阅读说明：本技术 生命早期营养 (Early life nutrition ) 是由 斯蒂芬·杜瓦尔 迈克·金德曼 莎拉·贾登·梅亚莱 迪亚高·巴勃罗·马尔加维 于 2020-04-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种减少反刍动物中甲烷排放的方法,所述方法包括用3-硝基氧基丙醇处理预反刍动物/幼龄反刍动物。(The present invention relates to a method for reducing methane emission in ruminants, said method comprising treating a pre-ruminant/young ruminant with 3-nitrooxypropanol.)

具体实施方式

已经发现，根据本发明，通过在出生后立即给小牛补充3-硝基氧基丙醇直到断奶后三周(14周龄)，可以实现被补充动物甲烷排放的持续减少，即使在补充3-硝基氧基丙醇已停止后很久。经处理的动物即使在60周龄后也表现出较低的甲烷排放，表明该影响一直持续到以后的生活。有趣的是，产甲烷菌的总数并未减少。此外，未观察到对宿主动物性能的不利影响。

因此，在第一个实施方案中，本发明涉及一种减少成年反刍动物中甲烷排放的方法，所述方法包括在预反刍动物阶段向所述反刍动物给予有效量的3-硝基氧基丙醇，并任选地评价甲烷减少效果，优选评价长期甲烷减少效果。任选地，给予延长到幼龄反刍动物阶段。

甚至更优选地，将3-硝基氧基丙醇从出生至最大6个月龄，优选至最大5个月龄，最优选至最大4岁龄给予反刍动物。

本发明还涉及一种减少成年反刍动物中甲烷排放的方法，该方法包括将有效量的3-硝基氧基丙醇给予希望作为成年反刍动物减少甲烷排放的健康新生反刍动物。

本发明的另一方面是，在所述反刍动物的预反刍动物阶段中，任选地延长到幼龄反刍动物阶段，通过使用口服给予的3-硝基氧基丙醇减少来自健康反刍动物消化活动的甲烷。

本发明的另一方面是，3-硝基氧基丙醇在预反刍动物中的(非治疗性)用途，以通过减少所述反刍动物的终生总甲烷排放(与未处理的反刍动物)来减轻气候变化(即有助于减少全球大气变暖)。

本发明还涉及用于减少成年反刍动物中甲烷排放和/或用于减少反刍动物的终生总甲烷排放(与相应的未处理的反刍动物相比)的饲养方法，包括：

(1)将包含3-硝基氧基丙醇的膳食给予处于预反刍动物和任选的幼龄反刍动物阶段的所述反刍动物，然后，

(2)向成年反刍动物给予不含3-硝基氧基丙醇的膳食。

本发明还包括用于降低反刍动物中的甲烷排放的试剂盒，所述试剂盒其包含：

a.)3-硝基氧基丙醇的至少一种剂型，所述剂型优选口服剂型；和

b.)说明书，向潜在用户说明在预反刍动物期和任选的幼龄反刍动物阶段中向反刍动物给予3-硝基氧基丙醇以减少成年反刍动物中的甲烷排放的益处。

在另一个实施方案中，本发明涉及低甲烷排放反刍动物，其特征在于所述反刍动物通过在预反刍动物阶段用3-硝基氧基丙醇补充所述反刍动物获得。所述反刍动物的特征特别在于以下事实：与相应的未经处理的反刍动物相比，所述反刍动物的终生总甲烷排放量较低。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种影响反刍动物的瘤胃的微生物定殖模式的方法，所述方法包括在预反刍动物阶段向所述反刍动物给予有效量的3-硝基氧基丙醇的步骤。

定义

所谓的“预反刍动物阶段(pre-ruminant phase)”是在反刍动物生命中消化功能更类似于单胃动物的时间。预反刍动物阶段通常发生在小牛出生后的最初几周，此时小牛主要摄取奶或代奶品。根据提供的食物类型和动物的预期用途，预反刍动物阶段可能会更短或更长。在第二阶段，即所谓的“幼龄反刍动物阶段(young ruminant phase)”或“断奶后阶段”期间，瘤胃正在发育，但仍不能完全达到成年动物的效率水平。成年反刍动物发育的最后阶段发生在瘤胃被认为具有完全功能时，通常发生在12周龄(例如参见Teagasc 2017:Rumen development,Section 4；Chapter 12,page 60(https://www.teagasc.ie/media/website/publications/2017/Section4-Rumen-development.pdf)or Rearing YoungStock on Tropical Dairy Farms in Asia(John,Moran),chapter 3:Digestion offeeds in the milk fed calf:page 27)。

