一种鞘脂菌CzL-01及其在CL-20降解中的应用
阅读说明：本技术 一种鞘脂菌CzL-01及其在CL-20降解中的应用 (Sphingolipid bacteria CzL-01 and application thereof in CL-20 degradation ) 是由 李存治 刘志永 高俊宏 高永超 赵彬 夏宝清 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于污染物处理技术领域,具体涉及一种鞘脂菌CzL-01(Sphingobium sp.)及其在CL-20降解中的应用,所述鞘脂菌CzL-01已于2020年08月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.20540。本发明提供的CzL-01可有效降解CL-20,可在48h内将100μg/mL的CL-20降解完全,进而使我国的CL-20做到环保无毒生产和使用。(The invention belongs to the technical field of pollutant treatment, and particularly relates to sphingolipid bacteria CzL-01(Sphingobium sp.) and application thereof in CL-20 degradation, wherein the sphingolipid bacteria CzL-01 are preserved in China general microbiological culture Collection center (CGMCC) at 24.08.2020, and the preservation number is CGMCC No. 20540. The CzL-01 provided by the invention can effectively degrade CL-20 and can completely degrade 100 mu g/mL of CL-20 within 48h, so that the CL-20 in China can be produced and used in an environment-friendly and nontoxic manner.)
技术领域
本发明属于污染物处理
技术领域
，具体涉及一种鞘脂菌CzL-01及其在CL-20降解中的应用。背景技术
CL-20(六硝基六氮杂异伍兹烷，2,4,6,8,10,12-hexanitro-2,4,6,8,10,12-hexaazaisowurtzitane)是一种具有复杂笼型结构的多环硝基化合物，与传统含能材料三硝基甲苯(TNT)、环三亚甲基三硝胺(RDX)和环四亚甲基四硝胺(HMX)具有相似分子结构，上述物质结构见说明书附图1-4。自1987年合成以来，由于其优越的爆炸性能，近年来受到广泛关注。研究表明，CL-20的密度、爆速、爆压和能量密度均高于RDX和HMX，同时还具有良好的热稳定性。由CL-20作为主要配方能显著提升弹药的比冲、燃烧速度和爆能，在火药、发射药、推进剂等领域均具有广阔的应用前景。许多欧美发达国家已将CL-20的合成和应用列入关键军事研究技术，并有望作为RDX和HMX的替代材料。
迄今，有关CL-20的研究主要集中在化工领域和生物毒性领域，对于其化工领域研究已经比较清晰，从力学性能研究、铸装工艺安全性到基础应运研究都有详细的资料。但对CL-20的健康和环境影响研究报道较少，而由于其结构与TNT、RDX和HMX较为相似，推测其可能具有相近的毒性效应。我们在前期对CL-20的毒性进行了系统研究，发现其可诱发小鼠微核率升高，并可造成染色体损伤和形成非整倍体。致畸试验结果表明，CL-20对孕鼠有毒性作用。有研究者发现，与RDX、HMX、TNT等含能材料相比，CL-20对蚯蚓、土壤微生物具有更大的毒性，0.02mg/kg的CL-20就可造成土壤中蚯蚓密度大量减少。一项关于鸟类的急性经口毒性试验表明，CL-20对动物体重有影响，呈明显剂量效应关系，且对肝脏有毒性作用。由于CL-20的广泛使用和对土壤环境、水体环境及人体的明显危害性，近年来限制着国内外对CL-20的生产使用，
现有技术对于环境中污染物的处理包括化学方法、物理方法及生物手段，其中物理方法(如掩埋、公海倾倒、过滤等)对环境构成更加巨大的污染。化学方法(如沉淀法、还原法、氧化法、萃取法等)反应复杂困难，成本消耗巨大。微生物降解技术是利用细菌等微生物产生的酶对含能材料污染物进行转化和稳定，使之无害化的处理方法，有效的克服了化学和物理技术处理环境污染的二次污染、成本昂贵的缺点，是消除含能材料CL-20对环境污染和残留的有效途径之一。
然而，目前关于CL-20微生物降解的研究较少，缺乏可有效降解CL-20的微生物。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鞘脂菌CzL-01及其在CL-20降解中的应用，所述鞘脂菌CzL-01能够在真实环境条件下高效降解CL-20。
本发明的第一个目的是提供一种鞘脂菌CzL-01，所述鞘脂菌CzL-01已于2020年08月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20540。
优选的，上述鞘脂菌CzL-01，所述鞘脂菌CzL-01置于21-37℃液体环境中振荡培养22-28h，达到稳定期。
本发明的第二个目的是提供一种所述的鞘脂菌CzL-01的含能材料降解剂。
优选的，上述鞘脂菌CzL-01的含能材料降解剂中，所述含能材料降解剂为鞘脂菌CzL-01的固体或液体培养物。
