一株耐镉促生嗜油不动杆菌菌株及其应用
阅读说明：本技术 一株耐镉促生嗜油不动杆菌菌株及其应用 (Cadmium-resistant growth-promoting acinetobacter oleophilus strain and application thereof ) 是由 王秀荣 王幼娟 罗莎莉 陆星 于 2021-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一株嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20及其应用,该菌株于2021年5月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No：61653。该菌株具有耐酸、耐镉、溶磷、产铁载体和分泌生长素的特性。大豆接种该嗜油不动杆菌MRP20能提高大豆的生物量,叶绿素SPAD值和磷含量；而且能克服镉对大豆生长抑制的作用,尤其是克服镉对大豆根系生长的抑制作用,具有很高的应用价值。(The invention relates to an Acinetobacter oleophilic (Acinetobacter oleivorans) strain MRP20 and application thereof, wherein the strain is preserved in Guangdong province collection center of microorganism strains at 11/5/2021 with the preservation number being GDMCC No: 61653. the strain has the characteristics of acid resistance, cadmium resistance, phosphorus dissolution, siderophore production and auxin secretion. The inoculation of the acinetobacter oleophilus MRP20 on soybean can improve the biomass, chlorophyll SPAD value and phosphorus content of the soybean; but also can overcome the effect of cadmium on the growth inhibition of the soybean, especially the effect of cadmium on the growth of soybean root systems, and has high application value.)
技术领域
本发明属于微生物
技术领域
，具体涉及嗜油不动杆菌菌株MRP20及其应用。背景技术
镉不是植物生长发育所必需的元素。当其体内含量超过某一浓度时，植物就会受到严重的危害，如植株萎蔫发黄、长势较弱等症状。植物根系很容易吸收镉，继而向地上部转运，这样就会使植物中毒，影响营养元素的吸收，进而抑制植物生长。镉也会破坏根结构，从而影响植物养分的吸收。
磷是植物最重要的必需营养元素之一，是植物细胞分裂、能量生成、大分子生物合成、膜完整性、信号转导和光合作用等关键代谢过程所必需的常量营养元素。它还在植物的呼吸作用和豆科作物的固氮作用中发挥作用。虽然土壤中含有大量磷化合物，然而植物能真正利用的可溶性磷却非常少。因为土壤中的大部分的磷以难溶态形式存在，而只有磷酸盐形式的磷源能被植物吸收。
微生物和植物紧密相关，微生物或正面或负面的影响植物的生长发育。受植物根系分泌物的影响，土壤中的微生物与植物根际及根系建立稳定的共生关系，有一些细菌能够侵染植物根系，定殖到植株内部。中国发明专利，CN104974962A，公开了一株乙酸钙不动杆菌，该菌株能够有效降低溶液pH并溶解溶液中难溶性磷，促进番茄和茄子植株生长。但该菌株不耐镉，不能解决植物受镉毒胁迫的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20，该菌株与植物共生，能解决植物低磷胁迫和镉毒胁迫的技术问题。该菌株具有分泌生长素、耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性。大豆接种该嗜油不动杆菌能提高大豆的生物量(干重)、显著提高叶绿素SPAD值和磷含量、促进大豆根生长；而且能克服镉对大豆生长抑制的作用，尤其是克服镉对大豆根系生长的抑制作用。
本发明的目的是提供一株嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在培育耐镉毒植物方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在减弱镉抑制植物生长方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在促进植物叶片合成叶绿素方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在促进植物吸收磷方面的应用。
