菌株Rhodanobacter sp.LX-100及其在氧化有机硒或单质硒中的应用
阅读说明：本技术 菌株Rhodanobacter sp.LX-100及其在氧化有机硒或单质硒中的应用 (Rhodanobacter sp.LX-100 strain and application thereof in oxidizing organic selenium or elemental selenium ) 是由 郑世学 李明顺 王革娇 安立进 罗雄 汪依婷 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于农业微生物技术领域,具体公开了菌株Rhodanobacter sp.LX-100及其在氧化有机硒或单质硒中的应用,所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2021544。该菌对单质硒以及硒代蛋氨酸(SeMet)均具有氧化作用。LX-100菌株能在120 h将初浓度100μM的SeMet转化生成12μM左右的Se(Ⅳ),还能在120 h将过量单质硒(Se(0))氧化生成100μg/L左右的Se(Ⅳ)。因此,LX-100菌株不仅具有将有机硒SeMet氧化为Se(Ⅳ)的能力,而且具有将单质硒氧化成Se(Ⅳ)的能力,在土壤有机硒转化、单质硒氧化及植物富硒方面具有很好的应用前景。(The invention belongs to the technical field of agricultural microorganisms, and particularly discloses a strain Rhodanobacter sp.LX-100 and its application in oxidizing organic selenium or simple substance selenium, the preservation number of the strain is CCTCC NO: m2021544. The strain has oxidation effect on elemental selenium and selenomethionine (SeMet). LX-100 strain can convert SeMet with the initial concentration of 100 mu M into Se (IV) with the concentration of about 12 mu M within 120h, and can oxidize excessive elemental selenium (Se (0)) into Se (IV) with the concentration of about 100 mu g/L within 120 h. Therefore, the LX-100 strain not only has the capacity of oxidizing the organic selenium SeMet into Se (IV), but also has the capacity of oxidizing the simple substance selenium into Se (IV), and has good application prospects in the aspects of soil organic selenium conversion, simple substance selenium oxidation and plant selenium enrichment.)
技术领域
本发明属于农业微生物
技术领域
，涉及菌株Rhodanobacter sp.LX-100及其在氧化有机硒或单质硒中的应用。背景技术
硒(Se)位于元素周期表第Ⅵ主族，在自然界中以Se(-Ⅱ)、Se(0)、Se(Ⅳ)及Se(Ⅵ)四种价态的形式存在。Se(-Ⅱ)主要是有机硒，常见于生物体内，如生物体内重要的硒代半胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、一甲基硒(CH3-Se)、二甲基硒(CH3-Se-CH3)和甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)等。Se(Ⅳ)及Se(Ⅵ)是主要的无机硒，多存在于非生物体，通常以含氧阴离子存在，如亚硒酸盐(SeO3 2-)和硒酸盐(SeO4 2-)，是植物吸收利用硒的主要来源，而土壤有机硒约占总硒56–81％，其中SeMet约占有机硒的60％。化学单质硒Se(0)在自然界中较少见，多数存在于富硒矿中。
