制备新材料的方法及获得的新材料和应用
阅读说明：本技术 制备新材料的方法及获得的新材料和应用 (Method for preparing new material, obtained new material and application ) 是由 杨青 陈磊 刘田 屈明博 杨君 于 2021-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种制备新材料的方法及获得的新材料和应用,涉及新材料制备的技术领域。上述制备新材料的方法包括以下步骤：在所述新材料中加入昆虫表皮蛋白,和/或加入所述昆虫表皮蛋白的功能性截短体、突变体、多肽中的至少一种。通过加入昆虫表皮蛋白的方式制备新材料,一方面充分利用了昆虫表皮蛋白的多种生理生化性质,另一方面昆虫表皮蛋白可以通过基因重组的方式获得,克服了现有技术中结构蛋白在制备材料中存在的诸多缺点。另外,本发明提供了薄膜材料、多孔支架材料、凝胶、团聚体等新材料,可以应用于包装、生物医学、环境和光学等领域,应用范围广。(The invention provides a method for preparing a new material, the obtained new material and application, and relates to the technical field of new material preparation. The method for preparing the new material comprises the following steps: adding insect epidermal protein, and/or adding at least one of functional truncation, mutant and polypeptide of the insect epidermal protein into the new material. The novel material is prepared by adding the insect epidermal protein, so that on one hand, various physiological and biochemical properties of the insect epidermal protein are fully utilized, on the other hand, the insect epidermal protein can be obtained by a gene recombination mode, and various defects of the structural protein in the preparation of the material in the prior art are overcome. In addition, the invention provides new materials such as film materials, porous support materials, gels, aggregates and the like, can be applied to the fields of packaging, biomedicine, environment, optics and the like, and has wide application range.)
技术领域
本发明涉及新材料制备的
技术领域
，具体涉及制备新材料的方法及获得的新材料和应用。背景技术
结构蛋白是构成细胞和生物体结构的一类蛋白，常见的结构蛋白有胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白和弹性蛋白等。这些结构蛋白往往拥有良好的生物相容性、环境友好性和优异的机械性能，因此在不同领域特别是材料领域有广泛的应用，例如蛋白水凝胶、柔性电子器件、基因或药物递送纳米载体、蛋白复合膜等。
但上述结构蛋白仍然存在一些缺点限制了其在材料领域的进一步应用。首先是上述结构蛋白的序列较为简单，生化性质单一。上述结构蛋白往往含有大量的重复序列，结构单一，例如丝蛋白和胶原蛋白含有大量的甘氨酸和丙氨酸重复序列，氨基酸序列决定蛋白的生化性质，因此上述蛋白往往只表现出较为单一的生化性质，从而无法满足不同情况下的应用需求。再者，上述结构蛋白的分子量都比较大，目前获取上述蛋白比较成熟的方法是通过组织提取，例如胶原蛋白通过动物结缔组织进行提取，丝蛋白通过蚕茧获取，角蛋白则由动物毛发获得，但是受到工艺控制，原料来源不同等因素影响，不同批次的蛋白质量往往存在差异，而且复杂的提取过程还会造成环境污染。
鉴于上述结构蛋白存在的缺点，开发更多具有不同序列特征和生化性质、易于获取的结构蛋白对于新材料的研发具有积极意义。
发明内容
本发明提供了第一方面提供了一种制备新材料的方法，所述新材料中加入昆虫表皮蛋白，和/或加入所述昆虫表皮蛋白的功能性截短体、突变体、多肽中的至少一种。
昆虫表皮蛋白是构成昆虫表皮组织的重要结构蛋白，表皮蛋白数量巨大，这些表皮蛋白拥有丰富的序列多样性，根据氨基酸保守序列特征可以将其分为12个不同的家族，包括CPR、CPAP、CPT、CPH等。此外，表皮蛋白的生理生化性质多样，例如某些表皮蛋白具有几丁质结合活性，某些表皮蛋白能参与结合植物病毒，某些表皮蛋白拥有优异的机械性能和温度响应相变性质。表皮蛋白的序列特征和生理生化性质多样性使其在材料领域具有巨大的应用前景。