本发明的另一目的是嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在制备适用于植物的生长促进剂、抗镉毒微生物农药、叶绿素生物合成促进剂或促磷吸收菌剂方面的应用。
本发明的另一目的是提供嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20在溶解难溶性磷方面的应用。
本发明的另一目的是提供一种大豆的种植方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
申请人团队从韶关市曲江区北约村的玉米根际，经人工分离纯化获得了一株具有分泌生长素、耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性，能显著提高大豆生物量、磷含量、叶片SPAD值，且使大豆耐镉的菌株。该菌株的测序结果由广州睿博生物技术有限公司完成，其16S rDNA的测序结果在NCBI数据库中进行Blast多重序列比对分析，从而确定分离出的菌株为嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)的新菌株，命名为MRP20。2021年5月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61653。
菌株MRP20形态特征如下：MRP20生长最适温度为37摄氏度，在LB平板培养基上，形成近似圆状，光滑，突起，乳白色菌落，光学显微镜下为棒状，革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌。
研究显示，该嗜油不动杆菌菌株MRP20显著促进大豆吸收磷，提高大豆耐镉的能力。因此本发明要求保护：
嗜油不动杆菌菌株MRP20在培育耐镉毒植物方面的应用，尤其是用于培育耐镉毒大豆科植物，克服镉对大豆科植物根系生长的抑制作用。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在减弱镉抑制植物生长方面应用，尤其是在镉毒胁迫下促进大豆科植物的生物量提高及其根系生长，或制备能够减弱镉抑制植物生长的产品方面的应用。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在促进植物叶片合成叶绿素方面的应用，或制备能够促进植物叶片合成叶绿素的产品方面的应用，尤其是大豆科植物叶片的叶绿素。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在促进植物吸收磷方面的应用，尤其是促进大豆科植物吸收磷，或制备能够促进植物吸收磷的产品方面的应用。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在溶解难溶性磷方面的应用，其中，优选所述的难溶性磷为Ca3(PO4)2。
嗜油不动杆菌菌株MRP20在制备适用于植物的生长促进剂、抗镉毒微生物农药、叶绿素生物合成促进剂或促磷吸收菌剂方面的应用。
其中，优选地，所述植物为大豆科植物。
一种大豆的种植方法，利用权利要求1所述的嗜油不动杆菌菌株MRP20的菌悬液浇灌处理大豆苗；
具体优选地，所述处理的方式为浇灌；
更优选地，具体包括如下步骤：大豆种子育苗后，在栽培介质中浇灌权利要求1所述的嗜油不动杆菌菌株MRP20的菌悬液，然后在移苗后1、3、5天各浇灌一次；其中优选地，每次浇灌的量为80～120mL/颗苗；优选地，所述的菌悬液OD600为0.6～1.0。
其中，作为一种可选择的实施方案，所述的菌悬液的分散介质为大豆营养液，其配方如下：2.5mM KNO3，2.5mM Ca(NO3)2·4H2O，0.08mM Fe-Na-EDTA，0.25mM K2SO4，1mMMgSO4·7H2O，4.5×10-3mM MnCl2·4H2O，0.3×10-3mM ZnSO4·7H2O，0.16×10-3mM CuSO4·5H2O，0.16×10-3mM(NH4)6Mo7O24·4H2O，20×10-3mM H3BO3，50×10-3mM KH2PO4。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株耐镉促生嗜油不动杆菌菌株MRP20，其与植物共生，能够：
(1)促进植物生长，促进植物吸收磷含量，提高其生物量和叶绿素SPAD，尤其适用于大豆科植物。
(2)提高植物的耐镉毒能力，克服镉对植物的生长抑制作用，尤其是克服镉对大豆的生长抑制作用。
(3)该菌株具有分泌生长素、耐酸、耐隔、溶磷和产铁载体的特性。
附图说明
图1显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的溶磷圈。
