HADHA mRNA的干扰序列及其验证方法

文档序号：30201 发布日期：2021-09-24 浏览：14次 >En<

阅读说明：本技术 HADHA mRNA的干扰序列及其验证方法 (Interfering sequence of HADHA mRNA and verification method thereof ) 是由王娟娟张�杰练杨华黄亚运于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种干扰序列,具体涉及HADHA mRNA的干扰序列及其验证方法,所述干扰序列的正义链如SEQ ID NO：1所示,所述干扰序列的反义链如SEQ ID NO：2所示；所述干扰序列的正向引物如SEQ ID NO：7所示,所述干扰序列的反向引物如SEQ ID NO：8所示。本发明还提供了上述干扰序列的验证方法,将序列构建在真核表达载体上,并以慢病毒包装的形式干扰靶基因的mRNA水平,从而降低靶蛋白的表达。本发明所提供的干扰序列可以有效的降低目的蛋白的表达,具有针对性强,保守性好,稳定性高的优点；同时该方法还可以得到稳定表达的细胞株,对于后续基础功能试验具有重要的意义。(The invention relates to an interference sequence, in particular to an interference sequence of HADHA mRNA and a verification method thereof, wherein a sense strand of the interference sequence is shown as SEQ ID NO: 1, and the antisense strand of the interference sequence is shown as SEQ ID NO: 2 is shown in the specification; the forward primer of the interference sequence is shown as SEQ ID NO: 7, and the reverse primer of the interference sequence is shown as SEQ ID NO: shown in fig. 8. The invention also provides a verification method of the interference sequence, which constructs the sequence on a eukaryotic expression vector and interferes the mRNA level of a target gene in a lentivirus packaging mode, thereby reducing the expression of the target protein. The interference sequence provided by the invention can effectively reduce the expression of the target protein and has the advantages of strong pertinence, good conservative property and high stability; meanwhile, the method can also obtain a stably expressed cell strain, and has important significance for subsequent basic function tests.)

技术领域

本发明涉及一种干扰序列，具体涉及HADHA mRNA的干扰序列及其验证方法。

背景技术

HADHA是线粒体三功能蛋白（Mitochondrial trifunctional protein，缩写TFP）的α亚基，是脂质代谢过程的重要因子，其分子量约为78-83 kDa。线粒体三功能蛋白是一种位于线粒体内膜上的蛋白质，其主要功能是催化线粒体长链脂肪酸β-氧化四个步骤循环中的2、3、4三步，它是一个异源八聚体，由四个α亚基（HADHA）和四个β亚基（HADHB）组成。其中，HADHA具有长链3-羟烷基辅酶A脱氢酶（long-chain 3-hydroxyacylcoenzyme Adehydrogenase，简称LCHAD）和烯脂酰辅酶A水合酶（enoyl-coenzyme A hydratase，简称ECH）活性，HADHB具有3-酮脂酰辅酶A硫解酶（3-ketoacyl-coenzyme A thiolase，简称KACT）活性。HADHA基因突变或者HADHA酶活性缺失（小于正常酶活性的50%）会导致出现LCHAD缺陷相关病症，这是一类线粒体脂肪酸β-氧化代谢紊乱病症，例如低血糖、嗜睡、心肌病、癫痫、色素性视网膜炎、昏迷、以及猝死等。

很多研究报道，HADHA与癌症的发病机制、预后、诊断等相关。2009年，Kim等人研究发现，肝癌细胞中HADHA的表达量明显低于正常细胞；2011年，Kageyama等人在研究肺癌病人化疗反应中发现，顺铂耐药性病人的HADHA具有较高水平的表达，预示HADHA在顺铂耐药方面可能具有一定的作用，或许可以作为肺癌化疗反应的预示标志；2012年，Manju研究小组发现，在乳腺癌尤其是转移性和复发性乳腺癌中，HADHA的表达量明显降低；2015年，Zhao等人研究表明，肾透明细胞癌中HADHA的表达量明显降低，并且HADHA的表达量与癌症的等级、转移性以及病人生存率紧密相关，HADHA可以成为肾透明细胞癌诊断或治疗的分子靶标；2019年，Kouhei Yamamoto研究小组发现，恶性淋巴瘤组织的HADHA有高表达趋势，可能会成为恶性淋巴瘤新的治疗靶标。

此外，HADHA功能涉及到miRNA、自噬和凋亡等过程。2015年，Pavan KumarKakumani等人报道，在细胞质中HADHA与Dicer酶共定位，参与Dider复合体的形成，并且高表达HADHA导致细胞内成熟miRNA的水平升高，说明HADHA在miRNA的产生以及RNAi干扰过程中有一定作用；2017年，Chiaki Maeyashiki研究小组发现，HADHA可以与LC3共定位并相互作用，参与细胞自噬及其他细胞死亡过程。