对于新材料的种类，应用的领域不作具体限定，可以根据研究方向或应用领域等实际需要进行调整获得目的新材料。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述新材料中加入亚洲玉米螟CPH家族表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体、多肽中的至少一种。
亚洲玉米螟是鳞翅目螟蛾科昆虫，是一种常见的钻蛀性昆虫，本发明发现了在亚洲玉米螟表皮中高表达的表皮蛋白OfCPH-1，构建了OfCPH-1及其截短体的表达载体，通过镍离子亲合层析对OfCPH-1及其截短体进行了分离纯化，对分离纯化后的重组蛋白进行了生化性质表征，并探究了OfCPH-1在材料领域的应用。
表皮蛋白OfCPH-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为213个氨基酸。编码表皮蛋白OfCPH-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，长度为642个碱基。
表皮蛋白OfCPH-1的截短体蛋白包括但不限于OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d和OfCPH-1e。
OfCPH-1a截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，长度为82个氨基酸。编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，长度为246个碱基。
OfCPH-1b截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，长度为100个氨基酸。编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，长度为300个碱基。
OfCPH-1c截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，长度为155个氨基酸。编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，长度为465个碱基。
OfCPH-1d截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，长度为173个氨基酸。编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，长度为519个碱基。
OfCPH-1e截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，长度为179个氨基酸。编码核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，长度为540个碱基。
表皮蛋白OfCPH-1的突变体包括个别或多个氨基酸突变后仍然具有与OfCPH-1相同或类似地的生物学活性的表皮蛋白。
所述多肽指的是包括表皮蛋白OfCPH-1氨基酸中至少部分序列的多肽，且去除或替代某些氨基酸之后仍具有表皮蛋白OfCPH-1相同的生物活性或有新的生物学活性。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述新材料包括但不限于薄膜材料、多孔支架材料、凝胶、团聚体。
所述新材料可以为但不限于表皮蛋白OfCPH-1截短体、突变体、多肽中的至少一种，单独地，或与他生物材料和/或非生物材料复合形成的薄膜材料、多孔支架材料、凝胶、团聚体，对于材料的类型不局限上述列举的四种，其余未提及的落入本发明构思下的不同形态的新材料也属于本发明的保护范围。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述薄膜材料为表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体、多肽中的至少一种与壳聚糖复合形成薄膜材料。
进一步，所述薄膜材料为表皮蛋白OfCPH-1与壳聚糖复合形成薄膜材料。
进一步，所述薄膜材料的制备方法包括以下步骤：将所述表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体或多肽，或含有其的介质，与壳聚糖或含有其的介质混合的步骤。
上述制备方法中，介质优选液体，例如表皮蛋白OfCPH-1的水溶液或其他能够溶解表皮蛋白OfCPH-1但不影响其性能的液体；又例如含有壳聚糖的乙酸溶液。
所述表皮蛋白OfCPH-1的溶液浓度优选0.1wt％、0.5wt％、5wt％。所述壳聚糖的乙酸溶液浓度优选20mg/ml。
在本发明一种优选地实施方式中，薄膜材料的制备方法包括以下步骤：将含有表皮蛋白OfCPH-1的水溶液与含有壳聚糖的乙酸溶液混合均匀，经过成膜处理后，获得薄膜材料。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述多孔支架材料为表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体、多肽中的至少一种制备获得。