目前强化植物富硒的方法有多种，应用最为广泛的是通过土壤施硒、叶面喷硒及拌种等方式。土壤中含有单质硒、亚硒酸盐、硒酸盐和有机硒等，植物主要吸收亚硒酸盐和硒酸盐。因此，在土壤中添加微生物，使其将大量的有机硒转化成生物可利用的状态或氧化硒，进而增加植物对硒的吸收，是一种安全可靠、成本低廉的方式。
微生物还原硒酸盐和亚硒酸盐的报道较多，硒还原的机制已得到较好解释，而微生物氧化硒的研究却鲜有报道。申请人前期分离鉴定到两株具有单质硒氧化作用的柄杆菌T5M6及根瘤菌T3F4，两菌株均能将不可溶的化学单质硒或硒矿粉氧化成可溶的四价硒，进而被植物吸收并利用，促进小白菜富硒；均已获国家发明专利。除此以外，鲜有关于微生物将硒氧化后促进植物富硒的报道。
Rhodanobacter属的部分菌株具有脱氮以及降解苯甲醚的功能，目前没有关于其在硒的氧化方面的报道。
而本发明提供的Rhodanobacter sp.LX-100对单质硒及有机硒都具有良好的生物氧化功能，Rhodanobacter sp.LX-100既能氧化单质硒，又能氧化硒代蛋氨酸，因此其在富硒或贫硒土壤中能更有效的将单质硒或有机硒氧化为可溶的四价硒，对促进植物富硒具有很好的应用潜力，该菌株可作为研究硒氧化及生物富硒的良好材料。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株分离的菌株Rhodanobacter sp.LX-100，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M 2021544。
本发明的另一个目的在于提供了Rhodanobacter sp.LX-100在硒氧化中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人从中国湖北省恩施州富硒土壤中分离、筛选到一株具有氧化有机硒和单质硒能力的菌株Rhodanobacter sp.，该菌株已于2021年5月17日送至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021544，分类命名：Rhodanobacter sp.LX-100，地址：中国武汉武汉大学。
Rhodanobacter sp.LX-100的培养特性如下：
Rhodanobacter sp.LX-100的细胞形态为杆状，长1.4-1.5μm，宽0.2-0.4μm，在R2A琼脂平板培养基上28℃培养72h，菌落呈黄色，圆形，隆起，边缘完整光滑。
Rhodanobacter sp.LX-100在硒氧化中的应用，包括以Rhodanobacter sp.LX-100作为有效成分之一或是唯一有效成分，制备成硒氧化剂，特别是用于有机硒和单质硒的氧化。
本发明的保护内容还包括Rhodanobacter sp.LX-100制备成植物富硒剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明获得的一株Rhodanobacter sp.LX-100，具有将有机硒SeMet氧化生成亚硒酸盐的能力，属首次发现。土壤硒中含量最多的为有机硒，氧化有机硒成为植物容易利用的四价硒，可促进植物富硒。
(2)本发明的LX-100能将不溶态的单质硒氧化成植物可吸收利用的亚硒酸盐的能力，从而促进植物富硒；是对有限的硒氧化菌株资源的补充。
(3)本发明的菌株LX-100能同时氧化Se(-Ⅱ)和Se(0)生成Se(Ⅳ)的菌株，具有硒转化模式菌株的科研意义及农业应用潜力。
(4)本发明提供了一种利用有益微生物促进植物富硒的新方式，安全、环保。
附图说明
图1为菌株LX-100显微透射电镜图。
图2为菌株LX-100生长曲线示意图；
其中：Control表示不加硒时菌株LX-100的处理对照；
100μM SeMet表示培养基中添加了终浓度为100μM SeMet后的菌株LX-100生长曲线；
100μM Se(Ⅳ)表示培养基中添加了终浓度为100μM Se(Ⅳ)后的菌株LX-100生长曲线；
0.1g L-1Se(0)表示培养基中添加了终浓度为0.1g L-1Se(0)后的菌株LX-100生长曲线。图3为菌株LX-100对SeMet转化示意图。
其中：A是菌株LX-100将SeMet氧化为Se(Ⅳ)的氧化曲线；
B是菌株LX-100转化利用SeMet效率图；
100μM SeMet表示未接菌的对照，100μM SeMet LX-100表示接种LX-100处理。图4为菌株LX-100对单质硒的氧化示意图。
0.1g L-1Se(0)表示未添加菌株LX-100的对照处理；
0.1g L-1Se(0)表示添加菌株LX-100表示后体系中Se(Ⅳ)浓度随时间变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：
菌株LX-100的分离、鉴定
(1)样品采取：申请人于2018年10月从湖北省恩施土家族苗族自治州富硒地区表层土壤中采集到本发明所用的富硒土样。
