一种柔性导电抗菌材料及其制备方法
阅读说明：本技术 一种柔性导电抗菌材料及其制备方法 (Flexible conductive antibacterial material and preparation method thereof ) 是由 张婕妤 胡雪丰 王云兵 武璨 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种柔性导电抗菌材料及其制备方法,属于柔性生物电子材料领域。解决了现有技术中使用硬质电极难以刺激整个伤口,并且ES疗法缺乏控制感染的能力等问题。本发明制备了聚苯胺-磺酸透明质酸(SHA)水凝胶。在弱碱性生理条件下,水凝胶网络中的SHA可以原位掺杂聚苯胺并维持其导电性,掺杂的PANI带正电荷,对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性。此外,外源ES能增强水凝胶的抗菌活性。本发明制备的水凝胶能够完全覆盖伤口,具有与人体组织类似的导电性、良好的生物相容性与抗菌性,可以用来制备柔性导电敷料等产品。(The invention discloses a flexible conductive antibacterial material and a preparation method thereof, belonging to the field of flexible bioelectronic materials. Solves the problems that the whole wound is difficult to stimulate by using a hard electrode in the prior art, and the ES therapy lacks the capability of controlling infection, and the like. The invention prepares polyaniline-sulfonic acid hyaluronic acid (SHA) hydrogel. Under alkalescent physiological conditions, SHA in the hydrogel network can be doped with polyaniline in situ and maintain the conductivity of the polyaniline, and the doped PANI has positive charges and has strong antibacterial activity on gram-positive bacteria. In addition, exogenous ES can enhance the antimicrobial activity of the hydrogel. The hydrogel prepared by the invention can completely cover wounds, has conductivity similar to human tissues, good biocompatibility and antibacterial property, and can be used for preparing products such as flexible conductive dressings and the like.)
技术领域
本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种柔性导电抗菌材料及其制备方法。
背景技术
3个月内无法愈合的伤口可能会恶化为慢性伤口，严重威胁人类健康。慢性伤口包括糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡和压疮。伴随着人口老龄化、体重增加以及日益增多的继发于糖尿病、静脉功能不全等疾病的并发症，慢性创面患病人数显著增多。据估计大约1％的人在其一生中可能发生腿部溃疡。仅美国，每年就有300～600万慢性创面患者，治疗这些创面的花费将近50～100亿美元。在中国，根据流行病学研究结果，外科住院病人中慢性创面的比率约为1.5％到20.3％，给公共卫生系统和社会带来了巨大的经济负担。