对多孔支架材料中孔隙的大小和密度均不作具体限定，根据需要调整即可。例如用于细胞培养的多孔支架材料，可以根据细胞的种类和大小，培养时间等因素调整多孔材料的结构特征和具体性能。
进一步，所述多孔支架材料的制备方法包括以下步骤：含有所述表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体、多肽中至少一种的溶液经过交联后形成交联产物(例如水凝胶)，再经冷冻干燥后获得多孔支架材料。
在本发明一种优选地实施方式中，含有所述表皮蛋白OfCPH-1的溶液，经过光固化交联形成凝胶，冷冻干燥后获得多孔支架材料。
对于蛋白溶液的浓度可以根据需要自由选择，例如所述表皮蛋白OfCPH-1的溶液可以为50mg/ml。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，团聚体为表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体、多肽中的至少一种的溶液，与任选地生物材料和/或非生物材料的溶液混合形成团聚体。
进一步，所述团聚体的制备方法包括以下步骤：将含有所述表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体、多肽中至少一种的溶液与含有壳聚糖的溶液混合后，发生相分离形成团聚体。
在本发明一种优选地实施方式中，将含有所述表皮蛋白OfCPH-1的溶液与含有壳聚糖的溶液混合后，发生相分离形成团聚体。上述团聚体，在肉眼观察下溶液浑浊，在显微镜下观察到液液相分离的表皮蛋白(或截短体、突变体、多肽)形成大小不一的液滴。
所述表皮蛋白OfCPH-1的溶液浓度可以为但不限于0.1wt％、0.5wt％、0.8wt％、1wt％、1.5wt％、1.8wt％、2wt％、2.5wt％、2.8wt％、3wt％、3.5wt％、3.8wt％、4wt％、4.5wt％、4.8wt％、5wt％、5.5wt％、6wt％、6.5wt％、7wt％、7.5wt％、8wt％、8.5wt％、9wt％、9.5wt％或10wt％；优选0.1wt％、0.5wt％、5wt％；更优选5wt％。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体或多肽通过基因重组的方法获得。
所述表皮蛋白OfCPH-1、截短体、突变体或多肽的分子量小，可以采用下述基因重组的步骤获得：(1)合成目的核苷酸序列；(2)构建重组载体以及相对应的重组表达基因工程菌；(3)重组基因工程菌进行原核表达，蛋白纯化，得到目的蛋白、截短体、突变体或多肽。
本发明第二方面提供了上述的制备方法获得的新材料。
进一步，所述新材料包括但不限于薄膜材料、多孔支架材料、凝胶、团聚体。
本发明第三方面提供了上述新材料在包装(例如薄膜材料应用于包装)、生物医学(例如多孔支架材料应用于细胞培养、医疗器械，例如团聚体应用于载体递送药物、基因)、环境(例如薄膜材料环保无污染)和光学领域(例如薄膜材料应用于覆膜)中的应用。
所述薄膜材料可以为表皮蛋白OfCPH-1与壳聚糖复合的薄膜材料，所述复合薄膜材料具有优异的拉伸强度高、弹性模量高、韧性好、延伸性能好、透光度好等优点，而且原料都为生物可降解材料，绿色无污染，可以应用于包装、环境和光学领域。
所述多孔支架材料可以为表皮蛋白OfCPH-1溶液冻干后形成的多孔支架材料，具有多孔结构，生物相容性好，可以应用于细胞培养、医疗器械等相关领域。
所述团聚体为表皮蛋白OfCPH-1的溶液与含有壳聚糖的溶液混合后，发生相分离形成团聚体，原料均为动物性蛋白或其衍生物，安全性好，可以用作载体，在药物、基因递送等领域，应用前景广。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供的制备新材料的方法，通过加入昆虫表皮蛋白的方式制备新材料，一方面充分利用了昆虫表皮蛋白的多种生理生化性质，另一方面昆虫表皮蛋白可以通过基因重组的方式获得，克服了现有技术中结构蛋白应用于制备新材料中的诸多缺点。
(2)本发明提供了薄膜材料、多孔支架材料、凝胶、团聚体等新材料，其中，薄膜材料具有优异的拉伸强度高、弹性模量高、韧性好，延伸性能好、透光度好等优点；多孔支架材料具有多孔结构，生物相容性好的优点。
(3)本发明提供了新材料在包装、生物医学、环境和光学领域中的应用，应用范围广，为新材料的研发提供了可供选择的原料。
附图说明
图1所示为实施例1中表皮蛋白OfCPH-1、OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d和OfCPH-1e经过纯化后的SDS-PAGE结果图。
图2所示为实施例2中表皮蛋白OfCPH-1、OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d和OfCPH-1e与几丁质和壳聚糖结合活性评价；其中，T表示结合体系中的所有蛋白，F表示未结合蛋白，E表示结合蛋白。
图3所示为实施例3中0.5％质量比浓度的表皮蛋白OfCPH-1可诱导壳聚糖形成纤维结构；其中，A为纯壳聚糖的透射电镜照片，B为加入质量比为0.5％表皮蛋白OfCPH-1后壳聚糖的透射电镜照片。
图4所示为实施例4中，5％质量比浓度的表皮蛋白OfCPH-1可与壳聚糖发生相分离形成团聚体，其中A为纯壳聚糖溶液的显微照片，B为加入5％的OfCPH-1后的壳聚糖溶液的显微照片，图中箭头所指为团聚体。
