一种含石油烃废水处理工艺
阅读说明：本技术 一种含石油烃废水处理工艺 (Treatment process of petroleum hydrocarbon-containing wastewater ) 是由 梁国斌 吴晶晶 印霞棐 林伟 单旋 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含石油烃废水处理工艺,属于微生物法处理废水领域此两株菌株能够适应含石油烃的环境,且生长繁殖良好,并对废水中的机油成分有很好的降解清除作用,降解率最高可达到87.87％。因此,本发明的两株菌株能够适应含石油烃废水的恶劣环境,能够应用于处理含石油烃废水,并且有利于生态环境的可持续发展。(The invention discloses a process for treating waste water containing petroleum hydrocarbon, which belongs to the field of waste water treatment by a microbiological method, and the two strains can adapt to the environment containing petroleum hydrocarbon, have good growth and reproduction, have good degradation and removal effects on engine oil components in the waste water, and have the highest degradation rate of 87.87%. Therefore, the two strains of the invention can adapt to the severe environment of the waste water containing petroleum hydrocarbon, can be applied to the treatment of the waste water containing petroleum hydrocarbon, and is beneficial to the sustainable development of the ecological environment.)
技术领域
本发明涉及一种含石油烃废水处理工艺，属于微生物法处理废水领域。
背景技术
随着世界工业的迅猛发展，石油资源被广泛利用。海上石油资源的开采、运输，以及石油泄漏事故等事件的频发，严重污染海洋环境，破坏海洋系统的生态平衡，威胁人类的生命健康。在生态环境保护部发布的《2018年中国海洋生态环境状况公报》中显示，2018年夏季劣四类水质海域面积约为3.3万km2，主要超标物质是活性磷酸盐、无机氮以及石油类物质；《2018年中国生态环境状况公报》中的海洋章节中提到，石油类物质是海水中的重要污染物之一，严重地威胁了海洋生态平衡。
目前，常用的海洋石油烃类污染物质的降解处理方法可分为物理法、化学法和生物法三大类。生物法主要指生物修复(biOremediation)，是利用具有氧化和分解石油能力的自然存在于海洋或者土壤中的微生物，并且能以石油烃类化合物作为碳源很能量来源，最终生成H2O和CO2的过程。生物方法是彻底清除油污的重要途径，与物理、化学方法相比，生物法[10]对人和环境造成的影响很小，且修复处理费用仅为传统物理、化学处理修复的30％、50％。生物法以其投入小、无二次污染且可以定点修复的优势被视为最有前途的环境治理手段。
发明内容
本发明提供了一种微嗜酸寡养单胞菌，已于2021年5日6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22273。
本发明提供了一种苍白杆菌属，已于2021年5日6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22274。
本发明还提供一种菌剂，含有上述的微嗜酸寡养单胞菌或上述的苍白杆菌属的活菌体。
本发明还提供上述的微嗜酸寡养单胞菌和/或上述的菌剂在降解石油烃中的应用。
本发明还提供上述的苍白杆菌属和/或上述的菌剂在降解石油烃中的应用。
在一种实施方式中，石油烃源为含石油烃的废水。
在一种实施方式中，所述废水中的石油烃的浓度≥10g/L。
在一种实施方式中，所述废水中的石油烃的浓度≥20g/L。
本发明还提供一种降解石油烃的方法，所述方法为将上述的微嗜酸寡养单胞菌或上述的苍白杆菌属和/或上述的菌剂以体积比10～50％添加量加入含石油烃的样品，以降解石油烃。
在一种实施方式中，所述的微嗜酸寡养单胞菌或苍白杆菌属和/或菌剂的菌浓OD600为1.3～1.5。
