具体实施方式

本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂含有担子菌X的干燥粉末或其提取组合物作为有效成分。

在此，本发明中所谓的担子菌(Basidiomycetes)是担子菌，虽然观察到嘴状突起(钳)，其具有以下特性，即不具有担子形成潜能，与其它担子菌不同。即，即使进行培养，也不形成担子而仅形成菌核(菌丝体)。上述担子菌是从自然界探索细菌的结果，进行分离，作为担子菌X保藏于国家高级工业科学技术学院(NITE)NITE国际专利生物保藏中心(NITE-IPOD)(保藏编号：FERM BP-10011)。

该担子菌X不形成分生孢子，即，没有无性传代。例如，如果在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养，则培养菌丝有钳且平滑，但不形成分生孢子，不形成子实体。如果观察菌落表面的形状色调，则菌落内形成淡粉色菌丝体，在从接种部位生长为同心圆状的菌落内形成多个菌丝体时，菌丝体相互通过菌丝束连结。应予说明，菌落背面的色调为淡粉色。另外，如果在葡萄糖·干酵母琼脂培养基中培养，则培养菌丝有钳且平滑，但不形成分生孢子，不形成子实体。如果观察菌落表面的形状色调，则菌落内形成淡粉色～白色的菌丝体，形成以接种部位为中心厚度5mm～6mm的菌丝体。应予说明，菌落背面的色调为淡粉色～白色。

担子菌X的最佳生长条件例如为pH5.0～6.0，温度22℃～26℃。另外，生长范围例如为pH4.0～7.5，温度5℃～30℃。

另外，担子菌X可以通过上述通常的培养方法培养，培养方法没有特别限制。例如，通过在添加适当营养源并灭菌的琼脂培养基、锯末培养基、液体培养基等中无菌接种已培养的菌株或种菌，在适当温度条件下进行培养，可得到担子菌X的菌丝体。此外，如果培养担子菌X，则根据培养环境形成菌丝体。

通过将上述担子菌X的菌丝体根据需要进行干燥，并将该干燥物制成粉末(担子菌X的干燥粉末)，得到本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂。或者，也可以将上述干燥粉末制成颗粒、片剂、胶囊、溶液状、凝胶状等而作为弹性蛋白酶活性抑制剂。

另外，也可以将担子菌X的提取组合物作为本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂的有效成分。来自担子菌X的菌丝体的提取方法没有特别限制。例如，从担子菌X的菌丝体高效提取细胞内容物时，优选根据需要冻结担子菌X的菌丝体等而破坏细胞壁，解冻后利用搅拌机等粉碎，提取提取物(担子菌X的提取组合物)。

提取物的提取溶剂也没有特别限制，使用水、低级醇等，以及添加酸、碱、其它添加剂的提取液在常温或加热条件下、或加压下进行提取。通常，在热水中煎煮提取，或在将水或醇、添加碱的水与粉碎物混合的状态下，例如加压至100MPa～700MPa左右，优选300MPa～600MPa左右进行提取。

在此，对提取方法的示例进行说明。首先，常温解冻冻结的担子菌X的菌丝体，利用搅拌机粉碎，将粉碎的担子菌X的菌丝体与提取溶剂即水的比例例如设为1：5左右，将粉碎担子菌X的菌丝体50g放入玻璃瓶，添加水250ml，盖紧盖，在锅底部敷上毛巾后注水，放置装有粉碎担子菌X的菌丝体的玻璃瓶并加热使其沸腾。煮沸后继续加热90分钟，冷却后进行固液分离，得到提取液(担子菌X的提取组合物)及残渣(担子菌X的提取残渣)。提取液的pH例如表示6.3～6.5。粉碎的担子菌X的菌丝体也可以替换为担子菌X的干燥粉末，例如，此时，可适当将其放入水溶剂中，一边搅拌一边静置培养4小时～6小时，然后进行固液分离，可得到提取液和残渣(担子菌X的提取残渣)。

根据需要浓缩如此得到的提取液，形成担子菌X的提取组合物。应予说明，提取物的浓缩方法没有特别限制，例如按照以下进行。

将得到的提取液移至烧杯中加热使其蒸发进行浓缩。此时，提取液由浅驼色变为棕色并开始强烈起泡，进一步继续蒸发浓缩，例如在变成pH4.9、密度1.25g/cm³的焦油状的时刻，结束浓缩。该浓缩提取物散发出酱油样香气。应予说明，该时刻的来自担子菌X的菌丝体的浓缩提取物的收率为平均12％。伴随如此得到的浓缩提取物冷却，粘性变得非常高，因此必须在结束浓缩的同时转移至保存容器中。另外，优选转移至保存容器中的浓缩提取物直接冷却后，冷冻冻结保存。