本发明的第三个目的是提供一种鞘脂菌CzL-01的应用，将所述鞘脂菌CzL-01或者所述含能材料降解剂用于降解含能材料。
优选的，上述鞘脂菌CzL-01的应用中，所述含能材料中包括六硝基六氮杂异伍兹烷、三硝基甲苯、环三亚甲基三硝胺和环四亚甲基四硝胺中的一种或多种的组合。
优选的，上述鞘脂菌CzL-01的应用中，所述含能材料为含有六硝基六氮杂异伍兹烷的污染物。
优选的，上述鞘脂菌CzL-01的应用中，所述污染物为土壤或者水。
本发明的第四个目的是提供一种降解含能材料的方法，将鞘脂菌CzL-01或者含有鞘脂菌CzL-01的培养物添加到包括六硝基六氮杂异伍兹烷、三硝基甲苯、环三亚甲基三硝胺和环四亚甲基四硝胺中的一种或多种的组合的含能材料中。
优选的，上述降解含能材料的方法，将鞘脂菌CzL-01或者含有鞘脂菌CzL-01的培养物添加到含有六硝基六氮杂异伍兹烷的污染物中。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对含能材料CL-20在生产、使用和存放过程中产生的残留物、废水废渣和爆炸后对土壤、水体环境等造成的污染，分离筛选出了一株可降解CL-20的细菌，为CL-20造成的土壤和水体环境污染做好修复处理提供技术支持，为我国CL-20在大量的生产和使用后提供“后勤保障”。
本发明利用微生物降解技术手段来降解CL-20，微生物降解技术是近年来发展迅猛的一种处理污染物的技术。该方法环保无毒、效果好，能降解目前世界上几乎所有的有机物，为目前绝大部分的处理工厂所广泛使用。高效微生物降解菌能有效提高生物降解法的处理效率，是生物处理方法的有效补充和强化，在该行业中已有成功的先例，但目前国内还鲜有利用微生物降解土壤水体环境中CL-20的报道。本发明提供的CzL-01可有效降解CL-20，可在48h内将100μg/mL的CL-20降解完全，进而使我国的CL-20做到绿色生产和使用。
生物材料保藏信息说明
CzL-01，已于2020年08月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20540，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，分类命名为鞘脂菌(Sphingobium sp.)。
附图说明
图1为TNT的化学结构图；
图2为RDX的化学结构图；
图3为HMX的化学结构图；
图4为CL-20的化学结构图；
图5为实施例2的CzL-01的在固体无机盐培养基上培养48h后的菌落形态；
图6为实施例2的CzL-01的革兰氏染色图；
图7为实施例2的CzL-01的16s rDNA测序PCR产物电泳图；
图8为实施例2的CzL-01的系统发育树；
图9为实施例3的不同温度条件下CzL-01生长情况；
图10为实施例3的不同pH值条件下CzL-01生长情况；
图11为实施例4的CzL-01降解CL-20趋势图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
实施例1CL-20的富集和筛选
从某CL-20生产企业的污水处理厂曝气池中收集活性污泥，加入蒸馏水制成悬浊液。将悬浊液加入以CL-20为唯一碳氮源的无机盐液体培养基中，在28℃、150rpm恒温摇床中进行富集培养。每10天为一个周期，更换新的无机盐培养液，连续富集5代后，在严格压力条件下各种野生杂菌逐渐减少，获得相对单一的能够以CL-20为唯一碳氮源的菌液。将第五代培养瓶中的菌液划线接种于无机盐固体培养基中，28℃恒温培养48h后，挑取单菌落接种至液体培养基中，28℃、150rpm恒温摇床继续培养48h；如此反复4～5次，得到1株纯化的降解菌，命名为CzL-01。
其中，无机盐培养基(g/L)：KH2PO4 1.5g，Na2HPO4·12H2O 3.8g，去离子水溶解后定容至1000mL，121℃下高温灭菌25min，之后分别加入10mL于121℃下高温灭菌25min的0.755g/L CaCl2，10mL过滤除菌的5g/L MgSO4·7H2O、0.152g/L MnSO4·H2O、0.5g/LFeSO4·7H2O混合物，10mL过滤除菌的10g/L溶于丙酮的CL-20。
实施例2菌株鉴定
(1)形态观察
肉眼观察无机盐固体平板(无机盐液体培养基加2％的琼脂粉)培养48h后的菌落形态。CzL-01为圆形，黄色，菌落约0.5mm～1mm，表面干燥，易挑起。见图5。单菌落在涂片后显微镜下进行形态观察，并进行革兰氏染色，呈短杆状，1～2μm，无鞭毛，为革兰氏阴性菌。见表1、图6。
表1 CzL-01在显微镜下形态
(2)16s rDNA鉴定
煮沸法提取细菌DNA模板：取200μL菌液于EP管中，离心后去上清用无菌水洗菌体2次，再加入50μL无菌水重新悬浮，沸水煮10min，冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清液转入离心管内，制成菌裂解液作为PCR模板，4℃条件下保存。
PCR反应体系50μL：Taq酶0.25μL、10×PCR Buffer 5μL、2.5mmol/L的dNTP 4μL、上游引物及下游引物各1μL(10mmol/L)、菌裂解液模板5μL、无菌去离子水33.75μL。
PCR条件：94℃预变性10min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次，72℃保存5min。
将PCR样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。引物序列为：
1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，SEQ ID NO.1；
