一种筛选菲类的多环芳烃降解菌的方法
阅读说明：本技术 一种筛选菲类的多环芳烃降解菌的方法 (Method for screening phenanthrene polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria ) 是由 谢永芳 黄小容 梁亦龙 向浏欣 谭权钦 甘玉立 李洋 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种筛选菲类的多环芳烃降解菌的方法,主要包括取受石油污染的土壤于含结晶紫的LB液体培养基中培养,然后按浓度梯度稀释后涂布于含结晶紫的LB平板倒置培养,挑取现无色圈的单菌落接种于液体LB试管中培养,计算脱色率,对结晶紫脱色率大于80％的继续筛选使菲降解率大于45％的菌株为菲类的多环芳烃降解菌。本方法利用结晶紫,该染料是一种常见的三苯甲烷类染料,当所观察的样品能由紫色转为浅紫最终无色的时候,显示该菌可降解结晶紫,具有降解多环芳烃的效果,该筛选方法获得的高效降解结晶紫的菌,同时也能降解稠环芳烃。(The invention provides a method for screening phenanthrene polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria, which mainly comprises the steps of taking petroleum-polluted soil to culture in an LB liquid culture medium containing crystal violet, then coating the petroleum-polluted soil on an LB flat plate containing the crystal violet after dilution according to concentration gradient for inverted culture, selecting a single colony without a color circle to inoculate in a liquid LB test tube for culture, calculating the decolorization rate, and continuously screening strains with the phenanthrene degradation rate of more than 45 percent as the phenanthrene polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria with the crystal violet decolorization rate of more than 80 percent. The method utilizes crystal violet, the dye is a common triphenylmethane dye, when an observed sample can be converted from purple to light violet and is finally colorless, the bacterium can degrade the crystal violet and has the effect of degrading polycyclic aromatic hydrocarbons, and the bacterium which can efficiently degrade the crystal violet and can degrade the polycyclic aromatic hydrocarbons can be obtained by the screening method.)
技术领域
本发明属于微生物降解
技术领域
，更具体地说，特别涉及一种筛选菲类的多环芳烃降解菌的方法。背景技术
多环芳烃是指含两个或两个以上苯环的芳烃，也叫PAHs，由于具有毒性、遗传毒性、突变性和致癌性，对人体可造成多种危害，如对呼吸系统、循环系统、神经系统损伤，对肝脏、肾脏造成损害。被认定为影响人类健康的主要有机污染物。由于PAHs化学稳定性很好，自然条件下很难通过水解等化学作用分解，除了会有很少一部分发生光化学分解外，绝大部分的多环芳烃主要是通过生物降解途径从环境中慢慢消失的。因此，利用微生物的降解作用将PAHs转化为无害物质被认为是去除环境中PAHs的最佳手段。
目前，人们通过人工富集培养等技术，已经分离出许多具有降解PAHs的能力的细菌、真菌和放线菌，细菌由于其生化上的多种适应能力及易诱发突变株而占主要地位；用微生物降解的方法处理染料废水，经济有效，环境友好，因此，利用微生物的降解特性对多环芳烃进行降解，可以为废水处理和环境污染提供生物修复；但是已分离到的PAHs降解菌中高效菌种不多，而且筛选多环芳烃降解菌的实验过程中，常规利用萘、蒽、菲等物质，由于这些物质在水中的溶解性极差，又易挥发，不能均匀地在培养基中加入其它的有机助溶剂，有的采取喷雾法、升华法，这些不仅污染周围的环境有机溶剂，且对细菌也有毒害作用，操作过程比较繁琐、不容易控制。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种筛选菲类的多环芳烃降解菌的方法，以解决目前筛选多环芳烃降解菌的实验过程中，常规利用萘、蒽、菲等物质，由于这些物质在水中的溶解性极差，又易挥发，不能均匀地在培养基中加入其它的有机助溶剂，有的采取喷雾法、升华法，这些不仅污染周围的环境有机溶剂，且对细菌也有毒害作用，操作过程比较繁琐、不容易控制的问题。