(2)菌体分离纯化：称取土样10g于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，置28℃摇床中振荡半小时，再依次取1mL加入到9mL无菌生理盐水中逐步稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，分别取0.1mL涂布于0.5mM Se(Ⅳ)R2A固体培养基中，每个梯度涂3个平板，置28℃恒温培养一周，挑取未发生硒还原产红色纳米硒(即未变红)的菌落，初步断定为不还原硒菌株，方便后期做硒氧化菌株的筛选。挑取单菌落划线纯化。纯化后按50％甘油:菌液(体积比1:1)保存于螺口管中，-80℃保藏。
(3)硒转化、氧化菌的筛选：菌株按1％接种量加入终浓度分别为0.1g L-1单质硒粉和100μM SeMet的R2A液体培养基(培养基灭菌处理)，28℃，150rpm摇床培养120h，中间定点取样(上清)。将所得上清液于12000rpm离心10min，使用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪(HPLC-HG-AFS)分别检测Se(Ⅳ)的含量和SeMet含量或转化为其他有机硒含量。若Se(Ⅳ)含量明显增加，说明该菌对单质硒具有氧化性；若SeMet含量减少或者其他有机硒含量增加，说明该菌对SeMet具有同化转化的能力。
(4)硒氧化菌的分类鉴定：对获得的菌株进行16S rRNA基因测序并构建其系统进化树，结合其生理生化特征，为Rhodanobacter sp.。该菌株已于2021年5月17日送往中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，分类命名：Rhodanobacter sp.LX-100，保藏编号为CCTCCNO：M 2021544地址：中国·武汉·武汉大学。
Rhodanobacter sp.LX-100的细胞形态为杆状，长1.4-1.5μm，宽0.2-0.4μm，在R2A琼脂平板培养基上28℃培养72h，菌落呈黄色，圆形，隆起，边缘完整光滑(图1)。
(5)生长曲线：菌株按1％接种量加入终浓度分别为100μM SeMet、100μM Se(Ⅳ)或0.1gL-1单质硒粉于50mL R2A液体培养基，每个处理3重复，以不额外加硒R2A液体培养基为对照，28℃150rpm摇床培养，每隔12h取样2mL用紫外分光光度计测定菌体生长浓度OD600值，绘制生长曲线如图2所示。
实施例2：菌株LX-100对SeMet的氧化曲线
具体步骤如下所述：
(1)准备3瓶已灭菌的R2A液体培养基，每瓶50mL。各加入已过滤灭菌的SeMet使其终浓度为100μM。接种对数期(OD600值约0.8)LX-100菌液，接种量1％。混匀后立刻取样2mL，该样作为首次取样，置于干净的离心管中。置于28℃，150rpm恒温摇床中培养。每隔12h取样，该实验设置三重复，以不加菌株LX-100，仅加相同终浓度的SeMet的R2A液体培养基为对照。取样结束后样品作以下处理。
(2)每次取的样品2mL，12000rpm离心10min，上清液过0.22μm的滤膜于-20℃冰箱保存。
(3)用北京吉天仪器有限公司HPLC-HG-AFS检测样品中SeMet的含量及其他有机硒含量。
(4)以测得SeMet(μM)或Se(IV)为纵坐标，时间为横坐标构建SeMet转化曲线图(图3)。
(5)如图3所示，LX-100具有较强的SeMet氧化能力，样品上清液中Se(Ⅳ)含量呈不断增加的趋势，而SeMet含量呈不断下降趋势。第0h到第120h，上清液中Se(Ⅳ)含量不断增加，到120h为止，LX-100上清液中Se(Ⅳ)量达到了13.47±0.56μM(图3中A)，而多数SeMet被细胞吸收并同化利用(图3中B)。具体如下表：
实施例3：
菌株LX-100对单质硒的氧化曲线
具体步骤如下所述：
(1)准备3瓶已灭菌的R2A液体培养基，每瓶50mL。各加入已灭菌的单质硒粉，终浓度0.1g L-1。接种对数期(OD600值约0.8)LX-100菌液，接种量1％。混匀后立刻取样2mL，该样作为首次取样，置于干净的离心管中。置于28℃，150rpm恒温摇床中培养。每隔12h取样，该实验设置三重复，以不加菌株LX-100，仅加相同终浓度的单质硒的R2A液体培养基为对照。取样结束后样品作以下处理。
(2)每次取的样品2mL，12000rpm离心10min，上清液过0.22μm的滤膜于-20℃冰箱保存。
(3)用北京吉天仪器有限公司HPLC-HG-AFS检测样品中Se(Ⅳ)的含量。
(4)以测得Se(Ⅳ)浓度(μg L-1)为纵坐标，时间为横坐标构建单质硒氧化曲线图(图4)。
(5)如图4所示，样品上清液中Se(Ⅳ)含量呈不断增加的趋势，到120h为止，LX-100上清液中Se(Ⅳ)量达到了97.63±4.28μg L-1。