具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，本发明中，Oocyte：卵母细胞；MII-Oocyte：MII期卵母细胞；Zygote：合子；BC：囊胚胚胎；hCG：人绒毛膜促性腺激素；SCNT：体细胞核移植技术；Ctl：对照组。

第一方面，本发明提供了一种调控哺乳动物体外胚胎发育的方法，通过降低胚胎中L-2-羟基戊二酸(L-2-HG)的含量促进胚胎发育；

或者，通过升高胚胎中L-2-羟基戊二酸的含量抑制胚胎发育。

经发明人研究发现，在体外胚胎培养过程中，加入L-2-羟基戊二酸会阻碍组蛋白甲基化的擦除和胚胎的发育，而胚胎中L-2-羟基戊二酸含量的降低会促进组蛋白甲基化的擦除和胚胎的发育，据此，本发明提供了一种调控哺乳动物体外胚胎发育的方法，通过降低或升高胚胎中L-2-羟基戊二酸的含量以调控胚胎的发育。采用本发明提供的方法能够有效实现对体外胚胎发育的调控，为早期胚胎发育过程中的分子调控机制提供新的视野。

在一些优选的实施方式中，所述降低胚胎中L-2-羟基戊二酸的含量的方法包括：升高受精卵中L-2-羟基戊二酸脱氢酶的含量；

优选地，所述升高受精卵中L-2-羟基戊二酸脱氢酶的含量的方法包括：在受精卵中过表达L-2-羟基戊二酸脱氢酶。

L-2-羟基戊二酸脱氢酶(L2HGDH)，可以将L-2-羟基戊二酸转换成α-酮戊二酸(α-KG)，在受精卵中过表达L-2-羟基戊二酸脱氢酶能够降低其L-2-羟基戊二酸的含量。

在一些优选的实施方式中，所述在受精卵中过表达L-2-羟基戊二酸脱氢酶的方法包括：向受精卵中导入L-2-羟基戊二酸脱氢酶mRNA；

优选地，所述导入的方式包括显微注射。

在一些优选的实施方式中，所述L-2-羟基戊二酸脱氢酶mRNA的显微注射浓度为200ng/ul。

在本发明中，通过注射适宜浓度的L-2-羟基戊二酸脱氢酶mRNA，在不影响细胞代谢生长的前提下，实现对细胞内L-2-羟基戊二酸脱氢酶的过表达。

在一些优选的实施方式中，所述升高胚胎中L-2-羟基戊二酸的含量的方法包括：将胚胎在含有L-2-羟基戊二酸的条件下培养。

在一些优选的实施方式中，所述升高胚胎中L-2-羟基戊二酸的含量的方法包括：将胚胎在含有0.1-1mM的L-2-羟基戊二酸的条件下培养；其中，L-2-羟基戊二酸的浓度例如可以为，但不限于0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM或1mM。

在一些优选的实施方式中，将胚胎在含有0.3mM的L-2-羟基戊二酸的条件下培养。

在一些优选的实施方式中，在2细胞期至囊胚期通过升高胚胎中L-2-羟基戊二酸的含量抑制胚胎发育。

在2细胞期至囊胚期通过升高胚胎中L-2-羟基戊二酸的含量能够好的实现对胚胎发育的抑制。

在一些优选的实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于鼠、猪、兔或人，或者本领域技术人员所熟知的其他哺乳动物。

第二方面，本发明提供了一种L-2-羟基戊二酸在制备抑制哺乳动物体外胚胎发育产品中的应用。

经发明人研究发现，在体外胚胎培养过程中，加入L-2-羟基戊二酸会阻碍组蛋白甲基化的擦除和胚胎的发育，因此，含有L-2-羟基戊二酸的产品，例如药物，也具有阻碍组蛋白甲基化的擦除和胚胎的发育的作用，L-2-羟基戊二酸能够用于制备抑制哺乳动物体外胚胎发育的产品。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实验方法：

1、培养饲养层细胞

小鼠成纤维细胞获得：取妊娠13.5dpc的小鼠，用无菌方法解剖小鼠获得胚胎。之后把胚胎放在无菌的10mm培养皿里，其中含有无菌且已加双抗的PBS溶液。使用眼科镊移去胚胎的头部和内脏，把躯体放到PBS中清洗去除血液，转移至0.5ml胰酶中，无菌眼科剪刀剪碎胚胎组织。之后再加入0.5ml胰酶，使用1ml移液枪吹打均匀。之后5min之后加入5ml DMEM培养，再次吹打混匀，常温1100rpm离心3min，使用含有10％FBS DMEM培养液重悬细胞，并接种到100mm培养皿中。次日，根据细胞数量再次传代。细胞长到80％之后继续传代或者用于制作饲养层细胞。一般使用F2-F4代的小鼠成纤维细胞用于制作饲养层。

饲养层制备：待小鼠成纤维细胞长满后，去除培养液，PBS洗后，使用10ug/ml丝裂霉素C在5％CO₂ 37℃培养箱处理细胞2小时，之后PBS再洗5遍。使用胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗一遍之后将细胞冻存，使用时解冻铺于0.1％明胶上。