7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’，SEQ ID NO.2。
CzL-01的16s rDNA测序结果大小为1432bp，见图7。与鞘脂菌Sphingobiumsp.MP9-4的亲缘关系最近，16s rDNA序列一致性为100％，并与Sphingobium sp.MP9-4聚集在同一个亚分支上，见图8。结合菌株的形态特征，确定该菌株为鞘脂菌属。
CzL-01细菌16s rDNA序列如下(SEQ ID NO.3)：
CTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGATCTTCGGATCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTGGGTTCGGAATAACTTCTGGAAACGGAAGCTAATACCGGATGATGACGTAAGTCCAAAGATTTATCGCCCAAGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTATTCAAGTCAGAGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGAAACTAGATAGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCAGGGCACATGGTGTTTTGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACGTTTGACATCCCTATCGCGGATCGTGGAGACACTTTCCTTCAGTTCGGCTGGATAGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGTACTCTAAAGGAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGACTACAGTGGGCAGCCACCTCGCGAGAGGGAGCTAATCTCCAAAAGTCGTCTCAGTTCGGATCGTTCTCTGCAACTCGAGAGCGTGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACTCGAAGGCGTTGAGCTAACCGTAAGGAGGCAGGCGACCACAGTGGGTTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG
实施例3 CL-20生长条件的测定
(1)实验方法
挑取在固体无机盐培养基上活化的单菌落，接种至25mL LB培养基中，37℃，150rpm摇床培养16h，至生长至对数期。取25μL菌液接种至新鲜的LB培养基中，采用比浊法检测在OD600下不同温度(21℃、28℃、37℃)及pH值(4.0、5.5、7.0、8.5、10.0)条件下细菌的生长情况。
(2)实验结果
采用比浊法监测在OD600下细菌生长情况。在37℃，150rpm条件下，细菌从10h开始生长，12到22h为对数生长期，之后进入稳定期；28℃和21℃条件下，细菌从12h开始生长，18到28h为对数生长期，之后进入稳定期；详见图9。根据上述试验结果，该菌株的最适生长温度为37℃。
采用比浊法检测不同pH值对细菌生长的影响，在37℃，150rpm条件下培养16h，结果显示该菌株在pH值分别为5.5和7时，OD600分别能达到0.764和0.610，在其它pH值条件下，细菌均未出现生长现象，详见图10。根据上述试验结果，该菌株的最适生长pH值为5.5～7。
实施例4CL-20降解CL-20能力检测
(1)实验方法
将CL-20配制成不同的浓度梯度的溶液，寻找最大吸收波长，绘制标准曲线。将纯化保存的鞘脂菌CzL-01划线活化于固体CL-20无机盐培养基中，37℃培养箱培养48h。挑取单菌落接种于50mL液体CL-20无机盐培养基中，于37℃，150rpm摇床上培养，期间每隔2h取样1mL，12000rpm离心5min，取上清检测在最大吸收波长下的吸光度值，根据标准曲线计算出底物浓度变化趋势。
(2)实验结果
通过检测，发现CL-20的最大吸收波长在230nm处，根据实验结果，CL-20可在48h内将100μg/mL的CL-20降解完全，结果见图11。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 兵器工业卫生研究所
<120> 一种鞘脂菌CzL-01及其在 CL-20降解中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggaggtgat ccagccgca 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagagtttga tcctggct 18
<210> 3
<211> 1432
<212> DNA
<213> 鞘脂菌Sphingobium sp.
<400> 3
ctggctcaga acgaacgctg gcggcatgcc taatacatgc aagtcgaacg agatcttcgg 60
atctagtggc gcacgggtgc gtaacgcgtg ggaatctgcc cttgggttcg gaataacttc 120
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ggaggcaggc gaccacagtg ggtttagcga ctggggtgaa gtcgtaacaa gg 1432
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