图5所示为实施例5中制备的多孔支架材料的扫描电镜照片及其生物相容性评价结果；其中A图为OfCPH-1在50mg/ml浓度下制备的多孔支架材料；B图为针对上述多孔支架材料进行生物相容性评价结果，实验中所用细胞为小鼠巨噬细胞J774A.1，胶原蛋白collagen为对照，图中横坐标为评价天数，纵坐标为细胞活性。
图6所示为实施例6中表皮蛋白OfCPH-1与壳聚糖复合制备的复合薄膜照片及其机械性能评价结果图；其中，A为含有0.5％的表皮蛋白OfCPH-1的复合膜的透光度显示图；B为含有不同质量比浓度的表皮蛋白OfCPH-1的复合膜的机械性能评价结果，CS、CS-0.1％CPH-1、CS-0.5％CPH-1和CS-5.0％CPH-1分别表示纯壳聚糖膜、含有0.1％OfCPH-1蛋白的复合薄膜、含有0.5％OfCPH-1蛋白的复合薄膜以及含有5％OfCPH-1的复合薄膜。tensilestrength表示极限拉伸强度、elastic modulus表示弹性模量、work of fracture表示韧性，strain表示延伸率。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
实施例1基因重组获得表皮蛋白OfCPH-1及其截短体
一、获取目的基因
(1)采用Trizol试剂从亚洲玉米螟5龄第1天幼虫中提取总RNA，并用反转录酶合成cDNA；
(2)以cDNA为模板，利用上游引物和下游引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因；引物见表1：
表1
PCR反应体系：1μL cDNA模板，25μL 2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase，2μL上游引物，2μL下游引物，补ddH2O(双蒸水)至总反应体系为50μL；
PCR的反应条件为：①94℃，5min；②94℃，15s；③55℃，15s；④72℃，60s；⑤重复步骤②-④30个循环；⑥72℃，10min；
(3)PCR产物经纯化回收后测序，得到如序列表SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7，SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。
二、构建表达载体
(1)将得到的核苷酸序列与pET-28a原核表达载体分别进行双酶切，双酶切产物经纯化回收后经T4DNA连接酶进行连接，得到重组表达载体连接产物。连接体系为2μL目的基因双酶切回收产物，5μL pET-28a双酶切回收产物，1μL 10×T4DNA连接酶缓冲液，1μLT4DNA连接酶；
(2)将重组表达载体连接产物与大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α)混匀，放置在冰浴中30min，42℃水浴下90s，取出后再次冰浴5min；接着将其加入到LB(Luria-Bertani培养基)液体培养基，并在37℃，200rpm条件下，振荡培养1h；取菌液于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基，涂布均匀，在37℃过夜培养，获得克隆菌落；
(3)挑取单克隆菌落进行菌落PCR初步鉴定，鉴定筛选阳性重组表达工程菌株单菌落。三、目的蛋白的表达与分离纯化
(1)将获得重组表达工程菌株单菌落接种于5ml含有浓度为50mg/L卡娜霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；将过夜培养的菌液接种于500ml新鲜的含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达0.6后加入终浓度为1mM的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养6h；诱导后的菌液经4℃，10000×g离心10min收集菌体；
(2)将上述菌体重悬于含有8M尿素的磷酸盐缓冲液中，经由高压匀浆进行破碎，破碎后离心收集上清液；
(3)含有目的蛋白OfCPH-1、OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d和OfCPH-1e的上清液通过镍离子亲合层析进行分离纯化。OfCPH-1的洗脱条件为150mM咪唑洗脱杂质蛋白，洗脱体积为100ml，之后1M咪唑洗脱目标蛋白，OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d和OfCPH-1e的洗脱条件为50mM咪唑洗脱杂蛋白，洗脱体积100ml，之后250mM咪唑洗脱目的蛋白；
(4)纯化后的表皮蛋白经过4步逐级透析去除含有的尿素，透析缓冲液为分别为含有6M尿素、4M尿素、2M尿素和0M尿素的去离子水，每步透析时间为24h，透析处理后的重组蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，最终获得纯化的重组表皮蛋白OfCPH-1、OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d和OfCPH-1e，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
