一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法及应用
阅读说明：本技术 一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法及应用 (Method for producing selenium-rich Lyophyllum decastes mycelia in small scale and application ) 是由 高慧娟 王雪梅 魏生龙 梁倩倩 王晓琴 于 2021-06-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法及应用,涉及微生物发酵技术领域。本发明是利用蛋白水解液、玉米淀粉水解液、葡萄糖作为发酵培养基,并在发酵培养基中接种荷叶离褶伞种子培养液,在培养过程中加入灭菌Na-2SeO-3溶液,并调整培养参数,从而获得富硒量更高的荷叶离褶伞菌丝体。本发明大大提高菌丝体产量,且富硒荷叶离褶伞菌丝体可以在20L生物发酵罐内进行连续化生产,产品批次稳定高。本发明所生产的富硒荷叶离褶伞菌丝体可以制备降血脂、降血糖及抗氧化的功能性食品、药物或化妆品。(The invention discloses a method for producing selenium-rich Lyophyllum decastes mycelia in small scale and application thereof, and relates to the technical field of microbial fermentation. The invention uses protein hydrolysate, corn starch hydrolysate and glucose as fermentation culture medium, inoculates Lyophyllum decastes seed culture solution in the fermentation culture medium, adds in sterilized Na in the course of culture 2 SeO 3 And adjusting culture parameters to obtain the Lyophyllum decastes mycelium with higher selenium content. The invention greatly improves the mycelium yield, and the selenium-rich aphyllum decastes mycelium can be continuously produced in a 20L biological fermentation tank, and the product batch is stable and high. The selenium-rich Lyophyllum decastes mycelium produced by the invention can be used for preparing functional food, medicine or cosmetics for reducing blood fat and blood sugar and resisting oxidation.)
技术领域
本发明属于生物发酵
技术领域
，具体涉及一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法及应用。背景技术
硒作为人体必需的微量元素，能激发人体免疫球蛋白及抗体的产生，具有抗衰老作用。荷叶离褶伞为离褶伞属真菌，具有很高的营养价值。荷叶离褶伞因具有较强的富硒能力，使无机硒安全有效地转化为有机硒多糖和硒蛋白，大大提高食用菌的营养价值和应用范围。
目前对荷叶离褶伞进行人工富硒培养的规模化技术还不很成熟，如何实现规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法是目前行业一直不断探索的重要课题。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法，该方法可以在20L发酵罐中生产富硒荷叶离褶伞菌丝体，且制备过程操作简便且所获得的菌丝体批次稳定性高，具有较高的生物活性。
本发明小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法，包括以下步骤：
S1、制备荷叶离褶伞种子培养液：在250mL三角瓶中，加入100mL的加富PDA培养基，接入活化的荷叶离褶伞菌种，摇床培养4-8d，得到荷叶离褶伞种子培养液，置于4℃冰箱备用；
S2、制备发酵培养基，所述发酵培养基是由蛋白水解液、玉米淀粉水解液、和葡萄糖经灭菌后制备而成；
S3、接种荷叶离褶伞种子：在所述发酵培养基中接种步骤S1所述荷叶离褶伞种子培养液，接种量为5.5～10％；通入无菌空气，并在罐内压强为0.02MPa的条件下进行无菌培养；
S4、无菌培养第3d，在发酵培养基中加入灭菌Na2SeO3溶液，使每1mL发酵培养基中含有4μg Na2SeO3，继续发酵5-10d；
S5、发酵结束后，将发酵液经300目滤网过滤，蒸馏水反复洗涤菌球后进行冷冻干燥，称重即得富硒荷叶离褶伞菌丝体菌丝体。
优选地，本发明步骤S1所述的摇床培养时间为5d。
优选地，所述蛋白水解液的制备方法如下：称取黄豆100g，浸泡过夜后打浆，将其煮沸并降温处理，再加入5wt％的蛋白酶，并在40℃恒温水浴锅中水浴5h，制得蛋白水解液。
更优选地，所述将煮沸后的黄豆浆降温至40℃后再加入蛋白酶。
优选地，所述玉米淀粉水解液的制备方法如下：称取玉米面600g，并加入65℃热水6000g，再加入5wt％的淀粉酶，置于65℃恒温水浴锅中混合至遇碘液无色为止，得到玉米淀粉水解液。
优选地，步骤S2所述的灭菌温度为121℃，灭菌时间为40min。
优选地，本发明步骤S5所述的干燥温度为-25℃～15℃。
本发明的另一目的是提供了一种抗氧化能力强且具有降血脂、降血糖的富硒荷叶离褶伞菌丝体，并利用其制成降血脂、降血糖及抗氧化的功能性食品，药物或者化妆品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过调整发酵培养基组成以及荷叶离褶伞种子培养液，提高了菌丝的生物活性，提高了生长速率；