根据需要将该担子菌X的提取组合物干燥，制成粉末、颗粒、片剂、胶囊、溶液状、凝胶状等，得到的物质为本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂。另外，也可以将担子菌X的干燥粉末作为本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂。此外，弹性蛋白酶活性抑制剂在其中的含有比例只要根据用途适当设定即可，没有特别限制。

本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂能够以选自上述粉末、颗粒、片剂、胶囊、溶液状、凝胶状等中的任一形态制成弹性蛋白酶活性抑制化妆品、弹性蛋白酶活性抑制饮食用组合物。而且，可通过根据需要对它们进行加工来提供补充剂或饮料(Drink)等。此外，弹性蛋白酶活性抑制外用剂、弹性蛋白酶活性抑制饮食用组合物中的担子菌X的干燥粉末或担子菌X的提取组合物的含有比例可以根据需要适当设定，没有特别限制。

本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂如后述的实施例所示，能够抑制弹性蛋白酶活性。因此，本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂可制成外用剂的形态或内用剂的形态。在此，外用剂的形态是弹性蛋白酶活性抑制外用剂，可举出外用医药品、非药品或化妆品等，通过适用于皮肤、头皮而抑制弹性蛋白酶活性。另外，内用剂的形态是弹性蛋白酶活性抑制饮食用组合物，可举出内用医药品、非药品、或补充剂、饮料、饮食品等。

作为弹性蛋白酶活性抑制外用剂，典型而言可举出用于防止皮肤衰老的化妆品、用于生发的外用剂。

作为用于防止皮肤衰老的化妆品，例如可举出油包水型或水包油型乳化化妆品、面霜、化妆水(LOTION)、凝胶(GEL)、泡沫、精华液、粉底、面膜、洗面奶、粉剂等，另外还可以为洗发水、柔顺剂(RINSE)、肥皂、沐浴露等洗漱用品、沐浴剂等。另外，作为用于生发的外用剂，是直接应用于头皮等对象部位的生发剂。

上述弹性蛋白酶活性抑制外用剂可任意组合配合制剂化通常使用的各类成分，例如作为化妆品成分通常使用的油分、表面活性剂、纯净水、醇类、螯合剂、pH调整剂、防腐剂、增稠剂、乳化剂、乳化稳定剂、色素类、香料、以及紫外线吸收剂、美白剂、保湿剂、皮脂分泌抑制剂、柔顺剂、角质保护剂、药效剂、抗氧化剂、溶剂等成分，可以制剂化为化粧品、外用医药品、非药品。

弹性蛋白酶活性抑制饮食用组合物可举出片剂、粉末、胶囊等补充剂、或液体、果冻状等饮料、或保健食品等。

如以上说明所示，本发明的弹性蛋白酶活性抑制剂，作为弹性蛋白酶活性抑制外用剂、弹性蛋白酶活性抑制饮食用组合物，外用或服用、摄入，从而能够抑制弹性蛋白酶活性，具体而言能够用于防止皱纹、松弛等皮肤衰老、或生发效果。在上述抑制弹性蛋白酶活性的方法、防止皱纹、松弛等皮肤衰老的方法中，各弹性蛋白酶活性抑制剂或组合物的摄入方法没有特别限制，可根据源自弹性蛋白酶活性的各种症状等适当确定有效量，进行外用或内用、摄入。

本实施方式中，在日常生活中可以容易摄入，故优选口服摄入。另外，作为摄入条件，例如可举出：干燥担子菌X的提取组合物并粉末化，制成优选200mg～300mg的片剂，每日1次～3次，优选3次口服摄入，或每日1次～2次应用含有担子菌X的提取组合物的外用剂的弹性蛋白酶活性抑制方法、防止皱纹、松弛等皮肤衰老的方法、或生发方法。应用或服用时间没有特别限制，但优选为长期，例如，优选为8周以上，更有选为16周以上。

实施例

下面，参照实施例和担子菌X的干燥粉末或担子菌X的提取组合物的制造例对本发明进行更具体说明。

(制造例1)

<从菌丝体的分离>

(1)培养基的制备

按以下表1所示的配方，制备PSA培养基和PDA培养基，分装到试管或三角瓶后，使用硅盖(注册商标)(或棉塞)并通过高压釜在121℃高压蒸汽灭菌20分钟。然后，在试管的情况下，灭菌后趁热倾斜而制成斜面(slant)培养基，在三角瓶的情况下，直接静置而制成平板(plate)培养基。

