玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730及应用
阅读说明：本技术 玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730及应用 (Corn drought inducible promoter ZmOMAp1730 and application thereof ) 是由 于好强 丁磊 庞浩婉 刘媛 付凤玲 李晚忱 杨青青 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730及应用,属于农业生物技术领域。具体公开一种获得的玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730,其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中第1-1730位碱基序列所示。还公开了包括扩增所述玉米诱导型启动子ZmOMAp1730的引物以及玉米诱导型启动子ZmOMAp1730的应用。本发明通过实验验证ZmOMAp1730基因启动子响应干旱胁迫,并受干旱胁迫正向调控,该发现对于植物干旱调控以及进行抗旱育种具有重要意义。(The invention discloses a corn drought inducible promoter ZmOMAp1730 and application thereof, belonging to the technical field of agricultural biology. Specifically discloses an obtained corn drought inducible promoter ZmOMAp1730, the nucleotide sequence of which is shown as SEQ ID NO: 1, 1-1730 th base sequence. Also discloses a primer for amplifying the corn inducible promoter ZmOMAp1730 and application of the corn inducible promoter ZmOMAp 1730. Experiments prove that the ZmOMAp1730 gene promoter responds to drought stress and is positively regulated by the drought stress, and the discovery has important significance for plant drought regulation and drought-resistant breeding.)
技术领域
本发明涉及农业生物
技术领域
，特别是涉及一种玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730及应用。背景技术
植物基因的启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。其中，组成型启动子在农业生物技术上应用的较多，比如CAM35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子，这些启动子虽然已经得到应用，但是组成型启动子会启动目的基因在植物所有组织中持续稳定高表达，造成细胞内的物质和能量过度消耗，目的基因表达的时空性不能有效控制，会造成植物体内原有的代谢平衡紊乱，以致植物正常生长受到阻碍，因此实践运用中存在一定的缺陷。同一组成型启动子重复驱动多个外源基因表达还可能会引起基因沉默或共抑制现象。因此，有必要针对不同的组织器官特异性或者特定条件下诱导表达启动子，这样就可以根据需要选择不同的启动子诱导目的基因进行表达。
尽管目前已经有针对玉米诱导型启动子的相关报道，但是由于不同基因所具有的功能可能存在差异，并且也并非所有基因的功能都已经被人类所知，而干旱是影响玉米的生长及产量的重要因素，因此，提供一个能够调控玉米干旱胁迫的诱导型启动子对于解决玉米生长及产量的问题非常重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过实验验证ZmOMAp1730基因启动子响应干旱胁迫，并受干旱胁迫正向调控，该发现对于植物干旱调控以及进行抗旱育种具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种获得的玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730，其核苷酸序列如SEQID NO：1中第1-1730位碱基序列所示。
本发明还提供一种扩增所述的玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示上游引物和SEQ ID NO：3所示下游引物。
优选的是，扩增程序为94℃预变性3min；98℃变性10s，68℃退火10s，72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸5min；4℃保持。
优选的是，扩增体系包括：5×PrimeSTAR Buffer 5.0μL、dNTP mix2.0μL、上游引物/下游引物各0.5μL、质粒0.2μL、高保真酶0.25μL，ddH2O补充至25.0μL。
本发明还提供一种所述的玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730、或所述的表达载体或所述的引物的应用，应用于如下(a)或(b)所示应用：
(a)在调控植物干旱胁迫中的应用；
(b)在植物抗旱育种中的应用。
