一株具有抑菌作用的葡萄汁有孢汉逊酵母mp1861及其应用
阅读说明：本技术 一株具有抑菌作用的葡萄汁有孢汉逊酵母mp1861及其应用 (Hansenula polymorpha MP1861 with bacteriostatic effect on grape juice and application thereof ) 是由 王光远 刘子瑜 张晓峰 梁文星 李德龙 李敬涛 于 2021-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一株具有抑菌作用的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861及其应用。所述葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861的分类命名为葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO：M 2021613；其26S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明经过抑菌实验证实,葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉、茄科雷尔氏菌均具有显著的抑制作用。因此,葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861及其发酵滤液能够用于制备植物病原菌抑制菌以及防治疫霉病和/或青枯病的生防菌剂,其使用安全,具有良好的市场应用前景。(The invention discloses a Hansenula polymorpha MP1861 strain with an antibacterial effect on grape juice and application thereof. The classification of Hansenula polymorpha MP1861 into Hansenula polymorpha Hanseniaspora uvarum And the culture is preserved in China center for type culture Collection with the preservation number of CCTCC NO: m2021613; the nucleotide sequence of 26S rDNA is shown in SEQ ID No. 3. The bacteriostatic experiment proves that the Hansenula polymorpha MP1861 contained in the grape juice has obvious inhibition effect on phytophthora sojae, phytophthora nicotianae, phytophthora capsici and ralstonia solanacearum. Thus, grape juiceThe hansenula polymorpha MP1861 and the fermentation filtrate thereof can be used for preparing plant pathogenic bacteria inhibiting bacteria and biocontrol microbial inoculum for preventing and treating phytophthora blight and/or bacterial wilt, are safe to use, and have good market application prospect.)
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，具体涉及一株具有抑菌作用的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861及其应用。背景技术
目前，农业生产面临着很多挑战，其中植物病害、环境污染、生态破坏等问题日益突出，严重阻碍了农业的可持续发展，农业生产也因此承担前所未有的巨大压力。特别是植物病害既可以引起农作物产量的下降，也在一定程度上还严重威胁到农产品的质量安全及其国际贸易。植物病害主要由植物病原菌引起，这些植物病原菌在环境种逐渐积累，造成农作物病害日益加剧，引起重大经济损失。其中，由疫霉菌引起的植物疫霉病和茄科雷尔氏菌引起的植物青枯病是比较常见的植物病害。
疫霉菌种类很多，其中大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉是常见的疫霉菌。大豆疫霉引起大豆疫霉病，大豆整个生长周期均会造成为害，造成植株枯萎、根部腐烂、发育不良，具有毁灭性，可以引起大豆绝产。烟草疫霉引起的烟草黑胫病，主要侵染烟草的根和茎基部，在其上形成黑色凹陷的病斑。烟草黑胫病遍布全世界，特别是温带、亚热带和热带地区发生较严重，有近40个国家和地区受到烟草黑胫病的危害。辣椒疫霉菌侵染引起辣椒疫病，是发生在辣椒上的常见病害。辣椒疫霉寄主范围广，毁灭性强，经常危害茄科、葫芦科、豆类等上百种农作物，引起的植物疫病是农业生产上的毁灭性病害，造成巨大的经济损失。
茄科雷尔氏菌又叫青枯菌，该菌可以引起植物青枯病，是一种常见的作物致病菌。茄科雷尔氏菌可以从作物根部或茎基部的伤口侵入，侵入后在维管束内繁殖，使维管束变褐腐烂，茎叶因缺乏水分的正常供应而产生萎蔫。该菌寄主范围广泛，可侵染番茄、烟草等多种作物，严重威胁世界农业生产安全。
目前控制植物病害主要还是采用农业等化学防治手段，但是其长期大量使用农药会造成环境污染和药物残留问题。开发生物杀菌剂进行生物防治是我国农业要向着健康可持续方向发展之一。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株具有抑菌作用的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861及其应用。所述葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861具有显著抑制植物病原菌大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉、茄科雷尔氏菌的作用，其可用于制备生防菌剂。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株具有抑菌作用的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861，其分类命名为葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021613。
进一步的，所述葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861的26S rDNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