ES培养与传代：所用小鼠胚胎干细胞系(Mouse embryonic stem cells,mESC)为E14。E14培养于LIF/2i培养基和LIF/血清培养基。小鼠胚胎干细胞E14培养在0.1％明胶包被后丝裂霉素处理不能增殖的小鼠成纤维细胞(mouse embryo fibroblast，MEF)上。传代后置于37℃，5％CO₂的培养箱中。每天换液，隔天传代。

2、ES细胞冷冻与复苏

ES长至90％的时候，使用胰蛋白酶消化细胞，3-5min之后通常ES细胞以(2～5)×10⁵个/ml冻存。冻存液使用40％FBS、10％DMSO的DMEM培养液。ES培养时尽可能快地冻存ES细胞以减少培养代数。仔细记录细胞传代的时间、代数和冻存管的位置。解冻时，提前准备37℃水浴锅，将细胞从液氮罐中取出，拧松点冻存管盖(防止爆炸)，放入37℃干净的水浴，轻摇至仅有一点冰芯，时间控制在1min以内。拿到细胞间，使用酒精擦拭干净冻存管，转移到生物安全柜，加入预温的完全培养液，将液体转移至15ml离心管后，1100rpm离心3min。吸取上面废弃液体，使用完全培养液重新悬浮细胞沉淀。根据培养皿的大小，将细胞转入并且摇匀，转入37℃5％CO₂培养箱培养。次日观察细胞复苏情况。

3、双报告基因ES细胞系的制备

E14稳转报告基因2C::tdTomato用于标记两细胞样细胞(2-cell like cells，2CLC)。转染Nanog::GFP标记naive细胞。细胞转染使用后lip2000转染2C::tdTomato质粒7天后使用150μg/ml潮霉素筛选48小时。含有用双报告基因2C::tdTomato和GFP的E14细胞培养于LIF/Serum培养基中。

4、流式分选少量细胞

优化少量细胞代谢组学：含有双报告系统的ES细胞(2C-like:tdTomato阳性，ES:GFP阳性)用胰蛋白酶消化5min，含血清培养基停止反应，然后置于37℃培养箱中30min，使MEF贴壁，从而与ES细胞分离。收集上清悬浮的ES细胞，使用0.2％BSA/PBS洗一遍之后，通过45μm尼龙网过滤至5ml流式管中。然后将ES细胞在FACS-Aria流式细胞仪中进行分选。细胞梯度为2.5K、5K、10K、20K、40K、80K，每组3个重复。

2C-like细胞与ES代谢组学：收集10000个2细胞like和ES细胞进行代谢组学研究。ES细胞的分选时间为1min，2C-like ES分选时间约为8min。

所有细胞在分选前都保存在冰上，分选后立刻加入干冰预冷500μl 80％甲醇。所有样品保存在-80℃。离心浓缩机(SpeedVac)真空抽干后进行质谱检测。

5、卵子获取

为了获得MII时期卵子，在注射完人绒毛膜促性腺激素(hCG)12-14小时之后，收集成熟的MII卵子。准备已经过滤的M2(商用体外操作液sigma(M7167))制作微滴，颈椎脱臼处死小鼠，解剖并取出输卵管放入M2液滴中。解剖镜下使用尖头镊子撕开壶腹部释放卵母细胞复合体，使用0.3mg/ml的透明质酸酶消化1min，转移到新的M2微滴中，此时观察颗粒细胞脱落情况，使用口径大些的毛细管将胚胎转移到新的M2中，至颗粒细胞完全脱落，使用口径小的毛细管转移胚胎。

6、不同时期胚胎获取与培养

注射完hCG后将雌鼠按照1:1与雄鼠合笼。根据需要在不同时期收集胚胎。16小时拿出雌鼠检测是否有阴道栓。根据受精后胚胎发育时间收集相应胚胎用于实验或者培养。体内获取受精卵、早-2细胞、中-2细胞、晚-2细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚分别在hCG之后20-24小时、30-31小时、38-40小时、44-48小时、54-56小时、68-70小时、76-78小时、88-102小时。囊胚使用M2从子宫中冲出，其余时期胚胎从输卵管获得。需要培养的胚胎，需要在M2中清洗干净，转移到KSOM微滴中，于37℃且5％二氧化碳培养箱中继续培养。

9、2-HG与α-KG处理胚胎

hCG后16小时，从输卵管收集受精卵，使用0.3μg/ml透明质酸酶处理胚胎去除卵周颗粒细胞，选择有极体的卵子培养于含有α-KG(0.15mM)或者2-HG(0.3mM)的KSOM中。记录研究不同时期胚胎以及胚胎发育情况并收集实验所需的胚胎进行下一步实验。胚胎转入含有2-HG培养液时，需要在培养皿中多次转移，保证培养液中药物浓度。