优选的是，所述植物包括玉米、烟草以及拟南芥。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过植物启动子顺式作用元件分析网站，根据启动子中与干旱相关的顺式作用元件位置，在顺式作用元件附近设计引物，扩增不同长度的ZmOMA基因启动子5′端缺失序列，结果发现1730bp的启动子启动GUS表达载体的GUS活性最高；然后再将该序列的表达载体在烟草和拟南芥中进行功能验证，证实ZmOMAp1730基因启动子响应干旱胁迫，并受干旱胁迫正向调控。因此，本发明可以为植物干旱调控以及在抗旱育种方面提供理论基础和数据支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ZmOMA1基因的表达模式分析；*与**分别表示p<0.05，p<0.01；
图2为ZmOMA基因启动子序列分析与引物设计；核心元件TATA-box和CAAT-box分别以深灰色和浅灰色的背景显示；
图3为ZmOMA1基因启动子不同片段扩增电泳图；
图4为不同启动子片段启动GUS分析；A:GUS组织化学染色；B:GUS定量分析；*与**分别表示p<0.05，p<0.01；
图5为干旱处理下ZmOMAp1730启动活性瞬时表达分析；A:GUS组织化学染色；B:GUS定量分析；*与**分别表示p<0.05，p<0.01；
图6为干旱处理下ZmOMAp1730启动活性稳定表达分析；A:GUS组织化学染色；B:GUS定量分析。*与**分别表示p<0.05，p<0.01。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730的获取及其应用
1、ZmOMA基因表达模式分析
玉米C01自交系种子培养至两叶一心时期时，选取生长整齐一致的植株做20％PEG干旱胁迫处理，在0、3、6、12、24h处理时间点，分别取样叶片和根系，每个处理重复取样3次，取样后立即液氮速冻研磨并-80℃保存。使用Trizol(TaKaRa)试剂盒提取RNA，然后使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)反转录为cDNA。
设计目的基因的特异性引物，并以GAPDH作为内参基因(表1)。以SYBGreen荧光染料进行qRT-PCR，按表2反应体系加样，在CFX96TM型定量PCR仪(Bio-Rad，美国)上扩增。扩增循环程序为95℃30s；95℃5s；55-65℃30s；循环39次，最后一次温度循环后，将温度以每秒0.5℃的速度从65℃升高到95℃，作溶解曲线分析。所有扩增均设置3次技术重复，反应结束后按照2-ΔΔCT法进行试验数据的计算，分析目的基因的相对表达量。
表1 qRT-PCR引物信息
表2 qRT-PCR反应体系
2、ZmOMA基因启动子顺式元件分析
下载ZmOMA基因转录起始位点前2000bp长度的核酸序列作为其启动子序列。使用植物启动子顺式作用元件分析网站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对该启动子的顺式作用元件进行分析。根据启动子中与干旱相关的顺式作用元件位置，在顺式作用元件附近设计引物，扩增不同长度的ZmOMA基因启动子5′端缺失序列。
3、启动子克隆及载体构建
取五叶期玉米幼苗叶片，液氮速冻研磨，用CTAB法提取玉米基因组DNA。用NCBI网站Primeblast设计ZmOMA基因启动子的扩增引物，根据双子叶植物高效表达载体pRI201-AN-GUS(SEQ ID NO：9)多克隆位点，在其上游引物入Hind III(AAGCTT)酶切位点，下游引物引入Xba I(TCTAGA)位点，具体序列如表3：
表3 构建双子叶植物表达载体引物设计
按表4所示反应体系加样，进行扩增。温度循环程序为：94℃3min；98℃10s，68℃退火10s，72℃2min，30个循环；72℃5min；4℃保持。
表4 PCR扩增反应体系
对PCR产物进行回收。将回收产物和pRI201-AN-GUS质粒进行双酶切，按表5反应体系进行加样。将酶切体系混匀，置于30℃水浴锅中，酶切6～8h，酶切产物加入上样缓冲液后，直接电泳，回收酶切产物，按表6进行酶切片段连接。
表5 双酶切加样体系
表6 连接反应体系
连接产物转化大肠杆菌，并进行菌落PCR检测。提取重组质粒经限制性内切酶双酶切鉴定之后，重组质粒菌液送测序公司进行DNA序列测序鉴定，经测序正确的质粒将于下一步转化烟草。
4、烟草中瞬时表达
为研究不同长度ZmOMA基因启动子之间的活性差异及关键元件，用农杆菌介导法将上述构建的载体转化烟草，进行瞬时表达。
4.1 农杆菌感受态制备
(1)将保存的农杆菌EHA105在含50mg/L利福平(Rif)的YEP平板划线，28℃培养36～48h。
(2)挑取单菌落接种于1mL含Rif的YEP液体培养基中，200r/min，28℃振荡培养12～16h。
(3)取1mL菌液转接于100mL含Rif的YEP液体培养基中，200r/min，28℃振荡培养至OD600＝0.4～0.6。
(4)转入50mL预冷的无菌离心管，4℃，5000r/min离心5min，收集菌体。
(5)加入10mL预冷的0.15mol/L的NaCl溶液，悬浮细胞，冰上放置10min；加入2mL的0.02mol/L CaCl2溶液。
(6)4℃，5000r/min离心5min，收集菌体；加入1mL预冷的0.02mol/L CaCl2溶液悬浮菌体，冰上放置10min。
(7)按200μL/管分装于无菌管中，液氮中速冻1min，冻存于-70℃。
4.2 表达载体转化农杆菌步骤如下：
(1)取200μL农杆菌感受态细胞，冰上解冻。
(2)加1μg构建好的载体，轻弹混匀后冰浴30min。
(3)液氮速冻1min，37℃水浴5min，然后加入700μL含Rif(50mg/L)的YEP液体培养基，28℃慢速振荡培养4h。
(4)将培养物涂布于含Kana和Rif的YEP平板上，28℃培养约36～48h。挑单克隆于含Kana(50mg/L)和Rif(50mg/L)的YEP液体培养基，28℃培养过夜，做菌液PCR检测。
4.3 农杆菌转化烟草
(1)取含有重组质粒的农杆菌，在含有卡那霉素(Kana)和利福平(Rif)的YEP平板上划线，28℃培养2～3d。
