提取的HBV DNA先进行RAA等温扩增出更多靶HBVDNA序列，我们在Cas13a检测体系中加入T7 RNA聚合酶这样可以将T7转录和Cas13a检测整合一起：直接将RAA扩增产物(DNA)直接加入到Cas13a检测体系中，一边T7 转录成ssRNA，同时可以进行Cas13a检测。检测结果的可视化采用荧光读数和侧向流试纸条两种方式。荧光读数可以实时观察荧光探针FAM-BHQ被切割后荧光值的变化，但是需要荧光收集仪器。侧向流试纸条法是根据生物素探针 FITC-Biotin被切割后在试纸条呈现条带进行肉眼可视化检测结果。

3结果：

3.1.1基于RAA-Cas13a HBV检测系统的建立

使用Clustal X软件对收集的7720条HBV P区序列比对后，筛选出5个变异较少的保守区作为候选Cas13a检测靶区。接着对这5个保守区分别设计相应的RAA引物。经琼脂糖凝胶电泳试验后，结果发现仅有primer2(保守区 region1)，primer3(保守区region2)凝胶电泳条带扩增效果较好并且引物二聚体较少。因此，仅对保守区region1和region2设计相应的crRNA(crRNA1 和crRNA2)。

接下来，为了使Cas13a系统能够更加快速、更灵敏的检测HBV DNA，我们对 crRNA1和crRNA2进行Cas13a荧光法检测，根据荧光读数和到达荧光曲线的平台期的时间可筛选出检测效率更优的crRNA用于后续Cas13a系统对HBV临床检测，结果如图1所示。3.1.2基于RAA-Cas13a HBV检测系统的检测下限的分析

首先，我们使用检测下限来评估新建立的HBV RAA-Cas13a检测系统，判断新建立的检测系统灵敏度如何。我们使用一系列标准梯度稀释的HBV DNA质粒，先经过37℃条件下RAA等温扩增30min后，按照上述步骤使用Cas13a荧光法分别进行检测，结果如图2、3所示。crRNA1-Cas13a检测的荧光曲线结果发现crRNA1(region1)对应的Cas13a检测系统的检测下限可至1copy/μL。并且，可在10min即可与阴性对照具有统计学差异；crRNA2(region2)对应的 Cas13a检测系统在反应10min后，其检测下限为10copies/μL。此外， crRNA1-Cas13a系统检测到达平台期更短，反应结束更快。

此外，我们也同时对crRNA1-Cas13a和crRNA2-Cas13a系统进行了侧向流试纸条的检测，试纸条检测结果基本同显示crRNA1对应的Cas13a检测系统检测下限可至1copy/μL，而检测结果显示crRNA2对应的Cas13a系统检，其测下限至10copies/μL。因此，后续对HBVDNA临床样本评估选用 crRNA1-Cas13a组合。

3.1.3基于RAA-Cas13a HBV检测系统的特异性分析

首先我们对crRNA1中靶序列进行BLAST分析，BLAST结果发现除HBV 各亚型外，没有发现其他相似序列。接下来，我们使用新建立的RAA-Cas13a检测系统对HBV和其他肝炎病毒(HAV、HCV、HDV和HEV)进行鉴别检测。 MEGA7.0序列比对结果显示HBV序列与HAV、HCV、HDV和HEV序列之间碱基差异较大。此外，我们也通过试验进行验证RAA-Cas13a系统的特异性。使用RAA-Cas13a方法分别对HAV、HBV、HCV、HDV和HEV进行检测。 RAA-Cas13a荧光检测结果显示除HBV样品的荧光曲线有较大起伏外，其他肝炎病毒的荧光信号基本未有任何的起伏，并且在Cas13a系统反应30min后，HBV 与其他肝炎病毒之间的荧光值差异更大。因此，可以说明RAA-Cas13a系统对 HBV检测具有特异性。

3.1.4基于RAA-Cas13a HBV检测系统的临床验证

为了评估新建立的RAA-Cas13a检测系统在临床样本检测中的有效性，我们分别使用qPCR和基于RAA-Cas13a的HBV系统对74份临床血清样本进行检测。并且以目前临床上最常用的qPCR检测结果为金标准(表3.2)，将74份临床样本分为阳性组(Positive HBVsamples)和阴性组(Negative HBV samples)。 RAA-Cas13a检测HBV使用荧光法和侧向流试纸条法两种方式呈现。按照上述试验条件，在经30min RAA等温扩增后，Cas13a荧光法检测反应30min。表 3.1结果显示RAA-Cas13a荧光法只需要60min，其检测灵敏度为93.8％、特异度为100％、阳性预测值(PPA)为100％以及阴性预测值(NPA)为95.5％。此外，ROC曲线下面积AUC为0.9375(95％CI,0.8536-1)，接近1，说明Cas13a荧光法检测较为真实可靠。

接下来，对74个血清再次进行RAA-Cas13a侧向流试纸条检测，其中延长 Cas13a反应孵育时间至40min以及额外增加RAA产物到Cas13a检测体系中。最后使用调整后的反应条件进行Cas13a侧向流试纸条检测，表3.1结果显示 RAA-Cas13a侧向流试纸条法其检测灵敏度为90.6％、特异度为100％、阳性预测值(PPA)为100％和阴性预测值(NPA)为91.3％(表3.1)。

表3.1 RAA-Cas13a与qPCR检测结果比较

注：CI为Confidence intervals，置信区间

表3.2 74份临床样本qPCR检测结果

注：使用商业化HBV检测试剂盒(Sansure Biotech)进行qPCR定量检测。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 基于CRISPR/Cas系统的HBV检测

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actttctcgc caacttacaa ggcctttc 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccaagtgtt tgctgacgca acccccac 28

<210> 3

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacgaaa ggccuuguaa guuggcgaga 60

aagu 64

<210> 4

<211> 64

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacgugg ggguugcguc agcaaacacu 60

uggc 64

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tattgattgg aaagtmtgtc aamgaattgt ggg 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagtggggg ttgcgtcagc aaacacttgg ca 32

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaaccttta ccccgttgcy cggcaa 26

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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