在本发明的含义内，术语“预反刍动物期”是指仍(至少部分)尚未断奶的动物，而术语“幼龄反刍动物”是指瘤胃仍未完全发育的阶段但小牛已经断奶(即不再接受任何奶)的阶段。

在本文中，反刍动物是哺乳纲的偶蹄目(the order Artiodactyla)动物，其消化基于植物的饲料，首先在动物的第一个胃(称为瘤胃)中将基于植物的饲料软化，然后反刍半消化的物质(现在称为反刍食物(cud)))并再咀嚼。再次咀嚼反刍食物以进一步分解植物物质并刺激消化的过程称为“反刍”。反刍哺乳动物包括牛、牛、山羊、绵羊、长颈鹿、鹿、瞪羚和羚羊。本发明的所有实施方案的优选反刍动物是驯养牛、驯养绵羊和驯养山羊。在根据本发明的所有实施方案中，最优选的反刍动物是家牛及其小牛。术语“牛”包括驯养牛的所有品种和所有生产类型的牛(例如奶牛、放牧牛和肉牛)。特别优选的是放牧牛，因为它们在生命后期(即成年期)难以获得补充。

在本文中，“产甲烷菌”是产生甲烷作为代谢副产物的微生物。它们是原核生物，属于古细菌领域。通常，它们也被称为产甲烷古菌。它们与各种细菌、原生动物和真菌一起存在于瘤胃中。

“抗产甲烷化合物”是可用于抑制此类产甲烷古细菌的活性以减少甲烷排放的化合物，例如来源于反刍动物的消化活动的甲烷。

3-硝基氧基丙醇(CAS-No：100502-66-7)是一种已知的化合物，它可以例如如WO-2004043898或WO-2012084629中所述制备。其合适的制剂例如在WO-2018149755、WO-2018149756、WO-2018091643或WO-2019007740中公开。

如本文所用，术语“饲料”是指适合于或旨在供相应动物摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物并且不仅限于营养材料。

如本文所用，术语“食用油或溶剂”是指饲料应用中常用的油或溶剂。本发明所有实施方案中优选的食用油或溶剂是丙二醇、玉米油、菜籽油、葵花油、中链甘油三酯(middlechain triglyceride，MCT)和甘油以及它们的混合物。

如本文所指的甲烷排放和甲烷减少可以通过本领域已知的方法(Grainger etal.,2007J.Dairy Science；90:2755-2766)在代谢仓(metabolic chamber)中对个体动物中测量。此外，还可以通过使用激光束的新兴技术在畜栏级别进行评估(McGinn et al.,2009,Journal of Environ-mental Quality；38:1796-1802)。或者，也可以用GreenFeed系统(C-Lock，Rapid City，SD USA)评估通过反刍动物产生的甲烷，这种方法是优选的。

术语“微生物定殖模式(microbial colonialization pattern)”是指特定的瘤胃微生物组成(也称为瘤胃微生物群落)，其在反刍动物的最初几小时、几天和几周内形成，然后在动物的整个生命周期中持续存在。所述瘤胃微生物群主要由细菌、古细菌(例如特别是产甲烷古细菌)、原生动物和真菌组成。

如本文所用，术语“从出生”是指出生后至多3天，优选至多出生后2天，最优选至多出生后1天的时间跨度。最优选地，3-硝基氧基丙醇的补充从第一次补充饲料开始，而不是通过哺乳开始。

剂量和给予

3-硝基氧基丙醇至少在预反刍动物阶段给予。然而，更优选地，3-硝基氧基丙醇的给予至少部分地延长至断奶后(即幼龄反刍动物)阶段，例如另外给予1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。