(2)挑取农杆菌单菌落接种在3mL含Kana和Rif的YEP液体培养基中，28℃，200r/min，振荡过夜培养。
(3)在100mL液体YEP培养基中(含Kana和Rif)，接种1mL过夜培养的起始农杆菌菌液，28℃振荡培养至菌液OD600值为1.2～1.5。
(4)4℃5000r/min离心10min收集细胞，用烟草注射液(表7)悬浮菌体并调OD600值至0.8～1.0。
(5)28℃静置活化3h后，利用无菌注射器将重悬液注射入烟草叶片背面，并做好注射部位标记。
(6)将注射农杆菌的烟草置于25℃和14/10h光周期条件下培养48h后，用于GUS组织化学染色和GUS活性定量分析。
表7 烟草注射液配方(200mL)
5、GUS组织化学染色与活性测定
5.1 GUS组织化学染色
将处理后的转基因烟草叶片用适量GUS组织化学染色反应液染色过夜。第二天吸出染色液，加70％的乙醇做脱色3～5次，直至背景呈阴性对照即呈白色为止。肉眼下观察，并拍照。
5.2 GUS活性测定
GUS酶活测定方法主要参考Jefferson方法。该法以4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯(4-MUG)为底物，GUS酶催化其水解为4-甲基伞形酮(4-MU)及β-D葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。
5.2.1 GUS粗蛋白提取
将0.1g左右的烟草叶片组织用液氮研成粉，移入液氮预冷的1.5mL离心管中，加入200μL GUS荧光定量提取液，室温解冻后混匀，4℃、12000r/min离心15min。将上清液转入新的离心管，分装，-70℃保存备用。
5.2.2 标准曲线的制作
精确称取牛血清白蛋白BSA 25mg，加水溶解并定容至100mL。吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释定容到100mL，即为100μg/mL的标准蛋白质溶液。称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50mL 90％乙醇中，加入100mL 85％(W/V)的磷酸，用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，4℃避光保存。取6只10mL的试管，编号，按下表(表8)加入试剂。
表8 蛋白浓度标准曲线制作
混匀，各管振荡程度应尽量一致。静置10min，在595nm波长下比色测定。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标，以吸管值为纵坐标，绘出标准曲线。
5.2.3 样品中蛋白含量的测定
吸取50μL GUS粗蛋白提取物加入950μL ddH2O，然后加入5mL G250溶液，混匀，室温放置10min之后测定595nm吸光值。根据标准曲线计算蛋白浓度。
5.2.4 GUS荧光测定
(1)标准曲线的制作：精确称取0.2032g 4-MUG加水溶解定容到100mL，配成溶液浓度即为5mmol/L(表9)。
表9 MUG标准曲线的制作
GUS荧光测定：取70μL GUS粗蛋白提取物和80μL GUS反应液混匀后立即吸取30μL液体到60μL的0.2mol/L Na2CO3终止反应。将剩余反应液在37℃水浴，1h后加入240μL0.2mol/L Na2CO3终止反应，混匀后从中吸取出90μL混合液于96孔微孔板读数。用微孔发光检测仪，在激发光340nm，发射光465nm下，读取0h和1h的值。
GUS活性的计算：根据标准曲线计算0h和1h时的4-MU浓度，GUS活性数值为1h的4-MU浓度减去0h的4-MU浓度，再除以1h(温浴时间)和蛋白浓度，单位为nmol 4-MU/mg/min。
6、ZmOMAp1730序列的功能验证
qRT-PCR结果表明，ZmOMA基因启动子响应干旱胁迫。而且，根据ZmOMA基因启动子中顺式作用元件的分布，并结合不同长度启动子GUS表达载体与全长启动子GUS表达载体的GUS组织化学染色和GUS蛋白定量结果，显示1730bp的启动子启动GUS表达载体的GUS活性最高。因此，选取1730bp的序列对其后续进行研究，并命名为ZmOMAp1730。
6.1 ZmOMAp1730序列表达载体在烟草中的功能验证
将上述构建好的P1730-GUS表达载体转化农杆菌，利用上述相同方法将其注射进烟草叶片，注射后的烟草植株置于25℃和14/10h光周期条件下培养24h后,对其进行20％PEG模拟干旱处理，在0、3、6、12、24h处理时间点，取叶片用于GUS组织化学染色和GUS活性定量分析。
6.2 ZmOMAp1730序列表达载体在拟南芥中的功能验证
将上述构建好的P1730-GUS表达载体转化农杆菌，随后，通过花絮侵染法转化野生型拟南芥，再筛选转基因阳性苗直至得到T3代纯合转基因种子。将T3代纯合转基因株系置于25℃和14/10h光周期条件下培养14天后,对其进行20％PEG模拟干旱处理，在0、3、6、12、24h处理时间点，取转基因拟南芥植株用于GUS组织化学染色和GUS活性定量分析。
7、结果分析
7.1 ZmOMA基因的表达模式分析
对玉米C01自交系植株进行0、3、6、12、24h 20％PEG处理。对处理后的植株检测其在不同部位和不同处理时间下的基因表达量。
结果表明，在玉米叶片中，在处理前期0、3、6h，基因的表达量没有显著改变，在处理12h后，基因的表达量上升，在处理时间达到24h后，基因的表达量显著上升；基因在玉米根中的表达规律与叶中大致相同，且基因在玉米根中的表达量在处理12h和24h后差异极显著(图1)，猜测ZmOMA基因启动子响应干旱胁迫。
7.2 ZmOMA基因启动子序列分析及引物设计
根据PlantCARE
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站分析ZmOMA基因启动子序列结果，显示该2000bp启动子序列中包含大量与干旱响应有关的顺式作用元件，如MBS、MYB、MYC、Myb等(图2)，结合前期qRT-PCR结果，猜测该启动子与响应干旱胁迫有关，故根据启动子中干旱响应元件的位置设计引物(图2)，扩增不同长度的ZmOMA基因启动子5′端缺失序列。