图2显示嗜油不动杆菌菌株MRP20在不同色氨酸浓度下产生IAA。
图3显示嗜油不动杆菌菌株MRP20产生IAA的定量图，图中字母a、b代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相同代表组间差异不显著(P>0.05)，字母不相同代表组间差异显著(P<0.05)。
图4显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的耐镉曲线(OD600-镉浓度)，图中字母组合a、ab代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相同代表组间差异不显著(P>0.05)，组间字母不相同代表组间差异显著(P<0.05)。
图5显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的耐酸曲线(OD600-pH)，图中字母组合a、ab和b代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相同代表组间差异不显著(P>0.05)，组间字母不相同代表组间差异显著(P<0.05)。
图6显示嗜油不动杆菌菌株MRP20的发育进化树。
图7显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其植株干重(A)和SPAD值(B)的变化。
图8显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其根长(A)、根表面积(B)、根直径(C)和根体积(D)的变化。
图9显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其地上部镉浓度(A)和根部镉浓度(B)。
图10显示接种嗜油不动杆菌菌株MRP20的大豆在镉毒胁迫下，其地上部磷含量(A)和根部磷含量(B)的变化。
图中*:0.01<P<0.05，**:0.001<P<0.01，***:P<0.001。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：菌株的分离纯化
1.菌株的分离及纯化
在韶关市曲江区北约村，从镉污染土上种植的玉米(正甜68)的玉米根际分离菌株。分别剪取5g玉米根，用小刷子刷去表层土壤，无菌水漂洗多次至无附着土后，置于盛有100mL灭菌水的250mL编号序号的三角形瓶中，180r/min，37℃摇床，摇30min。锥形瓶内添加10-20颗玻璃珠帮助打碎土壤，使细菌能够从土壤中释放出来，震荡结束后，将土壤悬液静置10min，得到土壤悬浮液，取上清液，进行10倍系列梯度浓度稀释，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，然后吸取稀释液0.1mL涂布于LB平板，每个浓度梯度三次重复，37℃条件下倒置培养，观察菌落生长情况，挑取不同表型的单克隆，给每种菌落在培养基背面编号，并记录菌落形态和长出菌落的时间，每种类型挑取单克隆到1.5mL离心管中摇菌，在180r/min，37℃条件下培养，再经LB固体培养基划线纯化3-4次后(直至显微镜下菌落形态一致，说明已纯化完成)，加入浓度为25％灭菌甘油于-80℃保藏待用。
结果在玉米根际离到55株菌株，编号MRP1～55，此为分离纯化出来的待测菌株。
实施例2：菌株筛选
2.1溶磷菌的初筛
将筛选出的菌株接种于PKO固体培养基上，每个平板点接三次，28℃培养箱培养，在第7d测量菌株溶磷圈外直径(D)和菌落直径(d)的大小并拍照，有溶磷圈的即能够溶磷。然后比较(D/d)的比值，对菌株的溶磷能力进行判断。
吸取1mL具溶磷圈的菌株的菌液，接种于20mL LB液体培养基中(50mL的离心管)，24h培养后，测定OD600为1.0左右，取1mL菌重悬液接种于20mL PKO液体培养基中(50mL的离心管)，每个菌株三次重复，CK对照组为接种等量的无菌水，放置在28℃，180r/min摇床中培养。在第7d测定PKO液体培养基的pH值，并吸取1mL上清液(1200r/min，离心5min)到25mL容量瓶待测，吸取5mL钼锑抗显色液，用二级水定容至25mL，反应30min后，使用酶标仪测定880nm处的吸光度值(为了去除培养基颜色的影响，应用880nm测定，通过换算公式，得出在标准曲线(y＝0.4833x+0.0002(R2＝0.9997)。换算得到相应的磷浓度(mg/L)。
结果：发现菌株MRP20的溶磷圈比值大于1.5(图1和表1)。在溶磷定量试验中，菌株MRP20表现出较强的溶磷能力，可溶解到22.61±0.58的磷。
表1
菌株编号
D(cm)
d(cm)
D/d
溶解磷浓度(mg/mL)
MRP20
1.58
0.92
1.73
22.61±0.58
2.2分泌IAA的筛选