综上所述，HADHA蛋白参与脂质代谢、肿瘤诊断与治疗、miRNA、自噬及凋亡等重要生理过程，通过一定技术手段对其表达量进行调控对于了解各种生理病理过程会具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供HADHA mRNA的干扰序列。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

HADHA mRNA的干扰序列，其特征在于，所述干扰序列的正义链如SEQ ID NO：1所示，所述干扰序列的反义链如SEQ ID NO：2所示。

其中，所述干扰序列的正向引物如SEQ ID NO：7所示，所述干扰序列的反向引物如SEQ ID NO：8所示。

本发明提供了上述HADHA mRNA的干扰序列的验证方法，包括以下步骤：（1）将干扰序列的正反引物克隆构建在真核表达载体质粒上；（2）将步骤（1）中构建好的质粒与一个包装质粒、一个穿梭质粒混合进行转染，并使用293T细胞包装慢病毒；（3）将慢病毒感染目的细胞并进行puromycin药物的筛选；（4）收集细胞进行western blot及Immunofluorescence验证。

其中，步骤（1）中所用的真核表达载体质粒为pLVX-sh-zsGreen-Puro。

其中，步骤（2）中所用的包装质粒为pMD2.G。

其中，步骤（2）中所用的穿梭质粒为psPAX2。

其中，步骤（3）中的目的细胞为hela细胞。

本发明经过严密的设计步骤，在保证特异性的基础上，设计了人源的HADHA mRNA的干扰序列，将序列构建在真核表达载体上，并以慢病毒包装的形式干扰靶基因的mRNA水平，从而降低靶蛋白的表达。本发明所提供的干扰序列可以有效的降低目的蛋白的表达，具有针对性强，保守性好，稳定性高的优点；同时该方法还可以得到稳定表达的细胞株，对于后续基础功能试验具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明真核表达载体pLVX-sh-zsGreen-Puro质粒结构图；

图2为本发明穿梭质粒psPAX2质粒结构图；

图3为本发明包装质粒pMD2.G质粒结构图；

图4为三条干扰序列抑制 hela 细胞中（基因）蛋白的表达western blot检测图；

图5为本发明PLVX-HADHA-siRNA-3抑制 hela 细胞中（基因）蛋白的表达免疫荧光图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1 HADHA-shRNA引物设计

（1）引物设计的原则

a. 从CDS区（如SEQ ID ：17所示）的25bp 开始到CDS区终端前150bp 处结束。每个连续的19-21bp 都做为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19-21bp个碱基；

b. 19-29个核苷酸的siRNA序列通常是最有效的。长于30个核苷酸可导致非特异性沉默；

c. 在引物中不能出现连续四个相同的碱基；

d. GC含量最好在40%-50% 之间，对于GC含量在小于25%大于60%的引物弃用；

e. 不能出现连续7个G/C 碱基；

f. 21bp 或19bp 的引物中的碱基自身不能出现颈环结构；

g. 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列；

h. 5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录；

i. 由于mRNA往往高度折叠并于调控蛋白结合的，应该要在不同位点选择3个左右靶序列；

j. 避免设计含有4-6个poly（T）的序列，因为它会作为RNA合成酶III的终止信号；

k. 检查以确保您的siRNA序列与其他编码序列没有同源性；

l. 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。

（2）引物设计的步骤

根据shRNA引物设计的原则选中3-5条备选区段，然后对备选区域进行比对，即用NCBI中的Blast功能，输入比对序列，选择Human genomic plus transcript (Human G+T)，进行Blast 比对。在比对的结果中主要注意两点，一是要与目的基因的序列完全匹配；二是不能与非目的基因的5端和3端有超过3个及以上的碱基重合，确保shRNA引物的特异性。

片段设计好之后，设计成含有载体框架的完整的引物，我们一共选择了三条HADHAmRNA的RNA干扰序列，分别称为：HADHA-shRNA-1，HADHA-shRNA-2，HADHA-shRNA-3。