2、本发明在发酵第3d加入无机硒，延迟菌丝体进入衰亡期的时间，产量显著提高；
3、本发明利用荷叶离褶伞菌丝体能将无机硒转化为有机硒，提高人们对硒的摄入的安全性，同时可以提高荷叶离褶伞的利用附加值，同时该生产方式可以实现小规模化量产，采用的发酵装置为20L发酵罐，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为荷叶离褶伞菌丝体悬液对α-葡萄糖苷酶活性的影响；
图2为荷叶离褶伞菌丝体多糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响；
图3为荷叶离褶伞菌丝体蛋白对α-葡萄糖苷酶活性的影响；
图4为荷叶离褶伞菌丝体中可溶性多糖对羟自由基的清除能力；
图5为荷叶离褶伞菌丝体中可溶性多糖对DPPH自由基的清除能力；
图6为荷叶离褶伞菌丝体中可溶性多糖对ABTS自由基的清除能力；
图7为荷叶离褶伞菌丝体中可溶性多糖的还原能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种小规模化生产富硒荷叶离褶伞菌丝体的方法，包括以下步骤：
S1、制备荷叶离褶伞种子培养液：在250mL三角瓶中，加入100mL的加富PDA培养基，接入活化的荷叶离褶伞菌种，摇床培养5d，得到荷叶离褶伞种子培养液，置于4℃冰箱备用；
S2、制备蛋白水解液：称取黄豆100g，浸泡过夜后打浆，将其煮沸并降温至40℃，再加入5％的蛋白酶，并在40℃恒温水浴锅中水浴5h，制得蛋白水解液；
S3、制备玉米淀粉水解液：称取玉米面600g，并加入65℃热水6000g，再加入5％的淀粉酶，置于65℃恒温水浴锅中混合至遇碘液无色为止，得到玉米淀粉水解液；
S4、混合制成发酵培养基，将步骤S2所述蛋白水解液和步骤S3所述玉米淀粉水解液用300目的筛过滤后混合，再加入葡萄糖200g，并在121℃下灭菌40min，冷却后得到发酵培养基；
S5、接种荷叶离褶伞种子：在所述发酵培养基中接种步骤S1所述荷叶离褶伞种子培养液，接种量为8.5％；通入无菌空气，并在罐内压强为0.02MPa的条件下进行无菌培养；
S6、无菌培养第3d，在发酵培养基中加入无菌的Na2SeO3溶液，使1mL发酵培养基中含有4μg Na2SeO3，再继续发酵5d；
S7、发酵结束后，将发酵液经300目滤网过滤，蒸馏水反复洗涤菌球后，置于冷冻干燥机中在-25℃进行干燥，称重即得富硒荷叶离褶伞菌丝体菌丝体。
经检测，发酵结束后本发明菌丝体干重量和富硒量达到最大值分别为8.154g/L和234.785μg/100mL，空白对照组(未加入Na2SeO3)菌丝体干重仅为4.758g/L。本发明菌丝体中多糖的含量为11.6mg/g，蛋白的提取量为13.5mg。
性能实验(以下实验仅是调整实施例1中加硒时间，其他参数均未作出调整)
1、本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体进行体外吸附胆酸盐试验，具体实验结果如表1所示。
表1
注：与空白组对照，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
从表1中可以看出，在第三天加入富硒所获得的菌丝体体外吸附胆酸盐的能力最优，其降胆酸盐能力较好。
2、本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体进行体外吸附胆固醇试验，实验结果如表2所示。
表2
注：与空白组对照，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
由表2可知，在第3d加硒所获得的菌丝体对胆固醇的吸附量最高，其降胆固醇能力最强。
3、菌丝体悬液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究
本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体悬液，并利用上述悬液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定，如图1所示。
从图1中可以看出，富硒荷叶离褶伞的第三天的悬液对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为65.03％，并且此标准偏差是最小的。说明富硒荷叶离褶伞的第三天的菌悬液相比与未富硒荷叶离褶伞的菌悬液和其他几天的富硒荷叶离褶伞的菌悬液降血糖效果要好。在发酵第三天后加硒，菌丝体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈下降趋势。
4、菌丝体多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的研究
本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，并从菌丝体中提取多糖，再利用菌丝体多糖(浓度为0.5mg/mL)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定，如图2所示。
从图2中可以看出，第三天加硒的荷叶离褶伞菌体提取的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为69.97％。根据青砖茶粗多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性进行(舒婷2019)比较，青砖茶粗多糖浓度在3.20mg/mL时对α-葡萄糖苷酶抑制率为(57.59±0.54)％。与其相比富硒荷叶离褶伞菌丝体提取的多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性更好。并且富硒荷叶离褶伞菌丝体提取的多糖比未富硒荷叶离褶伞菌丝体提取的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率都要高，说明将富硒后的菌丝体得到硒多糖拥有更好的降糖效果。但在发酵第三天后加硒，菌丝体的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈下降趋势。
5、菌丝体蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的研究