SDS-PAGE电泳结果如图1所示，其中M是标准蛋白质分子量Marker，纯化后的目标蛋白分别是OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d、OfCPH-1e和OfCPH-1。
实施例2重组蛋白与几丁质和壳聚糖结合活性评价
重组蛋白OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c、OfCPH-1d、OfCPH-1e和OfCPH-1的几丁质和壳聚糖结合活性评价，具体步骤如下：
反应体系为50μL：含有浓度为0.5mg/ml的上述各重组蛋白，浓度为5mg/ml的α几丁质或脱乙酰度为95％的壳聚糖，20mM Tris，pH6.0。对照组含有等浓度的牛血清蛋白BSA，其他条件与实验组相同。
结合实验在室温下进行，孵育时间为24h，期间保持旋转震荡，速度为100rpm。24h后将反应体系离心，离心速度为12000g，时间为10min，上清液既为未结合的蛋白，离心后的沉淀用1ml含有0.5M氯化钠、20mM Tris，pH6.0的缓冲液进行清洗并离心，反复3次以洗去非特异性结合的重组蛋白。清洗过后的沉淀用30μl含有8M尿素的洗脱缓冲液洗脱结合的重组蛋白。体系中的含有的全部蛋白，未结合的重组蛋白以及结合的重组蛋白经SDS-PAGE电泳进行检测，结果见图2。
从图2的结果可知，重组蛋白OfCPH-1d、OfCPH-1e和OfCPH-1具有几丁质(chitin)和壳聚糖(Chitosan)结合活性，其中OfCPH-1的结合活性最好，其他蛋白包括OfCPH-1a、OfCPH-1b、OfCPH-1c则没有表现出结合活性。
实施例3
在实施例2中测试出OfCPH-1表皮蛋白结合壳聚糖活性最好的基础上，透射电镜观察OfCPH-1表皮蛋白对壳聚糖形态的影响，具体实验步骤如下：
(1)首先将脱乙酰度为95％的壳聚糖用1％的乙酸溶解，浓度为20mg/ml，取1ml完全溶解后的壳聚糖溶液备用；
(2)接着在上述壳聚糖溶液中加入质量比为0.5％的OfCPH-1表皮蛋白，充分震荡混合均匀，静置脱气；
(3)取50μl均匀混合的壳聚糖蛋白混合液滴加到200目的超薄碳支持膜上，静置30min使得壳聚糖纤维附着在碳膜上，之后吸走多余的混合液，去离子水清洗后干燥。
上述制备好的电镜样品经透射电镜观察，结果如图3。从实验结果可知，与未加蛋白的纯壳聚糖样品对照组相比，OfCPH-1表皮蛋白可诱导壳聚糖形成纤维结构。
实施例4
显微观察OfCPH-1表皮蛋白和壳聚糖混合液的相分离现象，具体步骤如下：
制备壳聚糖溶液，操作同实施例3。在溶液中加入5％质量比的OfCPH-1表皮蛋白并震荡混合均匀，静置脱气。取10μl混合液滴加至载玻片上并盖上盖玻片，于200倍显微镜下观察团聚体。纯壳聚糖溶液作为对照，观察结果如图4所示。
从图4的结果可知，加入5％的OfCPH-1表皮蛋白后，壳聚糖与OfCPH-1表皮蛋白发生相分离形成了团聚体，肉眼下可壳聚糖与OfCPH-1表皮蛋白的混合溶液呈浑浊状态，显微镜下观察出现大小不一的液滴。
实施例5制备含有OfCPH-1表皮蛋白的多孔支架及生物相容性评价
制备多孔支架的方法，具体步骤如下：
(1)将OfCPH-1溶解于1％的乙酸溶液中配制成浓度为50mg/ml的蛋白溶液。取100μl上述蛋白溶液加入过硫酸铵，使其终浓度为0.2mM，之后再加入光引发剂三联吡啶氯化钌，使钌离子的终浓度为0.2mM。
(2)上述混合体系在500W的紫外灯下照射3min，共两次，两次照射的间隔为15min，经过光交联，OfCPH-1表皮蛋白中的酪氨酸被氧化彼此之间形成共价键，获得交联产物(水凝胶)。
(3)交联产物经大量的去离子水冲洗去除多余的过硫酸铵和光引发剂，最后冷冻干燥，干燥后的样品经喷金处理后进行扫描电镜观察，结果如图5所示。
从图5的结果可以看出，干燥后的样品形成了多孔结构，孔隙分布均匀，孔隙大小相差不大。
生物相容性评价试验，具体步骤如下：
1.细胞复苏，传代和接种
(1)小鼠巨噬细胞J774a.1的复苏：从细胞冻存液氮罐中取出含有细胞株的冻存管，立即置入37℃水浴中，不停摇晃使其在2min内快速且完全融化。冻存管表面喷洒75％乙醇进行消毒后移入超净台，将冻存管中细胞悬液吸出并转移至含有2mL完全培养基的离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL完全培养基重悬细胞悬液，并使用台盼蓝进行细胞计数。接种适量J774a.1细胞悬液至预先加入10mL完全培养基的Corning 100mm细胞培养皿中，放入细胞培养箱中培养。每日观察细胞生长情况，当细胞生长至覆盖培养瓶或培养皿基底90％以上时，需要进行传代。
(2)J774a.1细胞的传代：使用细胞铲轻刮培养皿底部，可以观察到培养基逐渐变得浑浊，表明细胞已从培养皿基底被刮除，悬浮于培养基中。将所得的细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm，5min离心，弃去上清，加1mL新鲜培养基重悬后进行细胞计数。取适量细胞悬液加入一个新的培养皿中，同时加入10mL新鲜培养基，放入细胞培养箱中培养。(3)J774a.1细胞的接种：在细胞从冻存开始，传代至第3代或第4代后，一般认为细胞株已经稳定，可以用于实验。计算所需的细胞数量，进行常规传代操作后，将离心后细胞重悬于适量新鲜培养基中，达到预期的接种密度，将制备好的多孔支架材料置于96孔板中，每孔加入100μL培养基细胞悬液，J774a.1细胞接种密度为10000cells/well。