因此，有利地，3-硝基氧基丙醇从出生到断奶后最多8周给予反刍动物。

或者，在本发明的所有实施方案中，3-硝基氧基丙醇，优选从出生至最大6个月龄、优选至最大5个月龄，最优选至最大4个月龄，例如至最大3个月龄，给予反刍动物。

在本发明的所有实施方案中，优选在所述确定的给予期后完全停止补充3-硝基氧基丙醇(即不延长到成年期)。

3-硝基氧基丙醇可以每天或每两天或每周给予。优选地，在本发明的所有实施方案中，每天给予3-硝基氧基丙醇，例如至少每天一次。

此外，优选地，将3-硝基氧基丙醇口服给予预反刍动物/幼龄反刍动物。

给予预反刍动物/幼龄反刍动物的3-硝基氧基丙醇的量优选在每只动物每天10mg至10g 3-NOP的范围内选择，优选在每只动物每天50mg至5g 3-NOP的范围内选择，更优选地在每只动物每天75mg至2.5g 3-NOP的范围内选择。其他合适的范围包括每只动物每天100mg至2g 3-NOP或每只动物每天100mg至500mg 3-NOP。

在另一个并且更优选的实施方案中，给予预反刍动物/幼龄反刍动物的3-硝基氧基丙醇的量在0.1mg至15mg 3-NOP/kg体重(BW)的范围内选择，更优选在0.5至10mg 3-NOP/kg BW的范围内选择，最优选在1至5mg 3-NOP/kg BW的范围内选择，例如2mg至4mg 3-NOP/kg BW的范围内选择。

本领域技术人员可以理解，所喂养的3-硝基氧基丙醇的总(每日)量可以根据动物种类、动物大小和3-硝基氧基丙醇或其制剂或组合物所加入的饲料类型而变化。

总(每日)量的3-硝基氧基丙醇可以单剂量给予，或分多个剂量给予，例如早上一剂且晚上一剂。

在本发明的所有实施方案中，可以原样使用3-硝基氧基丙醇。然而，优选地，3-硝基氧基丙醇以其制剂的形式，即以包含3-硝基氧基丙醇和合适的载体材料的组合物的形式(本文也称为“3-NOP制剂”)使用。3-硝基氧基丙醇或其制剂可以原样给予到预反刍动物/幼龄反刍动物或可以混合到预反刍动物/幼龄反刍动物饲料中。

3-NOP制剂的合适载体包括食品和饲料工业中众所周知的任何载体，例如水、食用油或溶剂，例如优选丙二醇、硅土(silica)二氧化硅(silicon dioxide))、硅藻土以及海泡石，但不限于此。本发明最优选的载体材料是硅土、丙二醇或水以及它们的混合物。

3-NOP制剂可以配制成适合直接给予预反刍动物/幼龄反刍动物或混合到预反刍动物/幼龄反刍动物饲料中的任何形式。用于直接给予或混合的合适固体形式是例如粉末、颗粒或丸剂。用于直接给予或混合的合适的液体形式是例如溶液或悬浮液。3-NOP制剂也可以是受控(延迟)释放制剂的形式。

本发明的3-NOP制剂中的3-硝基氧基丙醇的量，基于制剂的总重量，优选在0.1至20重量％的范围内选择，更优选在0.5至15重量％的范围内选择，最优选在1至12重量％的范围内选择。

本发明的3-NOP制剂优选混入预反刍动物或幼龄反刍动物的饲料给予，或者与预反刍动物或幼龄反刍动物的饲料一起给予。

固体3-NOP制剂

在一个有利的实施方案中，3-NOP制剂是固体制剂，例如优选包含3-NOP和固体载体材料的干燥、自由流动的粉末(本文也称为3-NOP粉状制剂)或包含3-硝基氧基丙醇的丸粒。此类固体制剂适用于直接饲喂预反刍动物/幼龄反刍动物，或包含在可商购的预反刍动物/幼龄反刍动物饲料中或作为总混合日粮或膳食的补充物。当通过预反刍动物/幼龄反刍动物饲料补充时，固体制剂通常与固体或液体饲料或与(饮用)水混合。

包含3-硝基氧基丙醇和固体载体材料的粉状制剂通常通过本领域的标准方法将3-NOP与固体载体材料混合来制备。或者，可以将3-NOP喷涂到固体载体材料上。例如，可以使用适用于制备食品或饲料产品的溶剂，例如二氯甲烷，将3-NOP喷雾到固体载体材料上，然后蒸发有机溶剂。