在一种实施方式中，降解的时间为15～36h。
在一种实施方式中，降解的时间为24～30h。
在本发明的一种实施方式中，所述处理条件均为：温度25～40℃，0～200r/min。
在一种实施方式中，所述样品为含石油烃的废水。
在一种实施方式中，所述废水中的石油烃的浓度≥10g/L。
本发明还提供所述微嗜酸寡养单胞菌和/或菌剂在制备污水处理剂中的应用。
本发明还提供所述苍白杆菌属和/或菌剂在制备污水处理剂中的应用。
本发明提供了微嗜酸寡养单胞菌的培养方法。
在一种实施方式中，所述方法为将微嗜酸寡养单胞菌以体积比为1～5％的接种量接种至培养基中培养24～48h。
在一种实施方式中，所述培养的条件为pH为6.0～7.5，转速为140～180r/min，温度28～35℃。
本发明提供了苍白杆菌属的培养方法。
在一种实施方式中，所述方法为将苍白杆菌属以体积比为1～5％的接种量接种至培养基中培养24～48h。
在一种实施方式中，所述培养的条件为pH为6.0～7.0，转速为140～180r/min，温度28～32℃。
本发明的有益效果：
本发明从含石油烃废水中分离出两株菌株，此两株菌株均能够在含石油烃环境中生长繁殖，并且其对含石油烃废水中对环境有害的物质都能有一定的降解作用，对机油类物质有良好的降解效果，微嗜酸寡养单胞菌的石油烃降解率最高达87.87％，苍白杆菌属的石油烃降解率最高达42.41％。因此，本发明的两株菌株均能够适应含石油烃废水的恶劣环境，有利于生态环境的可持续发展。
生物材料保藏
1、一株微嗜酸寡养单胞菌，分类学命名为Stenotrophomonas acidaminiphila，已于2021年5日6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22273，保藏地址为中国科学院微生物研究所。
2、一株苍白杆菌属，分类学命名为Ochrobactrum daejeonense，已于2021年5日6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22274，保藏地址为中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为微嗜酸寡养单胞菌落形态及细胞形态图；A为菌落形态，B为细胞形态图。
图2为苍白杆菌落形态及细胞形态图；A为菌落形态，B为细胞形态图。
具体实施方式
LB培养基：胰蛋白胨(10g)，酵母浸出粉(5g)，氯化钠(10g)，水(1L)。
机油含量的测定方法：重量法测定废水中的含油量，具体方法是①硫酸酸化样品：+5mL50％(v/v)硫酸溶液。②将酸化的样品倒入250mL的分液漏斗中，再+25mL石油醚(60℃-90℃)，震荡2min后静置带其分层。收集上层液，下层液接入原锥形瓶中。③下层液用石油醚重复提取2次，每次用25mL石油醚，将3次所得上层液即石油醚提取液合并。④向石油醚提取液中+无水硫酸钠(脱水)，轻轻摇动至不结块为止，加盖放置1h。⑤用预先石油醚洗涤过的定性滤纸过滤，收集滤液于经烘干恒重的100mL烧杯中。⑥将烧杯置于65±1℃恒温水浴锅上蒸发至近干，取出擦干，放置于65±1℃烘箱内1-2h，冷却30min后称重。⑦降解率＝(空白样残余油量-样品残余油量)×100％/初始加入的含油量。
实施例1：菌株的筛选
1、样品采集
将从常州市污水处理厂取得的污泥投入模拟含石油烃污染物质的海水中，进行筛选、分离和驯化培养。
具体步骤如下：称取1g石油污染土壤和5mL的活性污泥加入到已灭菌的含油量为2％的100mL液体培养基中，在140r/min、30℃摇床震荡培养5d后，从中移取4mL悬浮液加至新的已灭菌的含油量为2％的100mL的液体培养基中继续培养，连续重复驯化6次。取重复驯化培养6次后的菌液，稀释后涂布与固体LB培养基平板上，于37℃恒温培养箱中培养24h后观察，挑取不同形态和颜色的单菌落在新的固体LB培养基平板上连续划线培养3次，挑取分离得到的单菌落于新的已灭菌的液体培养基中继续培养。
2、菌株的分离纯化
在100mL的驯化液体培养基中华加入5mL的污泥，在37℃、140r/min的条件下振荡培养5d后，取5mL的培养液于新的驯化液体培养基中震荡5d，重复5次后取培养好的菌液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液，涂布于LB固体培养基上，倒置培养4d的到单菌落。挑取长势优越的菌株保存于-80℃甘油管。经过多次驯化，最终仅分离纯化得到两株菌株。
3、菌种保藏与鉴定
(1)菌种保藏：斜面保藏于中国科学院微生物研究所。
(2)菌种鉴定：菌株由生工生物工程(上海)股份有限公司经16s RNA鉴定为微嗜酸寡养单胞菌和苍白杆菌属，菌落形态及细胞形态图见图1和图2。
实施例2：菌株耐盐性优化