本发明一种筛选菲类的多环芳烃降解菌的方法的目的与功效，由以下具体技术手段所达成：
一种筛选菲类的多环芳烃降解菌的方法，包括以下步骤：
(1)取石油污染土壤于含300mg/L结晶紫的LB液体培养基中，30℃、170r/min振荡培养24小时；
(2)取步骤(1)的液体按浓度梯度稀释后涂布于含300mg/L结晶紫的LB平板上，30℃倒置培养24小时；
(3)观察步骤(2)的LB平板，挑取出现无色圈的单菌落于液体LB试管中，30℃、170r/min摇床培养16小时；如果未出现无色圈的单菌落，可以重新筛选，重复(1)至(2)步骤，其中步骤(2)的梯度稀释可以稀释不同的倍数分别涂布于LB平板上，目的是能更快获得产生无色圈的单菌落，对于出现的无色圈单菌落最好一次挑取多个分别放入LB液体培养基中进行培养用于后续步骤，即后续检测挑取的每一个单菌落菌株的脱色率，以便能较快筛选到脱色率大于80％的菌株。
(4)检测脱色率，步骤为：
A1.配置空白对照样品，该样品的成分为PBS浓度0.01M、LB液体培养基体积分数10％；PBS为磷酸缓冲盐溶液。
B1.配置处理前的筛选菌株样品，该样品的成分为PBS浓度0.01M、结晶紫浓度300mg/L，并以A1步骤中的样品为对照检测所述处理前的筛选菌株样品在578nm波长处的结晶紫的吸光度，得到的吸光度为未处理前的OD值；
C1.配置处理后的筛选菌株样品，该样品的成分为PBS浓度0.01M、结晶紫浓度300mg/L和步骤(3)的单菌落菌液体积分数10％，并于30℃、170r/min震荡培养6天，期间每隔12小时以A1步骤中的样品为对照检测所述处理后的筛选菌株样品在578nm波长处的吸光度，得到的吸光度为处理后的OD值；
D1.计算脱色率：脱色率％＝(未处理前的OD值-处理后的OD值)/未处理前的OD值；
(5)将脱色率大于80％所对应的步骤(3)中的单菌落菌液接种至LB液体培养基中，30℃、170r/min振荡培养16小时；可以选择多个脱色率大于80％的菌株用于后续实验，以便能更快筛选到菲降解率大于45％的菌株，也有利于筛选到菲降解率更高的菌株。
(6)离心收集菌体，并用无菌水将细胞反复清洗至少3次，最后用0.01M PBS溶液悬浮﹐配成OD600值为0.5的菌悬液。
(7)检测降解率，步骤为：
A2.初始值检测，方法为：取体积为a mL的菲为50mg/L的无机盐培养基，用正己烷超声萃取2次，每次正己烷所用体积为0.5a mL，超声10分钟，合并2次萃取有机相，旋转蒸发，使有机相浓缩定容至10mL，用紫外分光光度仪在250nm处测定菲的吸光度，参照菲的标准曲线获得的菲的浓度为菲的初始值；
B2.残留值检测，方法为：在含有菲为50mg/L的无机盐培养基中加入使体积分数为5％的步骤(6)的菌悬液，振荡培养6天，期间每隔12小时取体积为a mL的液体，每次取样的液体用正己烷超声萃取2次，每次正己烷所用体积为0.5a mL，超声10分钟，合并2次萃取有机相，旋转蒸发，使有机相浓缩定容至10mL，用紫外分光光度仪在250nm处测定菲的吸光值，参照菲的标准曲线获得菲的残留值；
C2.计算菲的降解率：降解率％＝(菲的初始值-菲的残留值)/菲的初始值。
所述无机盐培养基可按以下组成来配置所需要的体积的量：(NH4)2SO4 1.5g、NaC10.5g、KH2PO4 1.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.05g、CaCl2 0.05g、馏水1000mL，调节pH＝7.0，并于121℃湿热灭菌30分钟。
所述a mL表示一定数量的体积，用a是为了表示A2步骤和B2步骤所取的体积相同，均为a mL，优选的，a的值为200。
所述菲的标准曲线获得方法为：以环己烷做溶剂，精确配置不同浓度的菲的标准溶液，在波长250nm处用紫外分光光度计测定菲的吸光值，根据结果绘制菲的标准曲线。
(8)确定降解率大于45％的菌株为菲类的多环芳烃降解菌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本方法利用结晶紫，该染料是一种常见的三苯甲烷类染料，由于其化学官能团三苯甲烷化学稳定性高、生物可降解性低，虽然属于多环芳烃的一种，但是毒性比稠环芳烃要低很多，在筛选实验过程中，利用结晶紫来筛选，能减少对环境的毒害，且结晶紫在易溶于水，有颜色，在被降解时，会逐渐地进行脱色，则可直接用肉眼进行降解效率的观察；当所观察的样品能由紫色转为浅紫最终无色的时候，显示该菌可降解结晶紫，具有降解多环芳烃的效果，该筛选方法获得的高效降解结晶紫的菌，同时也能降解稠环芳烃。
附图说明
图1为本发明挑取的单菌落菌株对结晶紫的脱色图片；
图2为本发明挑取的其中一个单菌落菌株对结晶紫的脱色率曲线图；
图3为本发明所筛菌降解菲类物质的降解曲线图；
图4为本发明所筛菌的PCR扩增后的电泳图。
具体实施方式
下面实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
实施例：
一、筛选菲类的多环芳烃降解菌，步骤为：
(1)取在加油站附近的土壤1g于100mL含300mg/L结晶紫的LB液体培养基中，30℃、170r/min振荡培养24小时；
(2)取步骤(1)的液体100μL按浓度梯度稀释后取50μL涂布于含300mg/L结晶紫的LB平板上，30℃倒置培养24小时；