用于制备3-NOP粉状制剂的特别合适的固体载体包括硅土(二氧化硅)、硅藻土以及海泡石，但不限于此。本发明最优选的固体载体材料是硅土。

这种硅土是饲料和食品工业中众所周知的载体材料并且是指白色微球的无定形硅土(也称为二氧化硅)。本发明的特别合适的硅土是无定形沉淀硅土，例如IQE集团的Ibersil D-250、Evonik的Sipernat 2200或Solvay的Tixosil 68。

众所周知，3-NOP在喷雾到固体载体材料上或与固体载体材料混合之前，可以在合适的食用油或溶剂(液体载体)中稀释。

此外，本发明的3-NOP粉状制剂可以另外包含用于饲料的粉状制剂的制备中使用的常用添加剂，例如特别是增稠剂，其有利地选自树胶或纤维素衍生物例如黄原胶、刺梧桐树胶和/或乙基纤维素以及(微量)水。

本发明的3-NOP粉状制剂中3-硝基氧基丙醇的量，基于制剂的总重量，优选在1至20重量％的范围内选择，优选在2至15重量％的范围内选择，最优选在范围在4至12重量％的范围内选择。

优选地，至少一种食用油或溶剂存在于本发明的3-NOP粉状制剂中。此类粉状3-NOP制剂中食用油和/或溶剂的量，基于制剂的总重量，优选在0.1至50重量％的范围内选择，优选在1至45重量％的范围内选择，最优选在10至40重量％的范围内选择。

本发明的特别合适的3-NOP粉状制剂基本上由3-硝基氧基丙醇、丙二醇和硅土(二氧化硅)组成，例如基本上由以下成分组成：(i)2至12重量％的3-硝基氧基丙醇，(ii)20至40重量％的丙二醇、(iii)0至7重量％的水和(iv)硅土，其中成分(i)至(iv)的总量总计为100重量％。此类制剂例如在WO-2018149756或WO-2018149755中公开。

或者，3-硝基氧基丙醇可以以压片的形式补充，例如WO-2019007740中公开的。

液体3-NOP制剂

在另一个实施方案中，3-NOP制剂可以是液体制剂，所述液体制剂适合直接给予预反刍动物/幼龄反刍动物，或适合包含在可商购的预反刍动物/幼龄反刍动物饲料中，或作为总混合口粮或膳食的补充剂。

合适的3-NOP液体制剂包括例如3-NOP在水或食用油或溶剂(或它们的混合物)中的溶液，例如优选在丙二醇中的溶液。

众所周知，本发明的3-NOP液体制剂还可包含用于饲料液体制剂的制备中使用的或用于反刍动物的饮用水添加剂的常用添加剂，例如维生素、糖、盐和调味剂。

3-NOP液体制剂中的3-硝基氧基丙醇的量，基于制剂的总重量，优选在1至30重量％的范围内选择，优选在5至28重量％的范围内选择，最优选在10至25重量％的范围内选择。

特别合适的3-NOP液体制剂基本上由3-硝基氧基丙醇在水和/或丙二醇中的10至30重量％溶液组成。

预反刍动物/幼龄反刍动物饲料

为了实现本发明的用途，可以通过饲料制剂和加工领域中本身已知的方法将3-硝基氧基丙醇或其制剂例如优选其粉末或液体制剂掺入到预反刍动物/幼龄反刍动物饲料中。

因此，本发明的其他方面涉及含有3-硝基氧基丙醇或其制剂的预反刍动物和/或幼龄反刍动物饲料。

适合预反刍动物的饲料是奶或奶替代制剂(代奶品)。这种包含3-硝基氧基丙醇或其制剂的奶和奶替代制剂仍然是新的。

因此，本发明还涉及用于预反刍动物的奶或代奶品，其特征在于，所述奶或代奶品包含3-硝基氧基丙醇或其制剂。

术语奶或代奶品是指全脂奶、减脂奶和脱脂奶、滞销奶和复原奶代用品。“滞销奶”的定义是根据法律不能出售供人食用的奶。代奶品是一种配制饲料，旨在为小牛在生命的关键、早期哺乳或母乳喂养阶段替代母牛的奶。

代奶品通常包含18至30重量％的蛋白质和10至28重量％的脂肪，以及包含任选的其他添加剂和/或药物，其中18重量％至22重量％是最优选的脂肪含量。代奶品按照制造商的说明用水冲调，混合并喂食。