10、胚胎代谢组学样本收集

根据小鼠胚胎发育速率，收集不同时期的小鼠早期胚胎。为减少胚胎在体外时间，每次处死小鼠数目不超过3只。收集胚胎的培养液M2于37℃预温。收集得到的胚胎在生理盐水微滴中涮洗3-5次，最后于双井中使用0.9％NaCl再次涮洗，最后使用毛细管将胚胎转移至1.5ml EP管中。然后将细玻璃管在0.9％NaCl中吹打检查有无胚胎残留，确认胚胎全部转移至EP管中。之后将1.5ml EP管放入液氮冷凝，然后加入100μl已于干冰预冷的80％甲醇，将EP管放入干冰或者-80℃保存。待胚胎收集后按照实验分组数目将胚胎合并，在4℃低温离心机中15,000rpm离心15分钟。轻轻将上清转移至新的离心管中，真空泵30℃抽干80％甲醇用于质谱检测。离心的沉淀物使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。

11、LC-MS质谱检测ES或者胚胎

干燥的代谢物实验30μl的0.03％去离子水重悬并震荡，之后4℃低温离心机中15,000rpm离心15分钟。取上清进行液相色谱-质谱检测(Liquid Chromatography MassSpectrometry，LC–MS/MS)。其中液相色谱实验是超高分辨液相色谱系统，其中色谱柱为ACQUITY UPLC HSS-T3 UPLC column(150×2.1mm,1.8μm,Waters)，流动相梯度依次为0–3min 1％流动相B；3–15min 1–99％流动相B；15–17min 99％流动相B；17–17.1min 99–1％流动相B；17.1–20min 1％流动相B。

流动相A为0.03％甲酸/水溶液，流动相B为0.03％甲酸/乙腈溶液。流速为0.25ml/min，色谱柱保持在35℃，自动进样器中的样品保持在4℃，进样体积为20μL。质谱检测使用三重四级杆且采用(QTRAP 6500+,SCIEX)in质谱多反应监测模式(MRM)。使用MultiQuant软件v.3.0(SCIEX)对色谱检查以及峰面积计算。每个检测到的代谢物的峰面积对与该样品总离子技术进行了归一化，因此，所得到的含量为检测代谢物与总代谢物之间的比值。由于2细胞和囊胚的大小总体积无差异，我们将这两个阶段归一化到代谢物的总含量，而非归一化到相对的细胞数量。归一化之后的峰面积作为变量，用于多变量和单变量数据统计分析。

12、LC-MS质谱对2-HG与α-KG定量

使用20μL(13c5-dl-2-HG，100nM)作为内标加入到含有80％甲醇的样品中进行L-2-HG和D-2-HG的绝对定量。加入后涡流震荡并在4℃低温离心15,000rpm 15分钟后，吸出的上清液使用SpeedVac浓缩器蒸发干燥。L-2-HG和D-2-HG的定量方法改自于之前已发表文献(Sensitive Determination of Onco-metabolites of D-and L-2-hydroxyglutarateEnantiomers by Chiral Derivatization Combined with Liquid Chromatography/MassSpectrometry Analysis.Zheng,J.Y.,Jiang,X.,Zhou,J.L.,Shi,Z.Q.,Liu,L.F.,andXin,G.Z.(2019).A readily(16)O-/(18)O-isotopically-paired chiralderivatization approach for the quantification of 2-HG metabolic panel byliquid chromatography-Tandem mass spectrometry.Analytica chimica acta 1077,174-182.)。

将50μL的TSPC(12.5mM ACN,5％吡啶)加入到干燥的代谢物中进行手性衍生化。在25℃反应20分钟后，用SpeedVac烘干混合物，然后在50％的ACN水溶液中重新溶解，用于LC-MS分析。TSPC标记的L-2-HG和D-2-HG在LC-MS系统上使用QTRAP 6500+三重四极杆质谱仪(SCIEX,Framingham,MA,USA)以及电喷雾电离法和Nexera 2×LC-30A超高效液相色谱仪(Shimadzu Corporation,Kyoto,Japan)进行定量。采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×150mm,1.8μm)，在45℃下进行高效液相色谱分离，流动相A为15mm乙酸铵水+0.1％甲酸(v/v)，流动相B为乙腈。优化后的梯度为:10％～31％B中0～4min,31％～32％B中4～15.5min,32～95％B中15.5～16min,95％B中16～18min，并维持在10％B中平衡4min。质谱检测采用多反应监测(MRM)负离子模式。

L-2-HG和D-2-HG在448.1>155.1,IS在453.1>155.1模式进行MRM转换。

13、α-KG的绝对定量

测定α-KG含量时使用13c5-dl-2-羟基戊二酸(100nM)为内标。提取和测定方法与靶向代谢组学方法相同。13c5-dl-2-羟基戊二酸MRM转变方法119>74，和1,4-13C2-琥珀酸的MRM过渡分别为152>134。

