一种迷你启动子pRTN1及其应用
阅读说明：本技术 一种迷你启动子pRTN1及其应用 (Mini promoter pRTN1 and application thereof ) 是由 路中华 林剑邦 李田 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于神经工程技术领域,具体涉及一种在神经元细胞特异性高效表达的迷你启动子pRTN1。本发明提供了一种迷你启动子pRTN1及其应用,所述启动子pRTN1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明另一方面提供了应用该启动子pRTN1在重组腺相关病毒载体、重组腺相关病毒、重组腺相关病毒的试剂盒、基因治疗载体中,以及在制备操控神经细胞、基因编辑和/或基因治疗试剂中的应用。本发明提供的迷你启动子pRTN1使外源基因得以在全脑范围内的神经元中高效表达,在基因编辑和基因治疗领域具有广泛的应用前景。(The invention belongs to the technical field of nerve engineering, and particularly relates to a mini promoter pRTN1 specifically and efficiently expressed in neuronal cells. The invention provides a mini promoter pRTN1 and application thereof, wherein the nucleotide sequence of the promoter pRTN1 is shown as SEQ ID NO: 1 is shown. The invention also provides application of the promoter pRTN1 in recombinant adeno-associated virus vectors, recombinant adeno-associated viruses, kits of recombinant adeno-associated viruses and gene therapy vectors, and in preparation of nerve cell manipulation, gene editing and/or gene therapy reagents. The mini promoter pRTN1 provided by the invention enables an exogenous gene to be efficiently expressed in neurons in the whole brain range, and has wide application prospects in the fields of gene editing and gene therapy.)
技术领域
本发明属于神经工程技术领域，具体涉及一种迷你启动子pRTN1及其应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种无包膜的单链DNA病毒。重组腺相关病毒(rAAV)是在野生型AAV基础上改造而成的重组型病毒。重组腺相关病毒由于其具有能介导基因在哺乳动物体内长期稳定表达、免疫原性低、宿主范围广等优点，是神经科学领域中和临床神经系统疾病基因治疗中广泛使用的基因递送载体。
在应用rAAV于神经科学研究及临床治疗的过程中，提高目的基因表达的时空特异性和表达水平是基因递送的关键。调控外源基因表达的策略直接影响了基因递送的效率和安全性。对于神经系统疾病的基因治疗而言，若要干预不同的神经系统疾病，就要对全脑或不同亚型的神经元进行操纵。其中一个重要的方法是选择不同血清型的rAAV病毒。目前已有的报道中，适用于神经系统的rAAV血清型包括：1型、2型、5型、6型、8型、9型、DJ、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、Retro、rh10等十几种。不同血清型的病毒对不同的脑区具有不同的亲和性、感染效率及扩散能力，因此，我们可以根据研究对象及治疗靶点，选择不同的rAAV血清型作为基因递送载体。然而，鉴于中枢神经系统的复杂性，这些血清型远远无法满足当前基因递送特异性的需求。另一种方法是在rAAV基因组中应用组织特异性的启动子。启动子是基因表达调控过程中必要的顺式作用元件。在具有表达特异性启动子的调控下，外源基因一般只在某些特定的细胞类型或脑区中表达。在rAAV中使用特异性启动子来驱动基因表达，能提供基因表达的效率，降低rAAV感染过程中产生的免疫反应。
rAAV是递送治疗性基因元件至中枢神经系统的可靠病毒载体，但有两个重要因素阻碍了其在基因治疗策略中的开发应用。首先，rAAV的最大包装容量为5.2kb，极大限制了大的治疗性基因元件在单一AAV载体中的包装；其次，rAAV的低靶向性也是限制发展rAAV病毒工具的难题。目前常用的神经元特异性启动子hSyn大小为485bp，这一启动子长度在单一AAV载体的前提下进一步限制了功能蛋白的包装容量。