2.细胞活力测试
MTS是使用比色法检测细胞增殖和细胞毒性试验中活细胞数量的检测试剂。在反应过程中MTS被细胞还原成有色甲臜(Formazan)产物，溶解在培养基中，在490nm处可以检测到甲臜产物的量与培养中活细胞的数量成正比。
MTS实验的方案如下，整个过程注意避光操作：
1)计算所需培养基和MTS的体积：对于96孔板，每个孔需要加入120μL MTS-培养基溶液。在无菌移液槽中按MTS：培养基为1：5比例配制MTS-培养基溶液，混合均匀备用；
2)细胞培养箱中取出96孔板，吸去废培养基，按120μL/well加入120μL MTS-培养基溶液，立即放入培养箱中孵育40min；
3)将上清转移至一块新的非无菌96孔板中，使用酶标仪测490nm处的吸光度值。
从图5B的结果可知，在4天的评价周期中，多空支架材料对小鼠巨噬细胞有较好的生物相容性，细胞的活性要高于对照组以商业化的胶原蛋白作为支架的细胞活性。
实施例6制备含有OfCPH-1表皮蛋白的复合薄膜及测试机械性能
一、制备复合薄膜的方法，具体步骤如下：
(1)准备浓度为20mg/ml的壳聚糖溶液，详细操作同实施例3。取3ml准备好的壳聚糖溶液，分别加入质量比为0.1％、0.5％和5％的OfCPH-1表皮蛋白，混合均匀，静置过夜脱气。
(2)将脱气处理后的混合液倒入直径为5cm的培养皿中并于室温下静置48h以蒸发溶液中的水分，干燥后的复合膜通过0.5M的氢氧化钠溶液进行清洗，以中和多余的乙酸，最后经大量去离子水冲洗去除残留的氢氧化钠并室温干燥，获得复合薄膜。
(3)制备的含有0.5％质量比的OfCPH-1表皮蛋白-壳聚糖的复合薄膜如图6中A所示，有较好的透明度。
二、机械性能评价
将上述制备好的复合膜裁剪成长3.5cm，宽0.5cm的拉伸样品条，使用TMS电子万能试验机进行拉伸试验，拉伸速度为5mm/min，记录拉伸曲线，并根据拉伸曲线计算极限拉伸强度(tensile strength)、弹性模量(elastic modulus)、韧性(work of fracture)和延伸率(strain)。
结果如图6中B所示。从图中可以看到，与对照组纯壳聚糖薄膜相比，加入0.1％的OfCPH-1后，复合薄膜的极限拉伸强度、弹性模量、韧性和延伸率都有提高，其中弹性模量显著提升。加入0.5％的OfCPH-1后，复合薄膜的极限拉伸强度、弹性模量、韧性均显著提升，延伸率也有所改善。加入.5％的OfCPH-1后，复合薄膜的极限拉伸强度、弹性模量没有明显变化，但韧性和延伸率有所降低。由此推断，OfCPH-1表皮蛋白-壳聚糖的复合薄膜中，OfCPH-1表皮蛋白的浓度与薄膜的机械性能密切相关，蛋白浓度过高或过低都会影响其机械性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 制备新材料的方法及获得的新材料和应用
<141> 2021-05-26
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 213
<212> PRT
<213> Unknown
<400> 1
Met Gln Ser Met Ile Ile Phe Ala Ala Thr Leu Cys Leu Ala Lys Ala
1 5 10 15
Ser Phe Tyr Ala His Ala Pro Ala Pro Ile Gln Leu Ser Pro Asp Gly
20 25 30
Lys Tyr Val Leu Asp Thr Pro Glu Val Ala His Ala Lys Ala Ala His
35 40 45
Leu Ala Ala His Ala Gln Ala Ala Thr Ala Pro His Gly Ala Trp Ala
50 55 60
Pro Ala Gly Pro Ala Tyr Gly Ala Gly Tyr Asp Gly His Tyr Gly Ala
65 70 75 80
Pro Ala Ala Gly Leu Ile Lys Tyr Gly Pro Ala Pro Leu Ala His Asp
85 90 95
Gly Arg Val Val Asp Thr Pro Glu Val Ala His Leu Lys Ala Ala His
100 105 110
Ile Ala Ala His Ala Ala Ala His Ala Ala Ala Pro His Gly His Gly
115 120 125
Ala Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Ala Ala Pro Leu Ala His Gly Ala Gly
130 135 140
Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Tyr Gly Lys Trp Ser Gly Pro Gln
145 150 155 160
Ala His Ile Gln Leu Thr His Asp Gly Gln Tyr Val Val Asp Thr Pro
165 170 175