14、表达载体的构建

使用Gateway系统制备可以使用T7体外转录试剂盒进行体外转录，获得目的基因mRNA。首先通过BP反应将目的基因CDS片段装入于pDonor201载体，此时涂板使用卡那抗性的培养平板。小提后进行测序，插入片段测序无误后与pDEST-mCherry进行LR反应。将目的基因插入mcherry下游。此时使用氨苄抗性培养平板。然后使用大提试剂盒提取构建质粒。

15、体外转录mRNA

由于线性化的质粒体外效率明显高于未线性化的质粒，因此在体外转录之前，选择目的基因下游限制性内切酶(平端防止自连)将表达质粒线性化，线性化的成功与否可以使用琼脂糖凝胶电泳来确定。确认线性化完全后，使用胶回收试剂盒纯化线性化的DNA。纯化后线性化质粒使用T7体外转录试剂盒获得mRNA。

体外转录体系如下：

使用移液枪轻轻混匀后防止PCR仪37℃4小时。之后取出，在其中加入1μl的TurboDNase，37℃放置15min，用以去除DNA。之后使用加尾试剂盒在mRNA末端连上Poly(A)。

配制好此体系后，将其加入之前20μl体系中。混匀后37℃放置1h，从而使Poly(A)加到mRNA的末端。然后将上述反应体系中加入50μl的LiCl，混匀后放入-20℃冰箱过夜使RNA沉淀。沉淀后的样品在4℃以16000rpnm离心15min。预冷的70％乙醇清洗一遍，离心去除乙醇后，加入20μl的RNase水溶解RNA，测完浓度后稀释成0.5-1.0μg/ul并分装，保存于-80℃用于胚胎里显微注射。

16、胚胎RNA干扰实验

用显微操作系统可以将外源的mRNA注射到胚胎中，从而实现高表达目的基因。RNA干扰通常使用注入针对目的基因的siRNA，从而干扰目的基因转录的mRNA，降低目的基因的蛋白水平。这两种方式都是用于研究目的基因的功能。通常定制3条siRNA，在细胞中使用Lip2000转染ES验证siRNA敲除效果后，再用于胚胎注射。

胚胎中注射mRNA浓度一般为0.5-1.0μg/ul，注射的siRNA浓度为20μM。使用注射针将mRNA或者siRNA注射到胚胎的细胞质中。显微注射后的胚胎培养再37℃、5％CO₂培养箱中。每日记录胚胎发育情况并在需要的时期收取胚胎用于实验。一般采用qPCR检测目的基因RNA水平的变化，使用免疫荧光或者western blot的方法检查目的基因蛋白水平的变化。

17、小鼠胚胎qRT-PCR

小鼠胚胎体外转录的方法借鉴Smart-seq2，由于mRNA量与细胞体积相关，因此，一般使用5-10个胚胎(与胚胎所在时期关系差异不大)。胚胎体外反转录-qPCR方法如下：

配制裂解液：

胚胎获得：使用0.2％BSA/PBS清洗胚胎2-3次，以去除培养基。

用毛细管将清洗后的胚胎转入到0.2ml的PCR管中，之后将毛细管在0.2％BSA/PBS吹洗，确认胚胎完全转移到PCR管中。不进行下一步实验，可以放入液氮中冷冻之后放-80℃冰箱保存。如果继续实验，则加入下面裂解液。

裂解液配制如下。加入裂解液后立即将PCR管放入已经72℃的PCR仪3min，3min立即将PCR管放置冰上。此步使Oligo-dT能够结合到mRNA的Poly(A)上。

逆转录：此步将mRNA逆转录为cDNA，逆转录体系配制如下，反应条件为42℃90min，72℃15min。逆转录产物-20℃保存或者稀释后进行下一步qPCR反应。

qPCR反应：根据实验的荧光定量试剂所用酶配制反应体系，以Gapdh作为内参。每个引物首次使用需要制作融解曲线。得到的CT值之后，使用2-△△Ct计算检测基因的相对定量。

18、小鼠胚胎RNA-seq

小鼠胚胎RNA-seq的具体步骤如下：

胚胎收集：收集5-10个胚胎，方法同小鼠胚胎qPCR。此步胚胎实验10U/ml Pronase去除透明带。

每组胚胎加入4μl裂解缓冲(2μl 0.2％Triton x-100，1μl 10mM dNTP，oligo-dT30)。离心后在72℃孵育3分钟，然后立即放于冰上。

反转录体系如下，反转录程序为42℃90min，72℃15min。

线性扩增：用KAPA Hifi HotStart扩增cDNA，扩增周期约12个周期。

磁珠纯化：扩增得到的DNA使用磁珠进行纯化。纯化后Qubit检测浓度，根据检测浓度取1ng DNA进行2100检测。根据电泳结果判断反转录cDNA是否在1.5Kb-2 Kb之间。如果是，则用于建库。

建库：根据cDNA含量，选择对应建库试剂盒。本实验cDNA含量较低，因此使用1ng建库试剂盒。

首先使用TTE Mix V1的转座酶将cDNA打断并加上接头，55℃5皿之后立即加上室温的5×TS终止。之后每个样品加入不同Index进行PCR扩增，扩增循环需要优化。建好的文库进行质检并在HiSeq-PE150上测序，每对末端读长为150bp。