慢性伤口的微环境包含坏死组织碎片，有利于细菌附着和生长。附着的细菌可以增殖形成生物膜，随后扩散到周围组织，发展为系统性感染。伤口感染延长了炎症和延迟愈合，而伤口愈合迟缓，反过来又增加了细菌感染的风险，进一步阻碍愈合。在极端危及生命的病例中，需要截肢远端肢体。
感染的处理是慢性伤口管理的关键，常用的临床技术包括细致的清创、抗生素使用和局部抗菌治疗。然而，目前的技术对抗生物膜引起感染仍然是一个巨大的挑战。手术清创不能完全清除伤口上的细菌，大多数情况下生物膜会在3天内重新出现。长期使用抗生素可能会引起细菌的抗生素耐药性和其他不良副作用，包括胃肠道症状、皮疹、鹅口疮、线粒体功能损伤。因此，研究人员正在寻找可以取代传统抗生素的新型抗菌素。
带正电荷的物质由于产生细菌耐药性的可能性低和抗菌效果高，是很有前途的抗菌剂。带正电荷的抗菌剂与带负电荷的细菌细胞之间的静电吸引可能会破坏细胞壁，导致细胞质泄漏。然而，常用的阳离子抗菌剂在生物医学应用中存在一些局限性，如毒性(如Ag+)和成本高(如特殊设计的抗菌肽)。
除了治疗感染，慢性伤口治疗的另一个挑战是加速伤口闭合。目前的临床策略包括清创、负压治疗和皮瓣修复。但这些治疗至少存在一项缺点，即治疗时间长、费用高、疗效差。相比之下，电刺激(ES)治疗因其有效、低成本和安全而受到越来越多的关注。然而，临床使用的ES设备通过硬质电极将刺激传递到伤口，不能完全适应柔软的伤口组织。因此，电流不能刺激整个伤口区域，尤其是形状不规则的大伤口。而且现有的材料缺乏抗菌性能，对感染的慢性伤口作用较差。
发明内容
针对现有技术中使用硬质电极难以刺激整个伤口，并且ES疗法缺乏控制感染的能力等问题，本发明提供一种柔性导电抗菌材料及其制备方法，其目的在于：。
为简化描述，本发明中对以下术语进行缩写简化：
ES：电刺激；HA：透明质酸；OHA：氧化透明质酸；SHA：磺化透明质酸；PANI：聚苯胺；MBAA：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，NaIO4：碘酸钠。
本发明采用的技术方案如下：
一种柔性导电抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：在100ml溶剂中加入0.5-1g的HA配制成HA溶液，在30ml溶剂中加入0.5-1g的NaIO4配制成NaIO4溶液，将HA溶液与NaIO4溶液混合，在室温、无光条件下搅拌3～7h，向混合溶液中加入乙二醇猝灭未反应的NaIO4，搅拌2～3h，去除碘酸钠和甲醛，得到OHA；
步骤2：配制0.5～1.5wt％OHA溶液，配制3～7wt％NaHSO3溶液，将OHA溶液与NaHSO3溶液混合，OHA溶液与NaHSO3溶液的体积比为5：1，45～60℃反应4～6h，透析后得到SHA；
步骤3：将SHA、丙烯酰胺和交联剂溶于水中，加入热引发剂和促进剂，将溶液注入模具，在30-60℃反应2～6h，室温退火10～14h，得到PS水凝胶，SHA与丙烯酰胺的质量比为1:7～10，交联剂用量为反应体系的0.1～0.3wt％，引发剂用量为反应体系的0.1～0.3wt％，促进剂用量为反应体系的0.1～0.3wt％；
步骤4：将PS水凝胶浸入含有1.0M酸和15～30mM苯胺的50mL溶液中24h，然后加入15～30mmol APS，反应2～6h，得到PSP水凝胶。
优选的，步骤1中，HA用量为0.7g，NaIO4用量为0.6g，反应时间为5h。
优选的，步骤1中采用透析法去除碘酸钠和甲醛。
优选的，步骤2中，OHA用量为反应体系的0.1wt％；NaHSO3用量为反应体系的5wt％；反应温度为50℃；反应时间为5h。
优选的，步骤3中，SHA与丙烯酰胺的质量比为1:9；交联剂为MBAA，用量为反应体系的0.15wt％；引发剂为过硫酸铵，用量为反应体系的0.2wt％；促进剂为N,N,N’，N’-四甲基乙二胺，用量为反应体系的0.2wt％；反应温度为40℃；反应时间为4h，退火时间为12h。
