用于抑制乙型肝炎病毒的基因表达的组合物和方法
阅读说明：本技术 用于抑制乙型肝炎病毒的基因表达的组合物和方法 (Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis b virus ) 是由 D·钦 J·德科特 M·霍斯巴赫 M·约翰 于 2012-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于抑制乙型肝炎病毒的基因表达的组合物和方法。本发明涉及用于抑制乙型肝炎病毒基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)。本发明也涉及含有编码相同的所述dsRNA或核酸分子或载体和药学上可接受的载体的药物组合物；使用所述药物组合物治疗乙型肝炎病毒感染引起的疾病的方法；以及在细胞中抑制乙型肝炎病毒基因的表达的方法。(The present invention relates to compositions and methods for inhibiting the expression of genes of hepatitis b virus. The present invention relates to double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) for inhibiting expression of a hepatitis b virus gene. The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising a nucleic acid molecule or vector encoding the same and a pharmaceutically acceptable carrier; a method for treating a disease caused by hepatitis B virus infection using the pharmaceutical composition; and methods of inhibiting expression of a hepatitis B virus gene in a cell.)
本申请为分案申请，原申请的申请日为2012年6月28日，申请号为201610903171.4，发明名称为“用于抑制乙型肝炎病毒的基因表达的组合物和方法”。
背景技术
本发明涉及双链核糖核酸(dsRNA)，以及它们在介导RNA干扰以抑制对于乙肝病毒基因的复制和致病必要的基因表达中的应用，尤其在病毒聚合酶、表面抗原、e-抗原和X蛋白的抑制中。另外，所述双链核糖核酸治疗或预防乙型肝炎病毒感染导致的慢性肝病/疾病、炎症、纤维化病症和增殖性疾病如癌症的应用也是本发明的一部分。
乙型肝炎病毒是严格亲肝的含双链DNA的病毒。虽然DNA是遗传物质，其复制循环涉及反转录步骤以从前基因组RNA复制为DNA。为了完成这个必要的步骤，病毒编码的聚合酶具有反转录活性。乙型肝炎病毒被分类为肝脱氧核糖核酸病毒(Hepadnaviruses)的一个成员并且属于肝脱氧核糖核酸病毒科。成人初次感染乙型肝炎病毒引起具有器官炎症、发热、黄疸和血液中肝转氨酶升高的症状的急性肝炎。约95％的急性肝炎不需要治疗就能痊愈。这些不能克服病毒感染的病人在多年内经受慢性疾病过程，具有增加的发展成肝硬化或肝癌的风险。乙型肝炎病毒感染的母亲向新生婴儿的母婴传播也引起慢性肝炎。慢性乙型肝炎病毒感染的治疗选择是有限的并且仅仅在一些情况下导致完全和持续地缓解。在共同感染了丙型肝炎、丁型肝炎或人免疫缺陷病毒的乙型肝炎病毒的患者中出现另外的临床和治疗并发症。
乙型肝炎病毒通过血液或血液制品、精液、阴道分泌物或唾液传播。药物滥用和性交是危险的活动并且促进病毒的传播。破损的粘液型的上皮细胞与污染的体液的接触可能足以感染。孵育时间为40-200天。感染的风险与传播的乙型肝炎病毒颗粒成比例。婴儿经常由他们的乙型肝炎病毒携带的母亲母婴感染，在地方性区域是主要的健康问题。