进一步的，所述葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861的菌落呈圆形，乳白色，边缘光滑，表面湿润，不透明，中间凸起。
本发明还提供了所述的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861在用于制备植物病原菌抑制剂中的应用。
进一步的，所述植物病原菌包括烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉和茄科雷尔氏菌。
进一步的，所述葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861能够显著抑制烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉和茄科雷尔氏菌的菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长。
本发明还提供了所述的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861在用于制备防治疫霉病和/或青枯病的生防菌剂中的应用。
进一步的，所述生防菌剂中含有葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861发酵液。
进一步的，所述葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861发酵液的制备方法为：将葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃下160 rpm震荡培养24 h，然后9000 rpm条件下离心10 min，过滤，上清用直径为0.22 μm的细菌过滤器过滤，获得不含有菌体的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861发酵液。
进一步的，所述葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861发酵液在生防菌剂中的体积比是10%-30%。
进一步的，所述疫霉病是由烟草疫霉、辣椒疫霉和/或大豆疫霉引起的植物疫霉病；所述青枯病是由茄科雷尔氏菌引起的植物细菌性青枯病。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
本发明从山中树叶中筛选到一株对疫霉菌和茄科雷尔氏菌有抑制作用的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861，其对烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉和茄科雷尔氏菌具有显著的抑制作用，具体为葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861抑制上述植物病原菌的菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长，进而有效提高植物对疫霉菌引起的疫霉病、茄科雷尔氏菌引起的植物青枯病的抗性。因此，葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861及其发酵滤液可以用于制备植物病原菌的抑菌剂或生防菌剂，且所制备的制剂使用简单、效果好、安全可靠，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861的平板培养照片；
图2是葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对大豆疫霉菌丝生长抑制结果；
图3是葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对烟草疫霉菌丝生长抑制结果；
图4是葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对辣椒疫霉菌丝生长抑制结果；
图5是葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861的发酵滤液对烟草疫霉孢子萌发和芽管伸长的实验结果；
图6是葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861的发酵滤液对辣椒疫霉孢子萌发和芽管伸长的实验结果；
图7是葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对茄科雷尔氏菌生长抑制结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定
一、菌株的分离与筛选
2018年7月于青岛崂山采集不同树叶样品12份，取叶片进行初步检查（除去病变及坏死部分），将叶片剪碎待用；将叶片接入含终浓度为0.01%氯霉素的YPD液体培养基中（1%Yeast Extract，2% Peptone，2% Dextrose），28℃，180 rpm震荡培养2 d；取上述培养液用无菌水稀释至10-6倍，在YPD平板上进行涂布分离，28℃培养2 d后初步观察酵母菌菌株。挑取合适单菌落再次进行划线分离，得到纯培养菌株。
挑取酵母单菌落，利用平板对峙生长方法将单菌落和3种疫霉（大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉）分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）平板（马铃薯200克洗净切块，加入适当水煮沸20~30分钟，纱布过滤取土豆汁，再加入葡萄糖20克，琼脂20克，定容至1000毫升，自然pH），26~28℃条件下培养。通过测试酵母对植物病原菌菌丝生长的抑制情况，筛选出一株对大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉菌丝生长具有很强抑制力的MP1861菌株。
菌株MP1861的平板培养照片如图1所示，菌落呈圆形，乳白色，边缘光滑，表面湿润，不透明，中间凸起。
二、MP1861菌株的分类鉴定
采用26S rDNA分子特征鉴定方法对MP1861菌株进行鉴定。
26S rDNA的序列引物为：NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG（SEQ ID No.1）；NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG（SEQ ID No.2）。
PCR 反应体系如下：2×PCR Master Mix：12.5 μl；NL1：1 μl；NL4：1 μl；模板：1 μl；ddH2O：9.5 μl；
PCR反应程序如下：94℃ 预变性10 min；94℃ 变性30 s、52℃ 退火30 s、72℃ 延伸0.5 min，重复30个循环；72℃复性。
胶回收 PCR产物，进行 TA 克隆，挑取单菌落送测序公司测序。经测序，所述MP1861菌株的26S rDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