7.3 ZmOMA基因启动子的扩增
提取玉米基因组DNA，根据ZmOMA基因启动子的扩增引物，扩增出相应的启动子片段(图3)。将扩增片段回收后与载体pRI201-AN-GUS相连,得到6个GUS表达载体(P2000、P1730、P1430、P1150、P745、P100)。
7.4 ZmOMAp1730启动子活性最高
将构建好的六个GUS表达载体P2000、P1730、P1430、P1150、P745、P100通过农杆菌介导法注射烟草进行瞬时表达，GUS组织化学染色和GUS定量分析表明：与P2000相比，只有P1730表达量显著上升(图4)。猜测该启动子片段中包含响应干旱胁迫的关键区域，故选取P1730-GUS表达载体进行后续的干旱验证实验，并将其命名为ZmOMAp1730。
7.5 ZmOMAp1730启动活性受干旱诱导
将P1730-GUS表达载体通过农杆菌介导法注射烟草进行瞬时表达。GUS组织化学染色和GUS定量分析表明：随着干旱处理时间延长，GUS蛋白的表达量也随之上升(图5)。
为进一步验证ZmOMAp1730启动子响应干旱胁迫，将P1730-GUS表达载体通过花絮侵染法侵染拟南芥进行稳定表达。GUS组织化学染色和GUS定量分析表明：随着干旱处理时间延长，GUS蛋白的表达量也随之上升(图6)。
通过不同长度启动子片段与全长启动子相比，其中P1730-GUS表达载体表达量最高。此外，进一步的干旱处理实验(瞬时表达与稳定表达)表明，P1730-GUS表达载体随着干旱时间延长，其表达量也随之上升。以上研究结果证实，ZmOMAp1730基因启动子响应干旱胁迫，并受干旱胁迫正向调控。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 玉米干旱诱导型启动子ZmOMAp1730及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1730
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attggtttgt ctgcctctgt tgtgagtttg ttcctgcgtg gtaaaaatac gtaccttgtt 60
attggtagat ggctcgttga tggagtgcat tggattggtg gtcctcctga agactacatt 120
gctgactggt tgtgtcattg tgtgtgatga gagatcttcc agaacttgtg ctgaagtata 180
tgttcctgca taagacaaat tagagttttg atcaggtagg tgcttacccc caaggttttg 240
tgtccattgg tttcttcaga atgagctgcg ttgttgactg ctatatgtgc ggctattttc 300
attatgaact tgcacaactg tccaagattt tggaattgaa tctcttgtcg tttctggctt 360
tccaaatgta ccgaatcatc aggagtatat ggttggatca gagctgcaaa aatttcctgg 420
actccatctt gttcctgagg gaggttagta gtacgtagaa gagggataga agaaaatgag 480
taaaatgtat cagcactaat tgaacttgac atgttgtgtc acttggatct tgaacttaaa 540
aaaacagaaa aacaggtcct aaactaaaaa acaggaaaac atgtcttaaa cttgatggac 600
ctatgcaaaa tcatccaaaa attggatatc aggatatgca tcattttcca gcacgttcgc 660
ctgtggctaa aggctaaggc tgtctccagc aacgtactct aaatttcatc ccctaaagga 720
atattctttg tcctttacag cacactctaa aagattacat cctctatatc ttcgtcatct 780
ccaacaacgt cctctaaatt tcatcctcta tatctcatcg ttcgtatttt caccgaccac 840
tattatcaga aaattttaaa tctatattta tccacacatt tttaactaat ttaaatatta 900
caaattgttt ttgtatttat attaaaaaat atgttttaga actataactt ttttaccatg 960
cgcaaatatt ttttatctaa acaaatctct aaatcccaca tatcccatcc tcttcccagg 1020
cgtttcccac tcccgagcag acgctgctag cacggtgttc atctttgatt tgagctcacc 1080
gctgcgcagc aattgtgggc cgccattcgt gtggacagag agtggtggga acgagaatgg 1140
ttggccgagg tcctacgcgc cgctgcggcg ctcgagcacg gctccgacga tgagatggat 1200
ggcgcggccg aggccctccg tgccgccaca tccccaatcc tctgcatcca cttttcgctc 1260
ctctccggct cctctccggc gagcgaatcg ccgtggatct cgatgagaag gatgctggag 1320
catggcacga acgcggatag cgaacgcaag ctcgtccgct aggattaccg aacgatgagg 1380
accctgtaaa atttagcgca tcttttagcg tctattgctg gagacgtaaa gtaagtcacc 1440