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Ala His Ala Ala Ala Ala Ala Pro Glu Glu Pro Trp Gly Ala His Gly
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Ala His Gly Trp His
210
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<212> PRT
<213> Unknown
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Ser Phe Tyr Ala His Ala Pro Ala Pro Ile Gln Leu Ser Pro Asp Gly
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Lys Tyr Val Leu Asp Thr Pro Glu Val Ala His Ala Lys Ala Ala His
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Leu Ala Ala His Ala Gln Ala Ala Thr Ala Pro His Gly Ala Trp Ala
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Pro Ala Gly Pro Ala Tyr Gly Ala Gly Tyr Asp Gly His Tyr Gly Ala
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Pro Ala Ala Gly Leu Ile Lys Tyr Gly Pro Ala Pro Leu Ala His Asp
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Gly Arg
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<213> Unknown
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Ser Phe Tyr Ala His Ala Pro Ala Pro Ile Gln Leu Ser Pro Asp Gly
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Leu Ala Ala His Ala Gln Ala Ala Thr Ala Pro His Gly Ala Trp Ala
35 40 45
Pro Ala Gly Pro Ala Tyr Gly Ala Gly Tyr Asp Gly His Tyr Gly Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Leu Ile Lys Tyr Gly Pro Ala Pro Leu Ala His Asp
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Gly Arg Val Val Asp Thr Pro Glu Val Ala His Leu Lys Ala Ala His
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Ser Phe Tyr Ala His Ala Pro Ala Pro Ile Gln Leu Ser Pro Asp Gly
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Lys Tyr Val Leu Asp Thr Pro Glu Val Ala His Ala Lys Ala Ala His
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Leu Ala Ala His Ala Gln Ala Ala Thr Ala Pro His Gly Ala Trp Ala
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Pro Ala Gly Pro Ala Tyr Gly Ala Gly Tyr Asp Gly His Tyr Gly Ala
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Pro Ala Ala Gly Leu Ile Lys Tyr Gly Pro Ala Pro Leu Ala His Asp
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Gly Arg Val Val Asp Thr Pro Glu Val Ala His Leu Lys Ala Ala His
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Ile Gln Leu Thr His Asp Gly Gln Tyr Val Val Asp Thr Pro Glu Val