19、免疫组化：

根据实验目的取出小鼠卵巢组织，使用PBS清洗以后，放入福尔马林固定，送至浙大医学院组化平台进行免疫组化。免疫组化使用抗体为本实验室提供，使用比例依据抗体说明书。

20、免疫印迹

免疫印迹(Western Blotting)是现在生物学中检测蛋白质分子量的常用的方法。该方法使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将分子量大小不同的蛋白进行分离。然后通过转膜的方式，将蛋白转移到硝酸纤维膜(PVDF)上。然后根据目的条带大小，在该区域孵上对应抗体，再用带有标签的二抗识别相应的一抗，通过ECL化学发光，检测目的蛋白含量。具体流程如下：

蛋白样本准备：将一定数量的培养样本加入RIPA稀释的1×SDS loading buffer中，90-100℃加热10分钟，使蛋白变。变性后的蛋白可以直接电泳或者-20℃保存。

胶的制备：根据待检测蛋白分子量的大小，选取不同浓度的浓缩胶和分离胶。分离胶配制后，胶面用水压平，室温放置30min以上使其充分凝固。之后配制浓缩胶，倒去压胶的水，使用滤纸吸干后，加入浓缩胶并立即插入样本梳。再等待半小时，使浓缩胶充分凝固后，进行下一步实验。

电泳：将含有胶的制胶板夹放入电泳装置。加入电泳缓冲液后，拔去样品梳，每个上样空加入等体积等浓度的蛋白样品。另外，加上蛋白质marker，从侧判断目的蛋白所在的位置。如有多余的孔，则用1×SDS loading buffer补平。电泳使用恒压模式，其中样品在浓缩胶中，使用90电压，当到达分离胶之后，可以使用120V电压。

转膜：采用湿转的方式进行转膜。转膜时间决定于蛋白分子量的以及分离胶的浓度。转膜使用恒流模式。一般120mM转膜2h。转膜后注意，在拿出PVDF的时候，可以通过剪去拐角的方式标记膜的正反以及样品位置。

封闭：使用TBST配制5％脱脂牛奶，将PVDF膜正面朝上放置于封闭液中封闭1小时。

一抗：使用封闭液配制一抗，使用比例根据抗体要求以及样品中蛋白浓度。4℃冰箱中孵育过夜。

一抗清洗：使用TBST洗去一抗孵育后的PVDF膜，共3次，每次10min。

二抗：根据抗体要求使用封闭液稀释到合适的浓度，孵育PVDF膜。一般室温孵育1小时。

二抗清洗：使用TBST缓冲液洗去PVDF的二抗，共3次，每次10min。

曝光：现场配制好ECL曝光液，吸取膜上多余TBST，加入ECL显影液，放入曝光机中，进行显影和曝光。

21、小鼠胚胎免疫荧光

胚胎免疫荧光不仅可以对小鼠胚胎目的蛋白的位置进行检测，还可以对其进行定量。有利于了解目的蛋白在胚胎发育中的动态变化。具体步骤如下：

去除透明带：根据小胚胎所在时期与目的蛋白类型，决定透明带是否需要去除。对于融合之前的胚胎，可以不去除透明带，胚胎卵裂球融合之后，去除透明带有利于细胞核内目的蛋白的检测。

胚胎清洗：待检测胚胎在3mg/ml PVP/PBS冲洗3次，去除胚胎表面培养基。

固定：将胚胎转入4％多聚甲醛(PFA)固定15-30分钟，固定后的胚胎就可以透化继续下一步实验，也可以在3mg/ml PVP/PBS中4℃冰箱保存一周。

透化：固定液中胚胎在3mg/ml PVP/PBS中清洗3次以后，转入固定液0.25％TritonX-100/PVP/PBS进行透化处理。细胞质中蛋白一般透化20min，细胞核中蛋白固定时间可以延长到1小时。

封闭：透化后，胚胎在封闭液中涮洗1次，去除透化液后进行封闭，一般封闭1小时，5mc与5hmc则需封闭过夜。

一抗孵育与清洗：使用封闭液根据一抗说明进行抗体孵育。孵育条件为4℃孵育过夜。封闭液清洗4次，10min/次。

二抗孵育与清洗：用封闭液稀释二抗。二抗选择由一抗决定。二抗稀释倍数为对应一抗的一半，孵育时间一般1小时。之后封闭液清洗4次，10min/次。

DAPI染色：使用DAPI染色10分钟后用清洗液3mg/ml PVP/PBS冲洗3次。便可以制作成玻片进行共聚焦拍照检测。

制片：在载玻片上加入80％甘油或者防碎灭剂，将胚胎转入后，加上盖玻片。盖玻片四个角涂上羊毛脂，放在胚胎被挤压变形。

共聚焦观察：使用Olympus FV3000共聚焦显微镜下拍照。采用z轴0.5μm每层进行拍照。采集参数要避免应该信号过饱和。这种信号强度才可准确地反映抗原水平。