gttcgctaca tttaggggag aggacccttt acagggtgtt gctggagaca gcctaaagct 1500
ctccaggcga aggttttgat gtgcttccag gtgcgttgta gtatctgcac tgctgctgac 1560
atgttgagtc ctgtactccg tcatatatgg gcctacgata cgaaactggg ccttgcgaag 1620
tttcccagca agtgctagag agtgccaggc gacacggttc gctcggcggc ggcgccatct 1680
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<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
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<400> 6
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<210> 7
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 12220
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 600
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 660
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 720
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 780
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 840
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactcga tcctacaagg 900
tagaatccgc ctgagtcgca agggtgactt cgcctatatt ggacgacggc gcgcagaggg 960
cgacctcttt ttgggttacg attgtaggat tatcactaaa acaatacatg aacatattca 1020
aatggcaatc tctctaaggc attggaaata aatacaaata acagttgggt ggagtttttc 1080
gacctgaggg cgttaacctt ctgttaacct aaaagctctt gcccaaacag cagaatcggc 1140
gctaattgcc agcggcggaa cttttccagt ttcgcgaaaa atatcgccac tggcaaggaa 1200
tgggtttgag atggcgaagt ctgtcctaaa agcagcgcct gtagttgtag ggttgacggc 1260
cttgatggag cgtcatgccg atgccctctc gagccaactt caagcacatc atcttaaggt 1320
tttcccgccg cattccgaga agggtattcg aacattcggg ccatcggagg cgtccaagct 1380
gctcggcgtt ggcgagtcat atttacggca gaccgcgtct gagatgccag agttgaatgt 1440
tagcatgagc ccaggtggca ggcgaatgtt ctcaattgaa gatatccatg tgattcggaa 1500
gtatatggat caggtcggcc gcgggaaccg gcgctacctg ccacatcgtc gaggcggcga 1560
gcagcttcag gttatctctg tgatgaattt caaaggtggg tcgggtaaga ccaccaccgc 1620
cgcgcatctg gcgcagtacc tcgctatgcg cggatatcga gtcttggcca ttgatctcga 1680
tcctcaagcg agcctttctg cactctttgg gagccaaccg gagacggacg ttggcccgaa 1740
cgaaacgctc tacggcgcta taaggtatga tgatgagcag gtggcaatcg aacgagtcgt 1800
ccgagggact tacattcccg acctccacct gattcctggt aaccttgagc tgatggagtt 1860
tgaacacgat acgccacgcg cgctgatgaa ccgcaaagag ggcgacacgc tcttttatgg 1920
tcgcatcagc caagtaattg aagatatcgc ggataactat gacgtcgtgg tcatcgactg 1980
ccctccccag cttgggtatc tcacgctatc cgcattgact gcggcgacgt ccattcttgt 2040
cacggtccat ccgcagatgc tggatgtgat gtcgatgaac cagtttctgg caatgacatc 2100
gaaccttttg cgtgaaatcg agaatgctgg cgccaagttc aagtttaatt ggatgcgcta 2160
tctgataacc cgtttcgaac cgagcgacgg accacagaac caaatggtag gttatctgcg 2220
gtcgattttt ggcgaaaatg tcctcaattt tccgatgctt aaaaccaccg cggtttcgga 2280
cgctggcctg acaaaccaga ctctattcga agtggagcgt ggcctgttca cgcgctcgac 2340