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Gln His Ala Arg Ala Ala His Leu His Gln Tyr Ala Ala Ala Ala His
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Gly Trp His
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<212> DNA
<213> Unknown
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atgcagtcta tgattatctt cgcggctacc ctctgcctag ccaaggcctc cttctacgcg 60
cacgcgcccg cgcccatcca gctcagtccc gacggcaaat acgtcctaga cacccctgag 120
gtggcccacg cgaaggctgc gcacttagcg gcgcacgcgc aggccgccac cgcgccccac 180
ggcgcgtggg cccccgccgg ccctgcttac ggcgctggat atgacggaca ctacggcgcc 240
cctgctgctg gtctcatcaa atacggcccg gctcctctcg cccacgacgg ccgcgtggtc 300
gacacgcctg aggtcgcgca cctgaaggcc gcccacatcg ccgcccacgc cgccgcccac 360
gccgccgcgc cgcacggcca cggcgcccta gcgcccctcg cctacgccgc gcccctcgcc 420
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gcccacatcc agctgaccca cgacggccaa tacgtagtag acacccctga agtccagcac 540
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<212> DNA
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tccttctacg cgcacgcgcc cgcgcccatc cagctcagtc ccgacggcaa atacgtccta 60
gacacccctg aggtggccca cgcgaaggct gcgcacttag cggcgcacgc gcaggccgcc 120
accgcgcccc acggcgcgtg ggcccccgcc ggccctgctt acggcgctgg atatgacgga 180
cactacggcg cccctgctgc tggtctcatc aaatacggcc cggctcctct cgcccacgac 240
ggccgc 246
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tccttctacg cgcacgcgcc cgcgcccatc cagctcagtc ccgacggcaa atacgtccta 60
gacacccctg aggtggccca cgcgaaggct gcgcacttag cggcgcacgc gcaggccgcc 120
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tccttctacg cgcacgcgcc cgcgcccatc cagctcagtc ccgacggcaa atacgtccta 60
gacacccctg aggtggccca cgcgaaggct gcgcacttag cggcgcacgc gcaggccgcc 120
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<213> Unknown
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<212> DNA
<213> Unknown
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gccgctgctg ccgcgcctga ggagccctgg ggcgcccacg gagcccacgg ttggcactga 540
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<212> DNA
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<400> 20
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<210> 21
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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tcagtgccaa ccgtgggctc 20
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