用于代奶品中的示例性蛋白质源是乳蛋白质，例如干乳清蛋白浓缩物、干乳清、干乳清产品、脱脂奶、干脱脂奶粉、酪蛋白以及酪蛋白酸钠或酪蛋白酸钙。替代蛋白质源包括大豆蛋白质分离物、蛋白质改性大豆粉、大豆浓缩蛋白、大豆粉、动物血浆以及小麦面筋或分离物、豆类蛋白质和豆类蛋白质分离物。合适的脂肪包括植物和动物脂肪及其馏分。示例性添加剂特别是碳水化合物，主要来自乳糖、氨基酸、(必需)维生素和微量矿物质以及地方当局认为可接受用于动物饲料的其他材料。

奶或复原代奶品中的3-硝基氧基丙醇的量优选在每升奶或复原代奶品约1mg至约1000mg、优选约1mg至约500mg、最优选约1mg至250mg 3-NOP的范围内选择。

对于小牛，奶或复原代奶品中的3-硝基氧基丙醇的量最优选在10至100mg/L的范围内选择。

对于小反刍动物如绵羊羔和山羊羔，奶或复原代奶品中的3-硝基氧基丙醇的量最优选在1mg至100mg/L的范围内选择。

断奶后，本发明的3-硝基氧基丙醇或包含3-硝基氧基丙醇的组合物或制剂优选混合到相应的幼龄反刍动物饲料，例如优选幼龄反刍动物浓缩饲料中。这种浓缩饲料应当优选地是质地粗糙、能量和蛋白质含量高、并且粗饲料低(>15％)。也可以使用谷物(燕麦、大麦、小麦、玉米、黑小麦)，与糖蜜、脱水苜蓿或草颗粒、麸皮或其他源自食品、饮料和饲料工业的副产物混合使用。

本发明的幼龄反刍动物饲料还可以含有常规的幼龄反刍动物饲料添加剂和辅料、赋形剂或稀释剂，包括但不限于水、糖蜜、碳酸钙、电解质如氯化铵、蛋白质如豆粕、油菜籽粉、扁豆、羽扇豆、豌豆、豆类小麦、淀粉、葵花籽粉、玉米、氨基酸、脂肪、维生素和微量矿物质以及地方当局认为可以用于动物饲料的其他材料。

通常，幼龄反刍动物饲料将由以下成分配制但不限于以下成分：大麦、小麦、黑小麦、燕麦、豌豆、羽扇豆、扁豆、豆类、大豆、油菜、向日葵和源自这些成分的产品。还可以包括植物油、糖蜜、石灰石、磷酸二钙、盐、膨润土、氧化镁、酸化剂、赖氨酸、蛋氨酸、抗氧化剂和抗球虫剂以及其他药物。也可以包括某些副产物，如棕榈仁提取物(palm kernel extract，PKE)、玉米片和酒糟。

幼龄反刍动物饲料中的3-硝基氧基丙醇的量优选在每升奶或复原代奶品约1mg至约1000mg、优选约1mg至约500mg、最优选约1mg至250mg 3-NOP的范围内选择。

众所周知，3-NOP的给予量可以进一步根据待处理的各个预反刍动物/幼龄反刍动物例如小牛、羔羊或小山羊的具体需要进行调整。

在本发明的一个特别有利的实施方案中，3-硝基氧基丙醇以液体制剂的形式补充，例如混入奶或液体代奶品制剂(即复原代奶品)中。

因此，本发明还涉及向预反刍动物小牛供应预反刍动物液体饲料的方法，所述预反刍动物液体饲料最优选包含3-硝基氧基丙醇或其制剂的奶或液体奶替代制剂，所述方法包括在液体饲料中溶解3-硝基氧基丙醇或其制剂，并将含有3-硝基氧基丙醇或其制剂的液体饲料喂给预反刍动物小牛。

在进一步的实施方案中，本发明还提供包含3-硝基氧基丙醇或其制剂的预反刍动物和/或幼龄反刍动物饲料的用途，用于(非治疗性)长期、持久地减少反刍动物在其成年期的消化活动排放的甲烷的形成和/或用于减少反刍动物终生总甲烷排放，优选其中不需要或不希望向成年反刍动物另外给予3-硝基氧基丙醇。