配制含L-色氨酸浓度分别为0、100、200、500mg/L LB液体培养基，将筛选出的菌株接种于液体培养基中，每个菌株三次重复(以不接菌的相同培养基作为空白对照)，在28℃，180r/min下培养2d，每个重复取200μL上清液，加入200μL的Salkowski显色液到96孔酶标板中，并以加入未接菌相同液体培养基与200μL的Salkowski显色液为对照，室温避光放置20min后，使用酶标仪在530nm下测其波长。在标准曲线上查出相应的IAA产量。IAA产量单位为mg/mL。
定性结果显示(图2)，菌株MRP20具有产IAA能力，但比较弱。MRP20表明在0-500mg/L的色氨酸浓度范围内，菌株IAA的释放能力是随着色氨酸浓度的提高而增强的(图3)。
2.3产铁载体能力的筛选
吸取1mL待测菌株的菌悬液，接种于MKB液体培养基中。在28℃，180r/min下培养48h。培养液离心10min(1200r/min)，取200μL上清液(参比值(Ar)为测定时加入200μL未接种的MKB液体培养基)，按照1:1的比例与CAS检测液混合。常温反应1h后，酶标仪测定630nm下波长OD值(A)。实验中，若不产铁载体，则CAS液体培养基和对照一样呈蓝色，若菌株产铁载体，则CAS液体培养基变化为橘黄色。以A/Ar的比值表示样品中铁载体的相对含量，值越小，则表示菌株产铁载体的能力越强，以(Ar-A)/Ar的比值表示样品中铁载体的活性单位，活性单位越高，产铁载体能力越强。
结果发现，MRP20菌株在MRP1～55菌株中产铁载体的活性单位最高，达到58.30±11.29％。
2.4耐镉能力筛选
分别配制镉浓度为0、4、8、12、16、20mg/L的6个LB液体培养基，121℃，20min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同镉浓度的LB液体培养基各200μL到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μL到不同镉浓度值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h，测定菌液在600nm下的吸光值。
结果：在0-20mg/L Cd浓度条件下，MRP20的生长速度几乎不变，耐镉性极强(图4)。
2.5耐酸能力筛选
分别配制pH至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的6个LB培养基，121℃，20min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同pH的LB液体培养基各200μL到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μL到不同pH值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h，测定菌液在600nm下的吸光值。
菌株MRP20在pH为5.5-7.0之间生长速度最快(图5)，说明这该菌株在弱酸性条件下也能够生长的很好。
实施例3菌株鉴定
经过多方面综合考虑，对筛选的菌株MRP20进行鉴定。
3.1菌株的形态学鉴定
将菌株MRP20接种在LB固体培养基上进行培养，并观察记录。在最适生长条件(pH7.0，温度37℃)培养5～7天后，将分离并纯化得到的菌株MRP20进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、菌落表面状态和菌落边缘状态等。另一方面，对处于对数生长期的菌株MRP20，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
在LB平板培养基上，形成近似圆状，光滑，突起，乳白色菌落，光学显微镜下为棒状，革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌。
3.2分子鉴定
经过多方面筛选和综合考虑，筛选菌株MRP20进行鉴定并继续研究。将菌株接种于LB培养基中37℃，180r/min培养24小时后，采用细菌总DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA，送生物公司进行测序，将得到的菌株序列在NCBI数据库进行Blast序列比对分析，使用MEGA7.0构建系统发育进化树(图6)。
根据测序结果显示MRP20为嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示；并将该嗜油不动杆菌(Acinetobacter oleivorans)菌株MRP20于2021年5月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61653。
实施例4嗜油不动杆菌MRP20的回接大豆试验
4.1回接试验
本研究采用基质土盆栽试验。实验设置三种镉浓度组，分别为0、10、20mg/kgCdCl2·5/2H2O，接种嗜油不动杆菌MRP20，且每盆均为低磷处理，每个处理4个重复，具体如下。