HADHA-shRNA-1：

正义链：5’-TGTGGCAGTTGTTCGAATTAA-3’；（如SEQ ID NO：1）

反义链：5’-TTAATTCGAACAACTGCCACA-3’；（如SEQ ID NO：2）

HADHA-shRNA-2：

正义链：5’-TTGCCATTTCATGCCAATACAGA-3’；（如SEQ ID NO：3）

反义链：5’-TCTGTATTGGCATGAAATGGCAA-3’；（如SEQ ID NO：4）

HADHA-shRNA-3：

正义链：5’-CCTGTGCAAGAAGAATAAATT-3’；（如SEQ ID NO：5）

反义链：5’-AATTTATTCTTCTTGCACAGG-3’；（如SEQ ID NO：6）

上述各干扰序列的引物如下所示：

HADHA-shRNA-1正向引物：（如SEQ ID NO：7）

GATCCG--TGTGGCAGTTGTTCGAATTAA--TGTGCTT--TTAATTCGAACAACTGCCACA--TTTTTTC

HADHA-shRNA-1反向引物：（如SEQ ID NO：8）

AATTGAAAAAA--TGTGGCAGTTGTTCGAATTAA--AAGCACA--TTAATTCGAACAACTGCCACA--CG

HADHA-shRNA-2正向引物：（如SEQ ID NO：9）

GATCCG--TTGCCATTTCATGCCAATACAGA--TGTGCTT--TCTGTATTGGCATGAAATGGCAA--TTTTTTC

HADHA-shRNA-2反向引物：（如SEQ ID NO：10）

AATTGAAAAAA--TTGCCATTTCATGCCAATACAGA--AAGCACA--TCTGTATTGGCATGAAATGGCAA--CG

HADHA-shRNA-3正向引物：（如SEQ ID NO：11）

GATCCG--CCTGTGCAAGAAGAATAAATT--TGTGCTT--AATTTATTCTTCTTGCACAGG--TTTTTTC

HADHA-shRNA-3反向引物：（如SEQ ID NO：12）

AATTGAAAAAA--CCTGTGCAAGAAGAATAAATT--AAGCACA--AATTTATTCTTCTTGCACAGG--CG

实施例2

HADHA mRNA的干扰序列，所述干扰序列的正义链如SEQ ID NO：1所示，所述干扰序列的反义链如SEQ ID NO：2所示。所述干扰序列的正向引物如SEQ ID NO：7所示，所述干扰序列的反向引物如SEQ ID NO：8所示。

上述HADHA mRNA的干扰序列的验证方法，包括以下步骤：（1）采用Blast比对特异性；（2）将干扰序列的正反引物克隆构建在真核表达载体质粒上；（3）将步骤（2）中构建好的质粒与一个包装质粒、一个穿梭质粒混合进行转染，并使用293T细胞包装慢病毒；（4）将慢病毒感染目的细胞并进行puromycin药物的筛选；（5）收集细胞进行western blot及Immunofluorescence验证。

其中，步骤（2）中所用的真核表达载体质粒为pLVX-sh-zsGreen-Puro。

其中，步骤（3）中所用的包装质粒为pMD2.G。

其中，步骤（3）中所用的穿梭质粒为psPAX2。

其中，步骤（4）中的目的细胞为hela细胞。

实施例3

HADHA mRNA的干扰序列的验证方法，包括以下步骤：

一、pLVX-HADHA-siRNA 载体的构建

采用化学合成法合成包含正反义链的正反向引物，退火形成双链，与酶切后的真核表达载体pLVX-sh-zsGreen-Puro（图1）进行连接，该载体在细胞内转录出具有发夹结构的siRNA 能与该基因的mRNA 结合，切断mRNA, 干扰mRNA的表达。

（1）序列的退火连接：

将正反向引物按照说明加入一定体积的灭菌的双蒸水，使其浓度到达100um。在PCR仪中缓慢退火，退火条件：95℃，10min；75℃，10min；55℃，10min；35℃，10min；15℃，10min；10℃，10min；4℃保温。

引物退火体系( 10ul )：正向引物F 1ul、反向引物R 1ul、10×T4 ligase Buffer1ul、ddH2O 7ul。

退火后正反向引物形成带有粘性末端(BamH I 与 EcoR I)的双链片段。

（2）载体pLVX-sh-zsGreen-Puro 的酶切

酶切体系( 10ul )：BamH I 0.5ul、EcoR I 0.5ul、pLVX-sh-zsGreen-Puro 2ug、ddH₂O up to 10ul。

37℃ 酶切2h ，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。

（3）退火双链片段与酶切后的载体的连接

a.退火双链片段稀释400倍；

b.连接体系（10ul）：稀释片段3ul、酶切pLVX载体1ul、10×ligase buffer 1ul、T4ligase 1ul、ddH₂O 4ul；

体系配好后放入PCR仪22℃，连接4h。

（4）连接好的载体进行转化涂板

a. 连接完成的重组质粒，在PCR仪中65℃灭活10min。

b. 将100μl感受态细胞于冰上解冻。

c. 取10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物，在冰上放置30min。

d. 将管放入预加温到42℃的水浴中,热激90秒.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却5分钟。