优选的，步骤4中的酸为盐酸、醋酸、草酸、硝酸中的一种，苯胺溶液浓度为25mM；过硫酸铵用量为25mmol；反应时间为4h。
一种柔性导电抗菌材料，采用所述的制备方法制得。
所述柔性导电抗菌材料可用于组织修复。
本发明中，使用PANI构建一种本征导电抗菌水凝胶。聚苯胺是一种便宜的生物相容性聚合物，它具有共轭π键结构提供电导率。掺杂后电导率显著提高，且掺杂的聚苯胺具有较高的正电荷。因此，带正电的聚苯胺有可能成为一种有前途的抗菌剂。然而，聚苯胺与细菌细胞之间的相互作用尚未阐明。为了解决这个问题，本发明使用革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌来评估聚苯胺的抗菌活性，并通过研究聚苯胺与目标细菌表面相关的粘附两亲体(重要的细胞壁成分)之间的相互作用来揭示其机制。利用聚苯胺偶联高分子掺杂剂SHA构建导电水凝胶敷料，用ES研究其在体内治疗顽固性感染慢性创面的潜力。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明采用PANI与SHA作为基体材料制备用于柔性生物电子器件的材料，该材料同时具有与人体组织类似的导电性、良好的生物相容性与抗菌性，可以用来制备柔性导电敷料等产品；
2、本发明对HA分子链进行修饰，引入磺酸基团，形成大分子掺杂剂，可以形成对PANI的高效长期掺杂。因为其分子量大，不容易溶出，可以长期维持材料的导电性；
3、本发明通过掺杂增强PANI的电正性，使其具有良好的抗菌性能。利用PANI自身的抗菌性能，制备本征抗菌的伤口敷料，可以避免使用抗生素等抗菌剂，降低了敷料的生产成本，也能避免使用抗生素造成的细菌耐药性以及其它毒副作用。
5、本发明采用的材料制备方法，都在水溶液中进行，无需使用有机溶剂，生产过程绿色环保，同时无有机溶剂残留，有利于扩大应用范围；
6、本发明原材料便宜，合成路径简单，能够快速且大量地制备导电材料，有利于新型柔性生物电子器件的量产及商业化应用。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是本发明的技术路线图
图2为水凝胶的导电性测试结果；
图3为水凝胶的拉伸曲线(A)和流变测试结果(B,C)；
图4为细胞毒性结果；
图5为抗菌性能结果；
图6为电刺激促进伤口愈合的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳的实施例提供一种OHA的制备方法，具体步骤如下：
将1g HA溶解在100ml水里，0.8g NaIO4溶解在30ml水里，HA溶液与NaIO4溶液混合，在无光条件下搅拌3h，加入等摩尔量的乙二醇猝灭未反应的NaIO4。再搅拌2h，透析法去除NaIO4和甲醛，得到氧化度为20％的OHA；
实施例2
本发明较佳的实施例提供一种OHA的制备方法，具体步骤如下：
将1g HA溶解在100ml水里，0.8g NaIO4溶解在30ml水里，HA溶液与NaIO4溶液混合，在无光条件下搅拌5h，加入等摩尔量的乙二醇猝灭未反应的NaIO4。再搅拌2h，透析法去除NaIO4和甲醛，得到氧化度为30％的OHA；
实施例3
本发明较佳的实施例提供一种OHA的制备方法，具体步骤如下：
将1g HA溶解在100ml水里，0.8g NaIO4溶解在30ml水里，HA溶液与NaIO4溶液，在无光条件下搅拌7h，加入等摩尔量的乙二醇猝灭未反应的NaIO4。再搅拌2h，透析法去除NaIO4和甲醛，得到氧化度为40％的OHA；
实施例4
在实施例1的基础上，本发明较佳的实施例提供一种SHA的制备方法，具体步骤如下：
配置1wt％OHA溶液，加入占反应体系5wt％的NaHSO3，50℃反应5h。透析后得到磺化度为7％的SHA。
实施例5
在实施例2的基础上，本发明较佳的实施例提供一种SHA的制备方法，具体步骤如下：
配置1wt％OHA溶液，加入占反应体系5wt％的NaHSO3，50℃反应5h。透析后得到磺化度为17％的SHA。
实施例6
在实施例3的基础上，本发明较佳的实施例提供一种SHA的制备方法，具体步骤如下：