基质和蛭石的混合基质处理方法：称取无肥基质和蛭石按照3：1混合(0.5kg混合土＝0.125kg蛭石+0.375kg基质)，121℃灭菌40min，间隔24h后重复一次灭菌，放置一周后备用。取容量2L的花盆，用10％的次氯酸钠浸泡过夜后用清水充分冲洗数次，风干备用。称取定量氯化镉溶于水，配制0、10、20mg/kg的溶液，量取一定体积倒入混合基质中，同时每盆(0.5kg)混入125mg Ca3(PO4)2(相当于纯磷50mg/kg)，每盆称取混匀，静置一周待用。
种子用盐酸-次氯酸钠产生氯气灭菌4h，用粗砂：中砂＝1：2的混合砂来育苗，育苗一周后，挑选生长基本一致的大豆植株(巴西10)，每盆移栽一株。移苗后1、3、5天浇灌菌悬液，一次100mL，合计3次。
菌悬营养液的配制：菌株接种于装有250mL LB培养液，在37℃摇床中，180r/min振荡培养18h左右，待菌液浑浊测定OD在0.6到1.0之间，离心收集菌体用低磷营养液重悬，用灭菌枪头拨开幼苗根部表面基质。将菌重悬营养液倒入根部，菌体随营养液浇灌到基质中。
其中所述的低磷营养液的配方为:2.5mM KNO3，2.5mM Ca(NO3)2·4H2O，0.08mMFe-Na-EDTA，0.25mM K2SO4，1mM MgSO4·7H2O，4.5×10-3mM MnCl2·4H2O，0.3×10-3mMZnSO4·7H2O，0.16×10-3mM CuSO4·5H2O，0.16×10-3mM(NH4)6Mo7O24·4H2O，20×10-3mMH3BO3，50×10-3mM KH2PO4。
4.2指标检测
培养大豆30天后收获。在光照充足的条件下用SPAD仪测量植株倒三叶不同部位的SPAD值后取平均值。自来水冲洗干净后先放到冷库，一周内及时进行扫描。用台式扫描仪(Epson1460XL)扫描根系，根系尽量平展铺开，使其不重叠，根系过大的可剪开扫描，不影响其扫描结果，盖上蓝色遮光板，扫描完成后，经过根系分析软件WinRHIZO(RegentInstruments Inc.,加拿大)分析各个样品根的根系性状，
将作物地上部和根部分开，称取地上部和根部鲜重，地上部分放入105℃烘箱杀青30min后，在烘箱烘干后，取出在室温下放置10min冷却后称量干重。根部先用根系扫描仪进行扫描，并称重，其余部分同样经过杀青后烘干，称干重。
再将大豆根部浸泡在10mmol/L Na2-EDTA溶液中5min以除去表面吸附的Cd2+，然后用二级水水冲洗干净，将根系与茎叶部分开75℃烘干称取干重后测定地上部磷含量和镉浓度；根部放冷库用于扫根，扫完后烘干称重，测定根部磷含量和镉浓度。磷的测定采用紫外分光光度法，镉的测定采用原子吸收分光光度计火焰吸收法。
结果如下：
(1)随着镉浓度的增加，植株干重明显下降，与0Cd相比，不接种处理(CK组)植株生物量在10mg/kg Cd2+和20mg/kg Cd2+条件下(10Cd和20Cd组)，分别减少了31％和55％，接种了菌株MRP20处理的大豆植株干重在10mg/kg Cd2+和20mg/kg Cd2+条件下分别减少了31％和41％。在20mg/kg Cd2+条件下，接种了菌株MRP20的大豆植株干重显著高于不接菌处理的大豆，高出34％。表明接种MRP20能缓解镉毒害(图7A)。
(2)在20mg/kg Cd2+条件下，MRP20接菌处理的大豆叶片SPAD值显著高于CK不接菌处理，高出了20％，表明接种MRP20能促进大豆氮的吸收(图7B)。
(3)在0mg/kg Cd2+条件下，大豆接菌处理总根长显著高于不接菌处理(CK组)，根表面积显著高于不接菌处理(CK组)，表明接种MRP20能显著促进大豆根系的生长(图8)。
(4)数据表明，随着镉浓度的增加，大豆地上部和根部的镉浓度显著增加。0mg/kgCd2+、10mg/kg Cd2+和20mg/kg Cd2+条件下下，对比CK不接菌，接种嗜油不动杆菌MRP20的大豆地上部镉浓度没有显著变化(图9A)，但在20mg/kg Cd2+条件下，对比CK不接菌，接菌后的根部镉浓度下减少了60％(图9B)。
(5)在0mg/kg Cd2+条件下，对比CK不接菌，接种嗜油不动杆菌MRP20处理的大豆，其地上部磷含量提高了145％。表明MRP20有显著的解磷促生作用(图10)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一株耐镉促生嗜油不动杆菌菌株及其应用
<130> YGZS214949
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<210> 1
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<213> Acinetobacter oleivorans MRP20的16S rDNA
<400> 1
tgcagtcgag cggagagagg tagcttgcta ctgatcttag cggcggacgg gtgagtaatg 60
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