用Fiji软件计算每个样品中平均荧光强度。

5mc和5hmc免疫荧光：由于二者都是DNA上修饰，因此需要使用4N盐酸暴露出双链DNA中这两种修饰。免疫荧光改进如下：在透化之后，使用4N盐酸处理15min，然后转移到100mM Tris-HCl(PH8.0)中和10min。之后进行封闭等操作。

22、小鼠胚胎OP-Puro

本实验可以检测细胞中新生蛋白合成速度。主要原理是利用click-it Plus OPP的一个组分与生物独特的反应产生的基团(吡啶叠氮化合物和炔烃片段)发生反应，然后与Alexa 荧光染料结合产生荧光，从而对新翻译的多肽进行荧光标记。

为了测量不同时期新生蛋白含量，将不同阶段的小鼠胚胎在EmbryoMax KSOM培养基中培养1小时，使用Plus OPP Protein Synthesis Assay Kit中组分A对胚胎进行标记实验1小时，使用浓度为50μm。

标记后，胚胎在添加4％多聚甲醛的PBS中室温固定15分钟；

然后添加0.25％Triton X-100的PBS中室温渗透15分钟。

细胞核用DAPI染色10min，在蔡司LSM880荧光显微镜下，使用油镜对胚胎进行成像。

23、TUNEL检测细胞凋亡

使用一步法TUNEL凋亡检测试剂盒对不同条件下培养的胚胎进行TUNEL检测。确定药物实验浓度与使用时间。

固定：胚胎用PVP-PBS洗涤3次，用4％多聚甲醛(PFA)PBS固定30分钟。

透化：然后用0.25％Triton X-100PVP-PBS透化1小时。

染色：胚胎在37℃TdT-FITC(荧光素)溶液中染色60分钟，用PVP-PBS洗涤。

DAPI染色：用DAPI染色10分钟。然后清洗干净。

成像：载玻片扫描激光共聚焦显微镜(Olympus,FV3000)检查胚胎荧光。核上FITC阳性标记为死细胞。

统计：使用Fiji软件分析细胞总数和标记的死亡细胞。

24、二代测序(NGS)数据分析

公司测序之后得到去除接头与重复序列提供的转录组数据(Clean Data)。使用从GENCODE数据门户下载的Release M18基因注释，使用StringTie v1.3.4d(Mihaela etal.，2015)和-e-B-G参数计算基因表达水平。对于每个代谢基因，根据其映射到mm10的基因组位置读数计算为TPM(每百万读数的转录本)。我们直接下载了基因表达数获得公开的不同小鼠胚胎发育阶段的单细胞RNA-seq数据。并使用FPKM作为表达丰度指标。利用heatmapR软件包对代谢基因进行K-means聚类分析。使用clusterProfiler R package对阶段特异性代谢基因簇进行KEGG通路富集分析。

我们使用了与RNA-seq读取处理相同的过程定制和过滤ATAC-seq和ChIP-seq读取。对于每个样本，首先使用Bowtie2(version 2.3.4.1)对保留的ATAC-seq和ChIP-seq数据与mm10基因组进行比对。ATAC-seq读取的数据根据下列参数比对:-t-q-N 1-L 25-X2000，比对后没有混乱(no-mixed no-discordant)。ChIP-seq数据也与mm10比对，选项为:-t-q-N 1-L 25。删除所有没有比对到的reads和PCR重复序列。使用的deepTools(version2.5.3)(Ramirez et al.，2016)中包含bamCoverage和bamCompare命令，进行下游分析，这是一套探索深度测序数据的python工具。使用带有下列参数的BamCoverage命令:——normalizeUsing BPM-of bigwig——binSize 100，我们将原始读取信号规范化为每百万映射读取(BPM)信号的Bins，并将比对的bam文件转换为bigwig信号文件。deepTools的“computeMatrix”和“plotProfile”命令用于生成给定基因组区域ATAC-seq和ChIP-seq信号的reads密度分布图。

发育阶段特异性TF-MG(转录因子-代谢相关基因)的调控网络构建。

为了重建阶段特异性的TF-MG调控网络，我们采用了一个三步“富集-搜索-选择”程序。首先，我们使用HOMER软件来为每个识别的Cluster找到对应的TF结合基序。接下来，我们选择p值<0.1的TFs进行后续分析。最后，我们使用MGs MouseNet V2(Kim et al.,2016)，寻找每个Cluster中转录因子和代谢基因之间的联系。STRING V11(https://string-db.org/cgi/input.pl)和基因共表达网络由NetMiner(Yu et al.,2018)建立。他使用不同发育阶段的小鼠胚胎总RNA-seq基因表达数据作为输入(Hua et al.,2018)。最后，我们计算每个cluster中转录因子和代谢基因之间的Person CorrelationCoefficients(PCCs)，并选取MouseNet V2,STRING或者NetMiner network中PCC>0.1中包含的链接，得到不同时期的TF-MG调控网络。