ctatgatcga gccttggagg cgatgaacgc cgtcaacgac gagatcgaaa cactgatcaa 2400
aaaagcatgg ggtaggccca catgagccgg aagcacatcc ttggcgtctc aactgacgcc 2460
cctgagacgt cgcccgccga caataggacg gcaaagaacc gctccatgcc gctcctcggc 2520
gtaacaagga aggagcgcga tccggcaacg aagctcacag cgaacattgg taacgcactg 2580
cgagagcaaa acgatcgtct tagccgtgcc gaagagatcg agcggcgtct cgctgaaggt 2640
caggcagtga tagagttgga tgcctcgtca atagaaccgt ctttcgtgca ggatcgtatg 2700
cgaggggaca ttgacgggct ccttacttcg atccgggaac aaggacagca agtcccaatc 2760
cttgtgcgac cgcatccgag ccagccgggc cgatatcagg ttgccttcgg ccaccgccgg 2820
ctacgcgccg tttcagaact cggacttccg gtcagggcgg tcgttcgcga actgacggac 2880
gagcaagtgg tcgtagcaca gggtcaggaa aacaatgtgc gcgaagatct taccttcatc 2940
gaaaaggcgc gcttcgcaca tcgcctgaac aggcagtttt ctcgagagat tgtcatcgcc 3000
gcgatgtcga tcgacaagag caatttgtcc aagatgcttc tgctcgttga cgccctcccc 3060
tctgaactga ccgatgctat tggtgccgct cctggtgttg gacggccgag ttggcaacaa 3120
cttgccgagc tgattgagaa agtttcttca ccggccgacg tggctaaata tgctatgtcg 3180
gaggaagttc aagcgctgcc atcggcagaa cgattcaagg cggtgatcgc tagtctgaag 3240
cccagtcggg ttgcgcgtgg acttcccgag gtcatggcca ccccagacgg caccagaatt 3300
gcacaggtga cgcagagcaa ggccaaactg gaaatcacga ttgacaggaa ggcgacgccc 3360
gattttgcga ccttcgtgct cgatcatgtg ccagcgctgt atcaagcgta ccacgctgag 3420
aaccaacgga aacggggaga gtaaaccgca aaagaaaaga gccccctcaa cgtcgccgtc 3480
gcggaagccc ttctgtctct ctagcgcgaa cagaatcgca tttcctcgaa tcctcgtcaa 3540
gagtttttag cgccgttttg gtgagctgat ttcctttgcc tgctgaaagg tgaaagatga 3600
tgcagacagg aagtgtaacg acgccattcg ggcggcggcc aatgacgctt gcgcttgtgc 3660
ggcgccagac ggcgctggcc gatatcaaac aaggcaagac agcggacaag tggaaggtct 3720
ttagggacgc gtccgcggcc atggaactac ttggaatcca gtccaacagt cttgccgtcc 3780
ttgatgcgct attgagcttt cacccggaaa cggagttgcg tcaggaggca cagctgatcg 3840
tcttcccgtc gaatgctcag cttgcccttc gggcgcatgg gatggctggc gcgactttgc 3900
gtaggcacat cgccatgctc gtggagtcag gcttgatcgt ccggaaggat agcgccaacg 3960
gaaagcgtta cgctcgtaag gatggcgctg gtcagatcga gcgcgcgttt ggcttcgatt 4020
tgtctccgct tctcgcgcgg tccgaagagc tagcgatgat ggcacagcag gtgatggccg 4080
atcgagcagc attcaggatg gccaaagaaa gtctgacgat ttgccgacgg gacgttcgga 4140
agctaattac ggcagctatg gaagagggag cggagggcga ctggcaagct gtcgaggaag 4200
tctatgtgga acttgtgggt agaatcccac gcgccccgac gcttgctgat gtagagtcaa 4260
ttctcgaaga gatgtggatg ctccaggaag agataatcaa ccggttggaa attagagaca 4320
attcagaaaa taatagcacc aatgctgccc agagcgagca gcacatacag aactcaaaac 4380
ccgaatccgt taatgaactt gaacctcgct ctgaaaagga gcagggcgct aagccgagtg 4440
aaatagaccg ggcaaggagc gagccgataa aagcgttccc cctcgggatg atcctgaaag 4500
cgtgcccgac cattggcaat tatgggccga gcggtgcggt tgctagctgg cgtgacctca 4560