发明内容
本发明旨在提供一种迷你启动子pRTN1及其应用。所述迷你启动子pRTN1长度仅为120bp，能适用在重组腺相关病毒中，使外源基因得以在神经元细胞中高效表达，在基因编辑和基因治疗领域具有广泛的应用前景。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一目的是提供一种在神经元细胞特异性高效表达的迷你启动子pRTN1，所述启动子pRTN1长度为120bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
CGCTGATTCGCTGCCGGCCGCGCAGACTGCGGCGCCAGCGACGCTCCCGCCCCTCACCGCGCGCCGCCTGGTGCAGCCTCAGTCTCTCCGCAGCCGCGCGGCCACTGCGAGCCCAGCCGC(SEQ ID NO：1)
本发明的第二目的是提供一种含有上述启动子的重组腺相关病毒载体。
优选的，所述重组腺相关病毒载体采用pAAV-hSyn-X作为骨架载体，将该载体中hSyn替换为pRTN1启动子，得到重组腺相关病毒载体pAAV-pRTN1-X，，X是需要表达的蛋白序列。
优选的，所述重组腺相关病毒载体所述重组腺相关病毒载体为pAAV-pRTN1-荧光蛋白、pAAV-pRTN1-功能性蛋白或pAAV-pRTN1-治疗性蛋白中的一种；所述荧光蛋白为eYFP或tdTomato；所述功能性蛋白为或化学遗传相关蛋白。
所述pAAV-pRTN1-荧光蛋白可以实现特异性细胞感染示踪；pAAV-pRTN1-功能性蛋白可以用于制备激活或者抑制特定神经元的重组腺相关病毒；pAAV-pRTN1-治疗性蛋白可以用于基因治疗。
优选的，所述的重组腺相关病毒载体pAAV-pRTN1-X的制备方法，包括以下步骤：
(1)将启动子pRTN1基因片段两端分别加上限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF识别位点后人工合成；
(2)采用限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF处理pAAV-hSyn-X载体，同时用限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF处理pRTN1片段；
(3)对两种酶切产物进行回收、纯化、连接，得到重组腺相关病毒载体pAAV-pRTN1-X。
本发明的又一目的是提供一种含有上述启动子或上述重组腺相关病毒载体的重组腺相关病毒。
所述重组腺相关病毒AAV-PHP.B-pRTN1-eYFP、AAV-PHP.B-pRTN1-tdTomato可以特异性地感染神经元细胞，并表达高荧光强度的eYFP或tdTomato。
本发明的又一目的是提供一种所述启动子或所述重组腺相关病毒载体或所述的重组腺相关病毒的试剂盒。
进一步地，本发明另一方面提供了所述启动子或重组腺相关病毒载体或重组腺相关病毒或重组腺相关病毒的试剂盒在制备操控神经细胞、基因编辑和/或基因治疗试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明迷你启动子pRTN1长120bp，且在神经元细胞中具有高效表达效率，在神经元可以实现外源基因高效表达，提高病毒感染后的表达特异性，其在基因编辑和基因治疗领域具有广泛的应用前景；
(2)本发明启动子pRTN1在细菌和哺乳动物细胞中无细胞毒性；
(3)本发明重组腺相关病毒载体采用pRTN1作为启动子，具有更大的包装能力，在兴奋性及抑制性神经元均具有高效表达效率；
(4)本发明重组腺相关病毒可以在全脑范围内感染神经元细胞，包括皮层、海马及中脑都能驱动eYFP高水平表达。
附图说明
图1为pAAV-pRTN1-eYFP载体的构造流程图；
图2为AAV-PHP.B-pRTN1-eYFP在小鼠大脑的表达效率图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
所述启动子pRTN1基因片段由苏州金维智生物科技有限公司合成；
所述核酸酶购自NEB公司，货号R3198S、R3136S；
所述AAV滴度测定染料法荧光定量试剂盒购自TAKARA公司；
所述PFA购自Leagene公司，货号DF0135。
实施例1pRTN1基因片段合成
启动子pRTN1是人源网结蛋白1(Reticulon 1)基因的部分序列，所述序列选取了RTN1基因的转录起始位点的-80到+40位的核心启动子区序列，共120bp的序列作为最终启动子序列，所述启动子pRTN1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
将启动子pRTN1基因片段两端分别加上限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF识别位点后由苏州金维智生物科技有限公司合成。
实施例2构建重组腺相关病毒载体pAAV-pRTN1-eYFP
本实施例由于采用YFP作为启动子的报告基因，因此在构建重组载体是，选用了含有YFP基因的重组腺相关载体pAAV-hSyn-eYFP作为载体骨架来连接pRTN1启动子，步骤如下：