25、统计与分析

实验统计实验SPSS进行统计分析，生信数据中统计分析采用R软件。每个图例中列出了单个测试的详细信息，包括实验次数和类型(n)以及报告的平均标准误差(s.e.m)。所有差异统计量均采用*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，采用双尾Wilcox signed rank检验(配对样本)和双尾Mann-Whitney U检验(独立样本)计算或在图示中另行注明。

实施例1代谢组学分析显示在2细胞到囊胚的转变过程中线粒体的TCA循环显著加强

为了了解植入前胚胎发育过程中的动态代谢重塑，我们采用基于质谱的少量细胞代谢组学的方法直接检测胚胎中的各种代谢物丰度。我们收集了100个2细胞时期的胚胎和100个囊胚期的胚胎，分别代表全能性状态即合子基因组激活的时候以及多能性状态即ES细胞产生的时候，进行靶向代谢组学分析，每个条件包含三个生物学样本的重复(图1中的A)。一共检测到113个代谢物(表1)，与质控相比，实验组(包括2c：2细胞时期胚胎；BC：囊胚时期胚胎；GFP：ES细胞；2c-like：2细胞样细胞；QC：blank(只含有0.9％Nacl溶液的组))检测到的代谢物信号强度明显升高(图1中的B)。靶向代谢物水平的PCA分析显示2细胞和囊胚期样品可以很好地区分开来(图1中的C)。差别最大的几种代谢物包括在囊胚时期较高的柠檬酸盐、α-酮戊二酸(α-KG)、琥珀酸和谷氨酰胺以及在2细胞时期较高的2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutarate，2-HG)、S-腺苷-蛋氨酸(S-adenosyl-methionine)、烟酰胺((nicotinamide，NA))、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原性谷胱甘肽(GSH)、亚精胺和N-乙酰腐胺(图1中的D)。值得注意的是，几乎TCA循环中所有的代谢中间物在囊胚期都很高的含量，包括柠檬酸盐、琥珀酸和α-KG(P<0.05)，但其竞争性抑制剂2-HG在2细胞时期更高(P<0.001,图1中的E和图1中的F)。事实上，代谢物富集分析表明TCA循环是囊胚期富集程度最高的代谢物组，而“蛋氨酸代谢”、“亚精胺和精胺生物合成”和“烟酸和烟酰胺代谢”是2细胞期富集程度最高的代谢物组(图1中的G和图1中的H)。另外，卵母细胞中甲硫氨酸较2细胞高，这表明2细胞中的某些胚胎代谢物可能来自于卵母细胞(图1中的I)。

表1检测到的代谢产物

为了进一步验证这些结果，我们应用同样的代谢组学方法检测了体外培养的ES(GFP+)细胞和2c-like(tdTomato+)细胞。

2C样细胞指的是在体外培养的ES细胞中转染2c地报告基因：2c::tdTomato，从而使得一小群2C样细胞可以从ES细胞中区分出来。同时该ES细胞系也转染了Nanog::GFP报告基因用来指示多能性状态的细胞。基于这个细胞系，我们分选出10000个tdTomato阳性的2C样细胞或者GFP阳性的ES细胞，每种细胞2个生物学重复用于代谢组学分析(图2中的A)。PCA也可以将两种细胞区分开(图2中的B)与来自胚胎的代谢组学结果一致，ES细胞中也检测到较高水平的TCA循环代谢物，如琥珀酸、延胡索酸和苹果酸，以及2C样细胞中较高的蛋氨酸和多胺代谢物，如S-腺苷-蛋氨酸、蛋氨酸和N-乙酰腐胺(图2中的C和图2中的D)。

我们比较了胚胎与ES中代谢组学数据，2细胞胚胎中表达量较高的代谢物(与2C样细胞比较)以及囊胚期表达量较高的代谢物(与ES细胞比较)之间有18个重叠(图3中的A)，而囊胚期中表达量较高的代谢物(与2细胞胚胎相比)以及ES细胞中表达较高的代谢物(与2C样细胞相比)之间有23个重叠(图3中的B)。2细胞期胚胎以及2细胞样细胞中均富集的代谢物包括“亚精胺和精胺生物合成”以及“蛋氨酸代谢”。另外，“嘌呤代谢”和“三羧酸循环”在囊胚期胚胎和tdTomato阴性/GFP阳性的细胞中均有富集(图3中的C和图3中的D)。总而言之，我们的胚胎和体外细胞的代谢组学数据都说明在2细胞至囊胚期的转变过程中，线粒体中的TCA循环以及氧化磷酸化(OxPhos)水平都提高了。这表明囊胚期的胚胎处于更加氧化的状态，而2细胞时期的胚胎更加还原，2细胞胚胎中GSH/GSSG的比例相对更高也可以证明这一点(图1中的J)。