本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从其中提取菌丝体蛋白，并利用菌丝体蛋白(浓度为1mg/mL)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定，如图3所示。
从图3中可以看出，发酵第三天加硒菌丝体所提取的蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为65.79％。
6、菌丝体中可溶性多糖对羟自由基清除能力的研究
本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖对羟自由基清除能力进行检测，如图4所示(图4中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。
从图4中可以看出，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖对羟自由基有一定的清除能力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。
在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖对羟自由基的清除率最大，达到35.37％；样4最小，为26.11％，说明在发酵过程中加入硒的时间与其清除羟自由基的能力有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖的清除率为19.28％，与富硒组相比，清除力较弱。这与齐睿婷在乳酸乳球菌富硒及其硒多糖抗氧化活性的研究类似，其中提到：富硒多糖对羟自由基的清除能力随着浓度的增加而增加，普遍高于未富硒多糖。
7、菌丝体中可溶性多糖对DPPH自由基清除能力的研究
本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖对DPPH自由基清除能力进行检测，如图5所示(图5中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。
从图5中可以看出，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖对DPPH自由基有一定的清除能力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。
在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖对DPPH自由基的清除率最大，达到52.29％；样4最小为33.95％；说明在发酵过程中加入硒的时间与其对DPPH自由基的清除能力有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖的清除率为23.73％，与富硒组相比，清除力较弱。样2在可溶性多糖浓度为25.6μg/mL时，清除率大于样1，这与徐春兰等对Enterobacter Cloacae Z0206细菌胞外富硒多糖的抗氧化性活性的研究一致，其指出Enterobacter Cloacae Z0206细菌胞外富硒多糖在一定浓度范围内对DPPH自由基具有一定的清除活性。
8、菌丝体中可溶性多糖对ABTS自由基清除能力的研究
本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖对ABTS自由基清除能力进行检测，如图6所示(图6中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。
从图6中可以看出，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖对ABTS自由基有一定的清除能力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。
在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖对ABTS自由基的清除率最大，达到44.88％；样4最小为26.62％，说明在发酵过程中加入硒的时间与其对ABTS自由基的清除能力有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖的清除率为16.1％，与富硒组相比，清除能力较弱。
9、菌丝体中可溶性多糖还原力的研究
本发明在发酵过程中不同加硒时间所获得的菌丝体，从菌丝体中提取可溶性多糖，利用不同浓度的可溶性多糖进行还原能力检测，如图7所示(图7中样1为第2d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样2为第3d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样3为第4d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖；样4为第5d加硒发酵得到的菌丝体可溶性多糖)。
由图7可知，不同发酵时间加硒后，发酵得到的菌丝体中可溶性多糖有一定的还原力，且随着浓度不断增加，清除率也逐渐升高，表现出明显的剂量—效应关系。
在可溶性多糖浓度为32μg/mL的情况下，样1中富硒可溶性多糖还原力最大，在700nm的波长下吸光度值达到0.080，样2、样3、样4则分别为0065、0.047、0.038；说明在发酵过程中加入硒的时间与还原力大小有关，随着加入时间的延迟，清除能力减弱。未富硒空白菌丝体中可溶性多糖在700nm的波长下吸光度值为0.032，与富硒组相比，还原能力较弱。
通过对前期富硒荷叶离褶伞菌丝体中可溶性多糖与抗氧化能力线性关系的研究发现，其可溶性多糖含量越高，其抗氧化性越强，清除率比未富硒的要高。
以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然本发明不仅仅限于以上实施例，还可以有其他变形。本领域的技术人员从本发明公开内容直接导出或间接引申的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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