配置1wt％OHA溶液，加入占反应体系5wt％的NaHSO3，50℃反应5h。透析后得到磺化度为19％的SHA。
实施例7
在实施例4的基础上，本发明较佳的实施例提供一种柔性导电抗菌水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
将SHA、丙烯酰胺(SHA与丙烯酰胺的质量比为1:9)和交联剂(N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，MBAA,0.15wt％)溶于水中。随后加入热引发剂(过硫酸铵，0.018g)和促进剂(N,N,N’，N’-四甲基乙二胺，TEMED,18μL)，将溶液注入玻璃模具(100mm×100mm×1毫米)在40℃反应4h，室温退火12h，制得PS 1水凝胶。
将PS1水凝胶浸入含有1.0M HCl和25mM苯胺的50mL溶液中24h，然后加入25mmolAPS。反应4h后，所得水凝胶命名为PSP 1水凝胶。
实施例8
在实施例5的基础上，本发明较佳的实施例提供一种柔性导电抗菌水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
将SHA、丙烯酰胺(SHA与丙烯酰胺的质量比为1:9)和交联剂(N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，MBAA,0.15wt％)溶于水中。随后加入热引发剂(过硫酸铵，0.018g)和促进剂(N,N,N’，N’-四甲基乙二胺，TEMED,18μL)，将溶液注入玻璃模具在40℃反应4h，室温退火12h，制得PS2水凝胶。
将PS2水凝胶浸入含有1.0M HCl和25mM苯胺的50mL溶液中24h，然后加入25mmolAPS。反应4h后，所得水凝胶命名为PSP 2水凝胶。
实施例9
在实施例5的基础上，本发明较佳的实施例提供一种柔性导电抗菌水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
将SHA、丙烯酰胺(SHA与丙烯酰胺的质量比为1:9)和交联剂(N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，MBAA,0.15wt％)溶于水中。随后加入热引发剂(过硫酸铵，0.018g)和促进剂(N,N,N’，N’-四甲基乙二胺，TEMED,18μL)，将溶液注入玻璃模具在40℃反应4h，室温退火12h，制得PS3水凝胶。
将PS3水凝胶浸入含有1.0M HCl和25mM苯胺的50mL溶液中24h，然后加入25mmolAPS。反应4h后，所得水凝胶命名为PSP 3水凝胶。
实验例1
测试实施例9制得的材料的导电性能。
采用四探针法测试上述实施例中制备的柔性导电抗菌水凝胶的导电性，结果如图2所示。通过苯胺的原位聚合将PANI引入聚丙烯酰胺(PAM)基质水凝胶。为了防止在弱碱性生理条件下由于小分子掺杂剂的损失而导致的PANI电导率快速下降，SHA 作为大分子掺杂剂掺入水凝胶中。掺杂程度决定了固有电导率。使用磺化度为19％的SHA 制备的PSP水凝胶(PSP3)表现出最高的电导率(图2)。PSP水凝胶的电导率比PS水凝胶的电导率高约40倍(图2)。另一方面，当在聚丙烯酰胺中添加具有不同磺化度的SHA，但是不加入PANI时，电导率没有显著变化(图2)。从另一方面证明了导电性主要来自PANI。PSP水凝胶在溶胀和干燥状态下的电导率分别为1.05mS/cm和1.20mS/cm，表明水凝胶溶胀对电导率没有显着影响。
实验例2
测试实施例9制得的材料的力学性能。
伤口敷料需要足够的强度以在日常使用中保持其完整性并保护伤口免受进一步创伤。PANI的引入显着提高了水凝胶的机械性能。与PS水凝胶相比，PSP水凝胶的最大拉伸强度提高了300％，断裂伸长率提高了115％(图3A)。由于日常活动，伤口敷料通常应用在动态机械环境中。当频率从0.1Hz变为100Hz(日常活动的近似频率范围)时，PSP水凝胶还表现出对动态刺激的足够稳定性，如稳定模量所示(图3B)。应变扫描测试(图3C)表明PSP水凝胶可以保持水凝胶状态,直到应变达到179％。该结果还证明了PSP水凝胶具有足够的动态稳定性，因为人体皮肤上常规活动产生的应变<100％。在频率和应变扫描模式下，PSP水凝胶的G'显着高于PS水凝胶，表明引入的PANI促进了水凝胶的动态机械性能。由于PANI的刚性结构和PANI链之间以及PANI和PAM之间形成的动态氢键用于能量耗散，PSP水凝胶具有更好的机械性能。此外，苯胺的原位聚合将另一个网络引入水凝胶基质中，并且形成的互穿网络还可以赋予水凝胶良好的柔韧性和强度。