【表1】

(2)从菌丝体的分离

利用手分开大块担子菌X的菌丝体，使火焰灭菌的手术刀冷却后，沿担子菌X的截面切下切片，利用火焰灭菌冷却后的镊子，在(1)的PSA培养基和PDA培养基斜面中接种担子菌X切片。应予说明，在无菌箱或超净工作台内在完成无菌处理的条件下进行操作。

(3)利用用于生产菌丝体的琼脂培养基的培养

利用纯净水将1cm见方的马铃薯200g煮沸后继续煮沸20分钟，冷却后，在固液分离的马铃薯渗出液、蔗糖20g和琼脂1g(0.1％)中添加蒸馏水至总量为1L，制备琼脂培养基。此外，通常琼脂培养基中添加1.5g～2.0g(每1L培养基中添加15g～20g)的琼脂，但为了容易将培养后的菌丝体与琼脂培养基分离，另外在液体培养基中担子菌X的切片易于沉淀，因此为了维持物理强度，添加0.1％。将该0.1％琼脂培养基以各5mL的量分装至试管中，使用硅塞(注册商标)后利用高压釜在121℃高压蒸汽灭菌20分钟。然后，在完成无菌处理的无菌箱内，在制造例1的斜面上从培养中的担子菌X菌丝体上切下切片，通过无菌操作接种到0.1％琼脂培养基。在24℃条件下在培养箱中培养，24小时～48小时后产生生物体。产生生物体后，如果在24℃条件下继续培养，则菌丝在琼脂培养基上生长14天。

(制造例2)

<利用用于生产菌丝体的锯末培养基的培养>

(1)种菌的培养

在锯末1L、脱脂糠15g、麦麸15g和SANPEARL(菌丝活性剂·日本制纸社制造)5g中添加水并充分搅拌，用力握住培养基至水渗出的程度(湿含水量70％程度)，制备锯末培养基。将该培养基添加至三角瓶中，使用硅塞(注册商标)后，通过高压釜在121℃高压蒸汽灭菌40分钟。灭菌后24小时，在制造例1的斜面上将培养中的担子菌X的菌丝在无菌箱内通过无菌操作接种到锯末培养基。应予说明，接种是用灭菌三角刀切下斜面的一部分，使得不菌丝造成损坏。另外，接种的密度为锯末培养基表面积的20％～30％。在24℃条件下培养，3天后(最迟5天后)产生生物体，30天后三角瓶锯末培养基长满菌丝。

(2)菌丝体的出现

制备与(1)相同的锯末培养基，将该培养基放入聚丙烯制瓶中，塞住瓶盖，通过高压釜在121℃高压蒸汽灭菌40分钟。灭菌24小时后，在完成无菌处理的无菌箱内通过无菌操作将(1)培养的种菌接种到聚丙烯制瓶的锯末培养基。应予说明，接种的密度为几乎覆盖锯末培养基表面积的程度。在24℃条件下培养，48小时后产生生物体，60天后聚丙烯制瓶内的整个锯末培养基长满菌丝。再经过40天～50天，菌丝在聚丙烯制瓶的内壁展开，形成菌丝束，如果进一步继续培养则形成菌丝体。

(制造例3)

<担子菌X的干燥粉末的制造>

为了破坏菌丝的细胞壁，使细胞内容物容易渗出，将制造例2得到的新鲜担子菌X的菌丝体冷冻·冻结，常温解冻冻结的担子菌X的菌丝体，利用搅拌机粉碎，干燥粉碎物，加工成粉末(以下，称为“担子菌X的干燥粉末”)。

(制造例4)

<担子菌X的提取组合物干燥粉末的制造>

称取制造例3得到的担子菌X的干燥粉末(干燥重量4kg)，添加水20L后，一边适当搅拌一边静置培养4～6小时。然后，通过抽滤除去固体物质(以下，称为“担子菌X的提取残渣”)，得到担子菌X的提取组合物17.6kg(固体物质：8.0％)。最后在-40℃预冻后，供于冻结干燥(以下，称为“担子菌X的提取组合物干燥粉末”)。

(制造例5)

<通过浓缩担子菌X的提取组合物的煎煮的制造>

为了破坏菌丝的细胞壁，使细胞内容物容易渗出，将新鲜担子菌X的菌丝体冷冻·冻结，常温解冻冻结的担子菌X的菌丝体，利用搅拌机粉碎。将粉碎担子菌X的菌丝体50g放入玻璃瓶中，添加水250ml，塞住瓶盖，在锅底部敷上毛巾后注水，放置装有粉碎菌丝体的玻璃瓶并加热煮沸，煮沸后继续加热90分钟。冷却后进行固液分离，得到担子菌X的提取组合物。此外，提取液的pH为6.3～6.5。