经过 NCBI 数据库比对，待检测MP1861菌株与葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum strain B-NC-13-F04）菌株的26S rDNA （GenBank: KJ794645.1）的序列相似度为99.82%，表明该MP1861菌株为葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum。
将本发明筛选到的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861菌株进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年5月26日，葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum MP1861的保藏编号为CCTCC NO：M 2021613。
实施例2：葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对疫霉（大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉）的生防实验
1、MP1861菌株对3种疫霉菌丝生长抑制作用
实验方法：将葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861在YPD平板上26℃活化培养2天备用；烟草疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉分别在PDA平板上26~28℃活化培养3~5天，然后用打孔器在活化好的菌株菌丝边缘（生长状况尽量一致）打取圆形菌饼（直径0.60 cm），再用接种针分别将菌株MP1861和疫霉菌饼挑至新的平板，以空白菌饼为对照，然后将培养皿倒置于培养箱（26~28℃）中培养4~9天，测定菌丝的生长情况，计算菌株MP1861对三种疫霉菌丝生长的抑制率。
图2-4分别展示了菌株MP1861对大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉的抑制效果（图中间为疫霉，四周为MP1861菌株）。结果显示MP1861菌株对大豆疫霉、烟草疫霉、辣椒疫霉都有显著的抑制作用。进一步分析表明，MP1861菌株对大豆疫霉的菌丝生长抑制率为80%；MP1861菌株对烟草疫霉的菌丝生长抑制率为65%；MP1861菌株对辣椒疫霉的菌丝生长抑制率为34%。
2. MP1861发酵滤液对疫霉孢子萌发和芽管伸长的抑制作用
实验方法：挑取MP1861菌株接种到马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），28℃，160 rpm震荡培养24 h，然后9000 rpm条件下离心10 min，过滤，上清用直径为0.22 μm的细菌过滤器过滤，获得含有MP1861菌株发酵物的发酵滤液（所述发酵滤液中不含有菌体，仅为发酵产物）。
对所述发酵滤液进行稀释，采用凹玻片法检测（在灭菌的凹玻片中分别加入不同浓度的滤液50 μl，其中烟草疫霉孢子浓度为2.4×105 个/ml，辣椒疫霉孢子浓度为5.1×105 个/ml，26℃保湿培养1 h，检测不同浓度发酵滤液处理的孢子萌发率并测量芽管的长度。
（1）MP1861菌株的发酵滤液对烟草疫霉孢子萌发和芽管伸长的抑制
结果如图5所示，随着MP1861菌株发酵滤液含量的增加，对烟草疫霉孢子萌发的抑制率明显提高。当发酵滤液达到30%时，就可以基本抑制烟草疫霉孢子的萌发，表明葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861的发酵产物对烟草疫霉孢子萌发具有很强的抑制作用。经过测量孢子芽管的长度，发现随着滤液浓度的提高，对芽管伸长的抑制率也越高，当发酵滤液达到30%时，芽管基本不伸长，说明烟草疫霉孢子萌发的抑制率和芽管伸长的抑制率均呈剂量依赖性。
（2）MP1861菌株的发酵滤液对辣椒疫霉孢子萌发和芽管伸长的抑制
结果如图6所示，随着MP1861菌株发酵滤液含量的增加，对辣椒疫霉孢子萌发的抑制率明显提高。当发酵滤液达到30%时，烟草疫霉孢子的萌发率仅为7.9%，而对照孢子的萌发率高达97.5%，表明MP1861菌株的发酵产物对烟草疫霉孢子萌发具有很强的抑制作用。经过测量孢子芽管的长度，发现随着发酵滤液浓度的提高，对芽管伸长的抑制率也越高，当发酵滤液达到30%时，芽管基本不伸长，说明辣椒疫霉孢子萌发的抑制率和芽管伸长的抑制率也呈剂量依赖性。
实施例3：葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对植物青枯病原菌茄科雷尔氏菌生长抑制作用
用无菌棉棒蘸取茄科雷尔氏菌菌液后，将其涂布在平板表面，然后接种葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861。将培养皿倒置于培养箱（26~28℃）中培养1~2天，测定MP1861菌株对茄科雷尔氏菌的抑菌作用。测试结果如图7所示，MP1861菌株的菌落周围出现明显的抑菌圈，表明葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861对茄科雷尔氏菌的生长具有显著的抑制效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株具有抑菌作用的葡萄汁有孢汉逊酵母MP1861及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
<210> 3
<211> 569
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatacttag tacggcgagt gagcggtaaa agctcaaatt tgaaatctgg tactttcagt 60
gcccgagttg taatttgtag aatttgtctt tgattaggtc cttgtctatg ttccttggaa 120
caggacgtca tagagggtga gaatcccgtt tggcgaggat accttttctc tgtaagactt 180
tttcgaagag tcgagttgtt tgggaatgca gctcaaagtg ggtggtaaat tccatctaaa 240
gctaaatatt ggcgagagac cgatagcgaa caagtacagt gatggaaaga tgaaaagaac 300
tttgaaaaga gagtgaaaaa gtacgtgaaa ttgttgaaag ggaagggcat ttgatcagac 360
atggtgtttt ttgcatgcac tcgcctctcg tgggcttggg cctctcaaaa atttcactgg 420
gccaacatca attctggcag caggataaat cattaagaat gtagctactt cggtagtgtt 480
atagcttttt ggaatactgt tagccgggat tgaggactgc gcttcggcaa ggatgttggc 540
ataatggtta aatgccgccc gtcttgacc 569