实验例3
测试实施例9制得的材料的细胞毒性。
小鼠成纤维细胞在补充了10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL的链霉素的Dulbecco改良Eagles培养基(即DMEM)中培养。将材料切成圆盘状的样品(3.5mm×2mm)，然后通过高压釜灭菌。将每个无菌标本在37℃下浸入3mL DMEM中24h，以制备水凝胶提取液。将一万个成纤维细胞接种到96孔板的每个孔中，并在200μL新鲜DMEM中预培养24h，以实现完全粘附。将培养基替换为水凝胶提取液，并将细胞再培养24小时。然后通过CCK-8试剂盒测定细胞活力。细胞毒性结果如图4所示，实验表明，本发明材料无细胞毒性。
实验例4
测试实施例9制得的材料的抗菌性能。
细菌附着后，会生长增殖形成生物膜，通过产生细胞外聚合物，促进细菌的强力粘附并阻碍抗菌剂的渗透。因此，生物膜难以根除，并导致了大部分(60％)的慢性伤口感染。图5显示用实施例9制得PSP水凝胶处理金色葡萄球菌(S.aureus)生物膜时，与PS水凝胶相比，细菌密度降低了3个数量级以上。用实施例9制得PSP水凝胶处理表皮葡萄球菌(S.epidermidis)生物膜时，与PS水凝胶相比，细菌密度降低了2个数量级。以上该结果表明，本发明制备的材料可以显著抑制生物膜的形成。
实验例5
测试实施例9制得的材料对慢性伤口愈合的促进作用。
在每只糖尿病大鼠上背上创建四个全层皮肤切除伤口。在Control(对照)组中，伤口没有覆盖敷料，而在Hydrogel组中，使用本发明制备的导电材料治疗了伤口。对于ES组，使用常规的电极对伤口进行电刺激，而不使用水凝胶材料。在ES+Hydrogel组，通过覆盖伤口的导电材料施加电刺激治疗伤口。所有伤口均接种金黄色葡萄球菌以引起感染。
在第3天，Control组和ES组的伤口化脓。但在PSP水凝胶处理的伤口(Hydrogel组)上没有观察到脓液，表明PSP水凝胶在体内具有良好的抗菌活性。在第14天，Control组仍然未愈合，而ES和Hydrogel组中存在结痂。在ES+Hydrogel组中，伤口完全愈合。根据伤口面积的变化，量化了四组的伤口闭合率(图6)。在第14天，ES+Hydrogel组的伤口闭合率比Control组高21％。
除了测量伤口大小外，还通过组织形态学评估愈合情况。通过上皮厚度和肉芽组织宽度评估伤口的再上皮化和肉芽组织形成的程度。与Control组相比，ES和Hydrogel组显示出更高程度的再上皮化，上皮层分别增厚28％和27％。ES+Hydrogel组在14天后形成多层上皮结构，上皮厚度与完整皮肤的健康表皮相似。此外，在ES+Hydrogel组中，上皮细胞和结缔组织更规则。
肉芽组织宽度反映创面组织的再生水平，较低的值表明更成熟的肉芽组织和更高的转化为纤维组织的程度。在第14天，ES和Hydrogel组的肉芽组织宽度分别为1.2±0.24和2.3±0.28mm，而在ES+Hydrogel组中，大部分伤口区域充满了再生成熟皮肤组织和肉芽组织宽度仅为1.2±0.52mm。
在伤口修复和成熟过程中，胶原沉积起着重要作用。与Control组相比，其他三组的胶原沉积更高。对于ES和Hydrogel组，相对胶原沉积分别为47％和51％。此外，ES+Hydrogel组显示出61％的相对胶原沉积，是Control组(31％)的2倍，还有高度的定向对齐，表明细胞外基质重建和组织重塑的改善。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
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