实施例2α-KG和2-HG之间的相互关系

为了了解代谢物是否直接参与基因调控和胚胎发育，我们选择在表观调控中具有既定作用的α-KG和2-HG来作为研究对象。2-HG有两种对映体分别是D-2-HG和L-2-HG，并且最近发现L型2-HG是在一定的生理条件下发现的。早期胚胎中全基因组表观重编程发生时2-HG的含量非常高，这使得我们想要进一步探究这种代谢物在MII卵母细胞、1细胞合子期和2细胞胚胎中的亚型和绝对浓度。我们采用同位素标记的内标，用于区分2-HG的类型(图4中的A)。出乎意料的是，我们发现L-2-HG(图4中的B)而不是D-2-HG在MII卵母细胞合子期和2细胞胚胎中有很高的浓度，并且随着胚胎发育过程的进行逐渐降低(图4中的C和图4中的D)。囊胚中α-KG的绝对浓度是2细胞胚胎的10倍以上(图4中的E)。尽管α-KG从MII卵母细胞到2细胞胚胎也略有下降，但α-KG/2-HG的比率在整个胚胎早期发育过程中显著增加(图4中的F和图4中的G)。

实施例3 L-2-HG对胚胎发育的影响

受精后L-2-HG浓度的降低以及α-KG/2-HG比率的增加表明在这个时期可能会出现多种甲基化的擦除。为了验证这个假设，我们用无毒性，不影响2细胞或4细胞胚胎活力的L-2-HG浓度(图5中的A和图5中的B)处理体外发育的胚胎。

当从合子期开始用2-HG处理胚胎后，与对照组(未进行2-HG处理)相比，胚胎从合子到4细胞的过程中H3K4me3和H3K9me3的整体擦除都会受到影响或者出现异常的高甲基化(图6中的A和图6中的B)。

我们还发现加入L-2-HG不仅改变了组蛋白修饰水平，还导致胚胎发育出现异常。虽然胚胎囊胚形成率降低不明显，但是体外培养到囊胚之后更容易出现崩塌，而且也没有囊胚从透明带孵出(图7中的A)。通过DAPI标记细胞核发现，加入L-2-HG之后，细胞数量减少而且囊胚腔面积减小(图7中的A)。

图7中的B展示了加入L-2-HG之后胚胎典型的形态变化。为了进一步研究L-2-HG作用时期，我们在胚胎体外培养不同时间进行L-2-HG的处理(图7中的C)，经过对胚胎发育速度统计发现，在早期加入L-2-HG对更容易阻碍胚胎的发育。尤其全程加入L-2-HG组，没有囊胚能够孵出，而在3.5dpc组(E组)，体外培养到6.5dpc时有30.8％的囊胚可以从透明带孵出(图7中的D)。此外，我们分析了加入L-2-HG和dm-α-KG之后胚胎发育到囊胚期的转录组变化。GSEA分析发现加入L-2-HG之后，胚胎TCA循环与多能性基因表达减少(图9中的A)。相反，在胚胎加入能够耐受的0.15mM的dm-α-KG的处理之后，胚胎TCA循环与多能性基因表达增加(图9中的B)。荧光定量PCR也证实了在α-KG促进多能基因Nanog表达，而L-2-HG降低了Nanog表达(图9中的C)，表明这两种竞争性分子对胚胎发育具有相反的作用。

有趣的是，将L-2-HG转化为α-KG的酶L2HGDH在2细胞时期胚胎高表达。已发表的转录组数据以及早期胚胎qPCR都证明L2HGDH在2细胞开始表达，到达4细胞后达到最大值，而之后，将逐渐减低(图8中的A和图8中的B)。另外L2HGDH蛋白水平和转录组一致，受精卵不存在，2细胞开始表达且4细胞最高，8细胞囊胚期都明显减少(图8中的C)。免疫组化检测了小鼠卵巢中L2HGDH，发现在卵巢原始卵泡与初级卵泡中L2HGDH都不存在(图8中的D)。由此我们可以看出L2HGDH在卵子与胚胎中的表达变化与2-HG在卵子高、受精后下降是一致的。根据L2HGDH能够减少L-2-HG含量，我们在受精卵中敲除L2HGDH(图8中的E)，检测到H3K4me3和H3K9me3组蛋白修饰都增强(图8中的G和图8中的H)。在此基础上再用L-2-HG处理，这种效应会被进一步放大(图8中的G和图8中的H)，表明在没有L2HGDH的情况下L-2-HG的积累会阻碍组蛋白甲基化的擦除。qPCR检测发现胚胎注射siRNA干扰后2细胞和4细胞中L2HGDH转录水平都明显降低(图8中的F)。这些数据表明，受精后和植入前胚胎发育过程中L-2-HG的减少是组蛋白甲基化擦除所必需的，L-2-HG的积累会阻碍这种表观遗传重塑过程并影响胚胎发育。由于L2HGDH能够将2-HG转换成α-KG，我们在受精卵中过表达L2HGDH，使得受精卵阶段开始2-HG的含量进一步下降(图8中的I)，发现这些受精卵的体外核移植成功率(SCNT)相比于对照组更高。说明受精卵阶段2-HG水平的降低能够促进胚胎发育。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。