(3)观察步骤(2)的LB平板，挑取出现无色圈的单菌落2个，每个单菌落放入一个液体LB试管中，30℃、170r/min摇床培养16小时；
(4)检测脱色率，步骤为：
A1.配置空白对照样品15mL，该样品中PBS浓度为0.01M、LB液体培养基的体积分数为10％，即所加的LB液体培养基为1.5mL；
B1.配置处理前的筛选菌株样品15mL，该样品中PBS浓度为0.01M、结晶紫浓度为300mg/L，并以A1步骤中的样品为对照检测所述处理前的筛选菌株样品在578nm波长处的吸光度，得到的吸光度为未处理前的OD值；
C1.配置处理后的筛选菌株样品15mL，该样品中PBS浓度为0.01M、结晶紫浓度为300mg/L和步骤(3)的单菌落菌液的体积分数为10％，即所加的步骤(3)的单菌落菌液为1.5mL，并于30℃、170r/min震荡培养6天，期间每隔12小时以A1中的样品为对照检测所述处理后的筛选菌株样品在578nm波长处的吸光度，得到的吸光度为处理后的OD值；步骤(3)挑取的是2个单菌落，则此处配置的筛选菌株样品也对应为2个。
D1.计算脱色率：脱色率％＝(未处理前的OD值-处理后的OD值)/未处理前的OD值。
脱色效果如附图1所示，左边第一支试管为对照，中间试管和最右边试管为挑取的2个无色圈的单菌落试管，5天后对照的颜色为紫色，未能脱色，而单菌落试管已脱色。计算脱色率，5天2个单菌落菌株的结晶紫的脱色率均达到80％；附图2为其中一个单菌落的脱色率在更快的时间(第72小时左右)已达到80％，且该菌株用于下一步实验。
(5)将上一步筛选的单菌落菌液接种至LB液体培养基中，30℃、170r/min振荡培养16小时；
(6)离心收集菌体，并用无菌水将细胞反复清洗至少3次，最后用0.01M PBS溶液悬浮﹐配成OD600值为0.5的菌悬液；
(7)检测降解率，步骤为：
A2.初始值检测，方法为：取体积为200mL的菲为50mg/L的无机盐培养基，用正己烷超声萃取2次，每次正己烷所用体积为100mL，超声10min，合并2次萃取有机相，旋转蒸发，使有机相浓缩定容至10mL，用紫外分光光度仪在250nm处测定菲的吸光值，参照菲的标准曲线获得的菲的浓度为菲的初始值；
B2.残留值检测，方法为：在含有菲为50mg/L的无机盐培养基中加入使体积分数为5％的步骤(6)得到的菌悬液，振荡培养6天，期间每隔12小时取体积为200mL的液体，每次取样的液体用正己烷超声萃取2次，每次正己烷所用体积为100mL，超声10min，合并2次萃取有机相，旋转蒸发，使有机相浓缩定容至10mL，用紫外分光光度仪在250nm处测定菲的吸光值，参照菲的标准曲线获得菲的残留值；
C2.计算菲的降解率：降解率％＝(菲的初始值-菲的残留值)/菲的初始值。
附图3为降解率曲线图，5天降解率可达到45％以上，确定该菌株为菲类的多环芳烃降解菌。
无机盐培养基的组成为：(NH4)2SO4 1.5g、NaC1 0.5g、KH2PO4 1.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.05g、CaCl2 0.05g、馏水1000mL，调节pH＝7.0，并于121℃湿热灭菌30分钟。
二、菌株PCR测序检测
对上一部分确定的多环芳烃降解菌接种至LB液体培养基中，30℃、170r/min摇床培养16小时。离心收集菌体，提取基因组DNA，作为DNA模板进行16S rRNA序列的PCR扩增。
使用细菌16S rRNA基因通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')对该菌株的16S rRNA基因序列进行PCR扩增。
PCR混合物(50mL)包含10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、浓度为200μM的每种脱氧核苷三磷酸、50pmol的引物、2.5U的TaqDNA聚合酶、约20ng DNA模板。进行PCR扩增，程序如下：94℃变性1分钟；然后是95℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟的25个循环；最后在72℃延伸10分钟。1％琼脂糖凝胶检测PCR产物，如附图4所示。
将扩增产物胶回收后送测序公司测序获得基因序列，与NCBI数据库GenBank中已存储的基因序列进行比对和分析，发现该菌株与睾酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)的相似度较高，初步确定菌株为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosterone)。
本实施例的具体使用方式与作用：
本方法利用结晶紫，该染料是一种常见的三苯甲烷类染料，由于其化学官能团三苯甲烷化学稳定性高、生物可降解性低，虽然属于多环芳烃的一种，但是毒性比稠环芳烃要低很多，在筛选实验过程中，利用结晶紫来筛选，能减少对环境的毒害，且结晶紫在易溶于水，有颜色，在被降解时，会逐渐地进行脱色，则可直接用肉眼进行降解效率的观察。
当所观察的样品能由紫色转为浅紫最终无色的时候，显示该菌可降解结晶紫，具有降解多环芳烃的效果，该筛选方法获得的高效降解结晶紫的菌，同时也能降解稠环芳烃。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
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