如图1所示，采用限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF处理pAAV-hSyn-eYFP载体，同时用限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF处理pRTN1片段，37℃下酶切3小时，酶切体系如表1和表2所示，回收酶切产物后采用连接预混液(2x ligation premix，TAKARA)在16℃下进行连接30分钟，体系如表3所示，得到连接成功的pAAV-pRTN1-eYFP载体。
表1pAAV-hSyn-eYFP载体酶切体系
试剂
用量
酶切缓冲液10×CutSmart Buffer
5μL
MluI-HF
1μL
BamHI-HF
1μL
pAAV-hSyn-eYFP
1μg
ddH2O
补至50μL
表2pRTN1片段酶切体系
试剂
用量
酶切缓冲液10×CutSmart Buffer
5μL
MluI-HF
1μL
BamHI-HF
1μL
pRTN1片段
1μg
ddH2O
补至50μL
表3连接体系
试剂
用量
连接预混液2×ligation premix
5μL
pAAV-eYFP连接骨架
0.5μL
pRTN1连接片段
4.5μL
实施例3重组腺相关病毒AAV-PHP.B-pRTN1-eYFP的制备
本实例采用三质粒共转染法制备病毒。病毒制备前，需要将包装病毒所需质粒采用QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit(QIAGEN公司，货号12943)进行中提取，包括重组腺相关病毒载体pAAV-pRTN1-eYFP、包装质粒AAV-PHP.B和辅助质粒pHelper。具体步骤如下：
制备细胞：将293T细胞铺在含有全培养基(DMEM，10％胎牛血清、1％双抗)培养皿中，于培养箱中培养。
制备转染试剂：吸取5.25ml超纯水、75μg包装质粒、75μg重组质粒、75μg辅助质粒和800μL的2M氯化钙溶液，轻轻混匀。向前述试剂中，加入等体积2x HBS，涡旋后静置30分钟。
转染细胞：向每盘细胞中加入20μL氯奎(25mM)，加入转染试剂后培养。
收取病毒：72小时后将前述转染后的细胞收集于离心管以3000rpm离心30min。弃上清后加入2ml细胞裂解液(100mM Tris-HCL,150mM NaCl，pH8.0)，随后经过四轮反复冻融法裂解细胞，每轮分别用-80℃冰箱和37℃水浴锅各10分钟速冻和融化，每次融化后进行简短涡旋，以促进裂解，最终得到含有病毒的细胞破碎液。
纯化病毒：将上述细胞破碎液以11500rpm离心30min，弃上清后加入200μLHBS混匀，加入200μL氯仿以12000rpm离心5min，取上清，加入100μL 2.5mM NaCl和100μL 40％PEG8000，涡旋混匀，4℃冰箱静置过夜。将前述过夜样品以12000rpm离心30min，弃上清，加入30μL的HBS、0.5μL核酸酶，静置30min。随后加入30μL氯仿，以12000rpm离心5min。纯化完成后于-80℃冰箱保存。
测定滴度：用AAV滴度测定染料法荧光定量试剂盒(TAKARA公司)对前述纯化病毒进行滴度测定，滴度结果为2.0×1013vg/ml。
实施例4重组腺相关病毒在小鼠全脑神经元的特异性表达
将纯化后的重组腺相关病毒，采用立体定位注射至小鼠侧脑室(Bregma:+0.02mm；R:-0.80mm；D:2.40mm)，在全脑的范围内对pRTN1表达特性进行研究。三周后，将小鼠用4％的PFA灌流取全脑，经4％PFA固定及30％蔗糖溶液脱水，待脑组织完全脱水后进行冰冻切片和免疫荧光染色，并观察脑片结果。
实验结果如图2所示，eYFP在小鼠全脑范围内的神经元中均有很高的表达水平，表明PHP.B血清型病毒能跨越脑-脑脊液屏障，感染全脑的细胞。pRTN1在全脑范围内，均具有转录活性，能够在皮层、海马和中脑驱动eYFP的高水平表达。值得注意的是，在高倍显微镜下可以观察到pRTN1只驱动eYFP在神经元中的表达，而不在胶质细胞中表达，由此可以证明启动子pRTN1具有神经元特异性及高效表达水平。
综上，本发明在小鼠上进行验证，证明启动子pRTN1具有神经元特异性及高效表达水平。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 深圳市恩辑生物科技有限公司
<120> 一种迷你启动子pRTN1及其应用
<130> 2021.8.20
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 启动子pRTN1核苷酸序列(Promoter pRTN1 nucleotide sequence)
<400> 1
cgctgattcg ctgccggccg cgcagactgc ggcgccagcg acgctcccgc ccctcaccgc 60
gcgccgcctg gtgcagcctc agtctctccg cagccgcgcg gccactgcga gcccagccgc 120
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