(1)将实施例1筛选、分离获得的微嗜酸寡养单胞菌CGMCC No.22273和苍白杆菌属CGMCC No.22274分别以体积比为2％的接种量接种至100mL LB液体培养基中，在35℃、180r/min的自然pH条件下培养；
(2)分别在含盐量1％、2％、3％、4％和5％的培养基中，震荡连续培养48h；
(3)每隔6h测量不同含盐量培养基中的OD600。
如表1所示微嗜酸寡养单胞菌CGMCC No.22273在不同盐度的培养基中的OD600值，相比较而言其在盐度为1％～3％的条件下更早进入对数期，因此其最适宜的盐度为1％～3％之间。
表1 微嗜酸寡养单胞菌在不同盐度下的OD600
如表2所示苍白杆菌属CGMCC No.22274在不同盐度的培养基中的的OD600值，相比较而言其在盐度为1％～3％的条件下更早进入对数期，因此其最适宜的盐度为1％～3％之间。
表2 苍白杆菌株在不同盐度下的OD600
实施例3：菌株在不同pH下培养
(1)将实施例1获得的两株菌株分别以2％的体积比接种量接种至100mL的LB液体培养基中，在35℃、180r/min以及盐度为3％的条件下培养；
(2)分别在初始pH为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的LB液体培养基中，连续震荡培养48h；
(3)间隔6h测量不同初始pH培养基中的OD600值。
如表3所示微嗜酸寡养单胞菌在初始pH为6.0～7.5的条件下较早进入生长对数期，因此其较适宜的初始pH范围在6.0～7.5之间。
表3 微嗜酸寡养单胞菌在不同初始pH下的OD600值
如表4所示苍白杆菌属在初始pH为6.0～7.0的条件下较早进入生长对数期，因此其较适宜的初始pH范围在6.0～7.0之间。
表4 苍白杆菌属在不同初始pH下的OD600值
实施例4：菌株的在不同转速下培养
(1)将实施例1获得的两株菌株分别以2％的体积比接种量接种至100mL的LB液体培养基中，在35℃、盐度为3％的条件下培养；
(2)分别在摇床转速为0r/min、100r/min、140r/min和180r/min的LB液体培养基中，连续震荡培养48h。
(3)间隔6h测量不同摇床转速培养基中的OD600值。
如表5所示微嗜酸寡养单胞菌在转速为140r/min的条件下最早进入微生物生长对数期，因此其最适摇床转速为140r/min。
表5 微嗜酸寡养单胞菌在不同转速下的OD600值
如表6所示苍白杆菌属在转速为140r/min的条件下最早进入微生物生长的对数期，因此其最适摇床转速为140r/min。
表6 苍白杆菌属在不同转速下的OD600值
实施例5：菌株在不同温度下培养
(1)将实施例1获得的菌株分别以体积比2％的接种量接种至100mL的LB液体培养基中，在盐度为3％、转速为140r/min的条件下培养；
(2)分别在温度为25℃、28℃、30℃、32℃和35℃的LB液体培养基中，连续震荡培养48h。
(3)间隔6h测量不同温度培养基中的OD600值。
如表7所示微嗜酸寡养单胞菌在28℃～35℃的温度下较早进入生长对数期，因此相比较而言其适宜的温度范围为28℃～35℃。
表7 微嗜酸寡养单胞菌在不同温度下的OD600值
如表8所示苍白杆菌属在28℃～32℃的温度下较早进入生长对数期，因此相比较而言其适宜的温度范围为28℃～32℃。
表8 苍白杆菌属在不同温度下的OD600值
实施例6：菌株降解石油烃废水的应用
(1)菌株培养：将实施例1获得的微嗜酸寡养单胞菌、苍白杆菌属分别以体积比2％的接种量分别接种至100mL LB液体培养基中，在32℃、盐度为3％以及转速为140r/min的条件下震荡培养，培养48h后使得培养基中菌液浓度达到OD600在1.5左右；
(2)废水处理：配制机油含量为6927mg/L的水模拟含石油烃废水，将步骤(1)培养48h后的单独的微嗜酸寡养单胞菌、苍白杆菌属的菌液和按等体积混合的菌液，分别以含石油烃废水体积的10％、30％、50％的量投加到含石油烃废水，进行处理。
(3)结果测定：测定污水前后含机油量的变化，计算得到石油烃的降解率，选择出最佳的菌株组合。
由表9和10可知，步骤(1)制备的微嗜酸寡养单胞菌的投加量为废水体积的50％时，降解石油烃类物质的效率达到最大，为87.87％；苍白杆菌属同样在投加量为废水体积的50％时，降解率达到最大，为42.41％。混合菌的降解效率没有单菌种的降解效果理想，所以处理含石油烃废水的最佳菌株组合是两株各自进行降解处理。
表9 微嗜酸寡养单胞菌和苍白杆菌48h后的降解率(％)
表10 微嗜酸寡养单胞菌与苍白杆菌属按体积比1:1的混合量对石油烃的降解率
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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