本发明进一步提供一种用于长期、持续地减少成年反刍动物的消化活动产生的甲烷的方法，所述方法包括口服给予预反刍动物和/或幼龄反刍动物足量的包含3-硝基丙醇或其组合物或制剂的预反刍动物和/或幼龄反刍动物饲料。

本发明解决迄今为止未解决的问题：在本发明的帮助下，预反刍动物/幼龄反刍动物的胃肠道以所述反刍动物的终生总甲烷排放量低于各自的未经处理的反刍动物的方式调整。这尤其意味着，即使在停止补充3-硝基氧基丙醇或其组合物或制剂之后，甲烷减少(与相应的未处理的反刍动物相比)也持续到反刍动物的成年期中并且在反刍动物的成年期期间程序。

因此，3-硝基氧基丙醇可用作用于预反刍动物和幼龄反刍动物的饲料添加剂和动物饲料组合物的活性成分，因此可用作活性成分以长期适应预反刍动物/幼龄反刍动物的胃肠道，持续减少甲烷排放(与未经处理的动物相比)，特别是通过本文公开的所有方法和用途。

在本发明的所有实施方案中，长期持续甲烷减少的特征优选在于，在出生1年后，与未处理的对照组相比(使用GreenFeed系统(C-Lock，Rapid City，SD USA)测量)，甲烷减少至少5％，更优选减少至少10％，最优选减少至少15％(以g CH₄//天计)。应理解，对照组是在相同管理条件下(相同的农场、相同的牛群、类似的遗传和接种来源以及类似的年龄)饲养的同一品种。

附图说明

图1：x轴：动物周龄；y轴：以g CH₄/d为单位的甲烷排放量；第I期：3-NOP补充；第II期：不补充3-NOP；虚线：处理组；实线：对照组。更多详细信息记载在实施例中。

实施例

实验设置

将18头刚出生的雌性小牛，分别是荷斯坦(Holstein)小牛(n＝12)、蒙贝利亚德(Montbéliarde)小牛(n＝4)和荷斯坦x蒙贝利亚德(Holstein x Montbéliarde)小牛(n＝2)，随机分配到处理组(3mg 3-NOP(活性)/kg BW)或对照组(安慰剂补充剂，即不含3-NOP但含氧化硅和丙二醇)。3-NOP以3-NOP粉末制剂的形式补充(10重量％的3-NOP与硅土和丙二醇混合)，以便在各组之间平衡品种分布和出生体重。从出生到断奶后三周(第14周)每天进行给予处理(混合在少量水中并通过口服管饲递送)。每周称重小牛。使用自动喂食器记录断奶前的奶和浓缩物摄入量。断奶后将动物分组圈养在单个围栏中。在生命的第1周、第4周、第11周、第14周、第23周和第60周收集瘤胃液体样品，并从这些瘤胃液体内容物样品中提取DNA并进行Illumina MiSeq测序。使用GreenFeed系统(C-Lock，Rapid City，SD USA)从第11周断奶到第23周以及随后从第56周到第60周测量小牛的甲烷排放量。

结果

尽管在断奶后三周停止处理，但经处理的小牛在整个断奶后的期间的甲烷排放量(g CH₄/d)持续减少(总计11.6％，P＝0.03)(表1)。当在将近一年后(生命的第56至60周)测量甲烷排放量时，处理组的整体甲烷排放量仍显著降低约19％(P<0.05)，表明该效应的持续性(见图1)。

在整个试验中，各组中的小牛生理参数(体重(BW)和平均每日增重(averagedaily gain，ADG))类似，表明对生命早期的表现没有不利影响处理(见表2和3)。此外，没有观察到3-NOP处理导致产甲烷菌的相对丰度发生显著变化。

表1：补充3-硝基氧基丙醇对11周龄断奶至23周和56-60周龄后期小牛甲烷排放量(g/天)的影响。

表2：小牛体重(BW)(kg)

未观察到体重的显著差异。

表3：从第0周到第23周的平均每日增重(ADG)(kg/d)

	ADG(kg/d)
		对照(n＝8)	0.84
处理(n＝10)	0.79

未观察到平均每日增重的显著差异。