大约20亿人被感染乙型肝炎病毒并且4亿人是慢性携带者。高度流行的地区是非洲和东南亚，当地累计有20-80％的感染的人。
基于序列同源性，乙型肝炎病毒被分类为A-H的基因型，A-D基因型是最重要的基因型。基因型A在北欧-西欧、美国、南美洲和中美洲常见。基因型B和C主要在中国、日本、印度尼西亚和其他东亚国家中。基因型D在南欧、北非和南非发现。不同基因型之间的疾病进程和对于药物治疗的反应不同。
感染性乙型肝炎病毒颗粒具有约42nm的直径。外膜双层含有大、中和小型的表面蛋白。用于病毒表面蛋白结合和内化的关联的肝细胞受体未知。很多拷贝的核心蛋白形成在病毒颗粒内的球形核衣壳结构。每个核衣壳携带作为遗传物质的部分双链DNA和病毒聚合酶。
在被肝细胞摄入之后，核衣壳被转移至核并且释放DNA。此时，DNA链合成完成并且修复缺口得到环状共价闭合(circular covalently closed)(ccc)的3.2kb的超螺旋DNA。cccDNA作为四个主要病毒mRNA转录的模板，其为3.5、2.4、2.1和0.7kb长。所有的mRNA是5'-加帽并且在3'-末端多腺苷酸化。在所有四个mRNA的3'-末端存在重叠序列。
3.5kb mRNA作为用于核心蛋白和生产聚合酶的模板。此外，相同的转录物作为前基因组复制中间体并且允许病毒聚合酶引发反转录为DNA。需要核心蛋白用于核衣壳形成。另外，顺序加工活动(sequential processing activity)将一些核心蛋白转化为可分泌的e-抗原。在血液中富含e-抗原与乙型肝炎病毒在肝脏中的复制相关并且作为监测疾病过程的重要诊断标记。
2.4和2.1kb mRNA携带用于表达病毒大、中和小型表面抗原的开放阅读框pre-Sl、pre-S2和S2。s-抗原与感染性、完整颗粒相关。另外，感染的患者的血液也含有单独来自s-抗原，不含基因组DNA或聚合酶的非感染性颗粒。这些颗粒的功能还未完全知晓。完全和持续的在血液中检测不到s-抗原被认为是乙型肝炎病毒清除，由此成功治愈的可靠指标。
0.7kb mRNA编码X蛋白。这个基因产物对于病毒基因的有效转录很重要并且也作为宿主细胞基因表达的反式激活蛋白。后者的活性似乎对于在肝癌发展中肝细胞转化很重要。
重组乙型肝炎病毒s-抗原被用作疫苗接种。在第1天、第4周和第6个月的3个剂量的配制s-抗原的注射通常诱导充足效价的中和抗体。疫苗接种的患者被保护10年或者更久。然而，这个疫苗没有用于治疗的替代品。
由于天然缓解率高，患有急性乙型肝炎病毒感染的患者不能被治疗。然而，这些具有超过6个月的在血液中可检测的s-抗原、e-抗原或病毒DNA的患者被认为是受到慢性感染。作为逆转录酶活性抑制剂的核苷类似物是很多患者的首选治疗选项。拉米夫定(Lamivudine)、替诺福韦(Tenofovir)或恩替卡韦(Entecavir)抑制乙型肝炎病毒的复制，有时达到不可检测的水平。肝功能的改善和肝炎症的减少是最重要的益处。然而，只有很少的患者在治疗结束之后实现完全和持续的缓解。此外，乙型肝炎病毒在增加的治疗持续期间产生药物耐药性。对于同时感染了乙型肝炎病毒和人免疫缺陷病毒的患者而言这是特别困难的。两种病毒都易受核苷类似物药物的影响并且可能共同产生耐药性。
第二个治疗选项是给予干扰素-α。在此，患者在6个月期间接受高剂量的干扰素-α。取决于病毒基因型，最高50％的慢性感染是可治愈的。然而，亚洲基因型B有非常低的反应率。与丁型肝炎病毒或人免疫缺陷病毒同时感染使得干扰素-α完全无效。有严重肝损伤和严重纤维化症状的患者不能进行干扰素-α治疗。
尽管在乙型肝炎病毒治疗领域中有显著进步，仍然存在需要能够在慢性感染的患者中选择性和有效地沉默病毒的基因表达、阻断复制并且连续减少病毒负荷的药剂。
双链RNA分子(dsRNA)已经显示以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调节机制阻断基因表达。本发明提供了双链核糖核酸分子(dsRNA)，和用于抑制乙型肝炎病毒基因表达的组合物以及方法，尤其是在细胞、组织或哺乳动物中使用这样的dsRNA抑制乙型肝炎病毒基因的表达。本发明也提供了用于治疗或预防由乙型肝炎病毒感染引起的病理状况和疾病如慢性肝脏疾病/病症、炎症、纤维化病症和增殖性疾病，如癌症。