将得到的担子菌X的提取组合物转移至烧杯中，加热蒸发进行浓缩。提取组合物由浅驼色变为棕色并开始强烈起泡，进一步继续蒸发浓缩。在变成pH4.9、密度1.25g/cm³的焦油状的时刻，结束浓缩。该浓缩担子菌X的提取组合物散发出酱油样香气。此外，该时刻的来自担子菌X的菌丝体的浓缩担子菌X的提取组合物的收率为12％。伴随担子菌X的提取组合物冷却，粘性变得非常高，因此在结束浓缩的同时转移至保存容器中，直接冷却后，冷冻·冻结保存。

(制造例6)

<通过担子菌X的提取组合物的煎煮的制造>

为了破坏菌丝的细胞壁，使细胞内容物容易渗出，将新鲜担子菌X的菌丝体冷冻·冻结后，常温解冻冻结的担子菌X的菌丝体。

称取该解冻后的担子菌X的菌丝体(湿重20g)，将切成0.5cm见方的担子菌X的菌丝体放入烧杯中，添加水100ml后在90℃轻微煮沸，直至溶液变为最初量的1/2。然后添加水恢复至原始容量，利用纱布过滤除去固体物质。最后在-40℃预冻后，供于冻结干燥(以下，称为“担子菌X的热水提取组合物干燥粉末”)。随后密封，保存在冰箱的组合物作为制造例6的担子菌X的提取组合物。

(试验例1)

利用50％二甲亚砜(DMSO)水溶液稀释作为受试物质的制造例6得到的担子菌X的热水提取组合物干燥粉末，同时制备合计5个浓度(0.3、0.6、1.2、2.4、4mg/mL)的受试液1-5，如以下所示评价各种浓度对以N-琥珀酰基-Ala-Ala-Ala-4-硝基苯胺为底物的弹性蛋白酶活性产生的效果。

在1.5mL微管中添加50μL的受试液1-5或对照、50μL的1.25μg/mL的弹性蛋白酶(CAS No.39445-21-1,Sigma-Aldrich,USA)溶液、100μL的N-琥珀酰基-Ala-Ala-Ala-4-硝基苯胺(CAS No.5229914-6,Sigma-Aldrich,USA)溶液，添加50％DMSO水溶液，将受试物质的终浓度制备成75、150、300、600、1000μg/mL作为反应液。对照使用超纯水。另外，n＝3。

利用涡旋振荡器振荡各反应液30秒后，在37℃孵育15分钟。空白使用0.05M的Tris-HCl缓冲液代替弹性蛋白酶。利用涡旋振荡器振荡1.5mL微管10秒，在12000×g、室温离心2分钟。

通过以下数学式从受试物质、对照的OD₅₁₇计算受试物质的弹性蛋白酶活性率和弹性蛋白酶活性抑制率。

活性氧残留率(％)＝(S-SB)/(C-CB)×100

活性氧清除率(％)＝{(C-CB)-(S-SB)}/(C-CB)×100

C：对照的OD₅₁₇ CB：对照的空白OD₅₁₇

S：受试物质的OD₅₁₇ SB：受试物质的空白OD₅₁₇

将对照的弹性蛋白酶活性率设置为100％的受试物质的弹性蛋白酶活性率、弹性蛋白酶活性抑制率的平均和标准偏差示于表2，将弹性蛋白酶活性率的柱状图示于图1。通过统计计算，与对照相比有显著性差异的组标记星号(*)。

【表2】

结果证实，与对照相比，应用担子菌X的热水提取组合物干燥粉末时，弹性蛋白酶活性抑制率显著增加。

(试验例2：生发试验)

将作为受试物质的制造例6得到的担子菌X的热水提取组合物干燥粉末制成1％水溶液、3％水溶液、0.3％水溶液，如以下所示，进行生发试验。

试验使用C57/BL 7周龄♀小鼠，剃除背毛，准备4组，每组7～8只。

第一组为对照，第二组每天涂布一次1％水溶液，第三组每天涂布一次3％水溶液，第四组自由摄入0.3％水溶液。

将12天后的照片示于图2～图5。另外，按1～10阶段将生发程度数值化统计，将得到的生发分数示于图6。

其结果，可确认到：第二组～第四组与对照组相比，显著发挥出生发效果。通过统计计算，与对照相比有显著性差异的组标记星号(*)。

保藏编号

担子菌X(Basidiomycetes-X)FERM BP-10011

关于微生物的说明

保藏机构名称：国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心

保藏机构的地址：日本国千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8 120号室

保藏于保藏机构的日期：2003年2月27日

保藏机构的保藏编号：FERM BP-10011。

PCT/RO/134表