e. 每管中加800μl SOB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。

f . 室温6000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含Amp抗性的LB琼脂平板表面。

g. 涂布平皿，倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。

（5）PCR鉴定和测序鉴定

在插入编码shRNA的DNA双链模板上游和载体序列下游设计鉴定PCR引物，扩增片段在700bp左右，做菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定时所用的引物为：正向引物HADHA-shRNA-1（如SEQ ID NO：7所示），HADHA-shRNA-2（如SEQ ID NO：9所示），HADHA-shRNA-3（如SEQ IDNO：11所示）相对应的正向引物，反向引物为：5’-CACGCCTACCGCCCATTTGCG-3’（如SEQ IDNO：13所示），PCR反应体系为：正向引物 2ul、反向引物2ul，dNTP 8ul、Buffer 20ul、甘油10ul、加ddH2O到100ul；PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃30s、50℃ 30s、72℃ 50s、30个循环，72℃ 10min。将PCR产物送样测序，测序结果如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16所示。

（6）检测质粒浓度

挑取单菌落于6mL试管液体培养37℃，12~16h,抽质粒,质粒中不能含有内毒素，用试剂盒抽提取，最后取5ul跑琼脂糖胶检测，观察条带是否单一。

二、慢病毒包装

（1）前一天在六孔板中铺293T细胞，使第二天细胞密度达到70%-90%左右。

（2）第二天早上准备做转染，包装慢病毒。转染时先将穿梭质粒PSPAX（图2）和包装质粒PMD2G（图3）按质量比2:1混合，然后将HEPES buffer与包装质粒配成预混液分装到1.5ml EP管。一个孔需HEPES buffer 100ul，包装质粒2ug，然后每管分别加入shRNA质粒2ug，混匀，最后每管分别加入转染试剂PEI 6.5ul混匀。然后操作台内室温放置30min，均匀的加入293T细胞，轻轻摇晃六孔板混匀，力度不要太大，然后把细胞放回37℃ CO₂培养箱培养。

（3）转染6h后给293T细胞换液，换完液以后将细胞放回CO₂培养箱，包装病毒大约48h。

三、慢病毒感染细胞

（1）提前一天把所需靶细胞（Hela细胞）铺好，要求细胞密度在第二天中午能达到60%左右。

（2）第二天下午做慢病毒感染。先将新鲜培养基与感染增强剂4λPolybrene预混，Polybrene终浓度为5μg-10μg/ml。

（3）准备2ml冻存管，做好标记，将293T细胞上清（含有慢病毒）收集到冻存管，4000rpm/min离心1min。

（4）将昨天铺的靶细胞上清去掉，加入离心后的慢病毒上清，再加入1ml混有Polybrene的新鲜培养基，轻轻摇晃混匀。2500rpm/min，30min 离心，最后取出6孔板放入37℃ CO₂培养箱培养过夜。

（5）病素感染细胞12小时后，给感染的靶细胞更换新鲜完全培养基。

四、Puromycin 药物筛选细胞

真核表达载体pLVX-sh-zsGreen-Puro质粒（图1）带有puromycin 抗性，转染进质粒的细胞不会被药物puromycin 杀死，而未转染进去的细胞会被puromycin 杀死，无法存活。

（1）在慢病毒感染靶细胞48h之后进行细胞的药物puromycin筛选；

（2）从培养箱中取出细胞，将培养基去除，加入少量胰酶润洗，吸去胰酶。再往每个孔中加入约700ul的胰酶，放入培养箱消化细胞。约3-5min（不同的细胞有差异）后取出细胞，加入正常的培养基，终止消化。

（3）吹打细胞，使细胞分散成单个细胞，转移到2ml的冻存管中，1200rpm，5min离心。

（4）弃上清，加入新鲜的培养基1ml，吹打细胞，之后转移到六孔板中。

（5）将每个孔中的培养基补齐至2ml，然后加入puromycin ，终浓度为1ug/ul。轻轻摇晃六孔板，使细胞分布均匀。放入37°培养箱培养。

（6）加入puromycin 筛选的每一天，都要密切的观察细胞状态，调整药物浓度。细胞大量死亡时，要减少药物的浓度。确保既有干扰效果，最后也能收到细胞。

（7）在puromycin 筛选一周后，一部分细胞制成裂解液，做western blot 检测。留一小部分细胞做IF检测。

五、plvx-HADHA-siRNA 敲低 HADHA 蛋白的表达鉴定

以化学合成的双链干扰RNA构建慢病毒载体plvx-HADHA-siRNA，通过慢病毒包装的形式，感染hela细胞，puromycin筛选，进行 western blot（图4）及Immunofluorescence（图5）鉴定，证实了plvx-HADHA-siRNA-1 确实能够显著敲低 HADHA 蛋白的表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

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<213> 人源(HADHA-shRNA-2)

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