tgtcggctgc ggtggtggtt cggtctatgc tgggggtcag cccgtcggct taccaagacg 4620
cgtgtgaggc aatgggaccg gagaatgcgg cagcagcgat ggcgtgcatt ttggagcgag 4680
cgaacttcat caattcgcct gggggctatc tccgagatct gacacggcgg agcgaactcg 4740
ggaagttttc acttggcccg atgataatgg cgctcttgaa ggctagcggg caggggacgt 4800
tgcggtttgg ctagaattag cgagtatgga gcaggatggt ctgtggtcag ctgaccacag 4860
acctaatagg ttgaaaacat gagcgttttt tggatgatcg acagaccatc cgattcccgg 4920
agtaccaagc gtgctctgat gggagcgata acattactca acaagcacga aggccccatg 4980
ccgatcgttg atcgtgaagg agagcctgct ctacatgcgg cggtattttg ccggccgagg 5040
catgtagtcg cggagcactg cctatttact gccctaggca caaacgttga ctcttggatc 5100
gagctggcag acaaagcaat aacccacaca gaggacgatt aatggctgac gaagagatcc 5160
agaatccgcc ggacggtact gctgctgccg aagttgagcc ggctgctcct agaggtagaa 5220
gagcaaagaa agcaccagcc gaaacagccc gcacgggatc gttcaaatcc gtgaagccga 5280
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tcgctggcgg cgcaaccttg aaggacgccg ttaagatcgt gggtatttcc gttcagacct 5400
attatcaatg gaagagagct gcggttcaac ctgtctcaca gaatccggcc gtgtctgttt 5460
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agctagcttg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 5580
acacattgcg gacgttttta atgtactggg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc 5640
aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg 5700
gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggttc cgaaatcggc aaaatccctt 5760
ataaatcaaa agaatagccc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 5820
cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 5880
gcccaaattc ccgatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg 5940
cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa 6000
aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat 6060
tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac 6120
tttattgcca aatgtttgaa cgatcggggc ccgatcatat tgtcgctcag gatcgtggcg 6180
ttgtgcttgt cggccgttgc tgtcgtaatg atatcggcac cttcgaccgc ctgttccgca 6240
gagatcccgt gggcgaagaa ctccagcatg agatccccgc gctggaggat catccagccg 6300
gcgtcccgga aaacgattcc gaagcccaac ctttcataga aggcggcggt ggaatcgaaa 6360
tctcgtgatg gcaggttggg cgtcgcttgg tcggtcattt cgaaccccag agtcccgctc 6420
agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac 6480
cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg 6540
tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc 6600
cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga 6660
cgagatcatc gccgtcgggc atacgcgcct tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga 6720
gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac 6780
gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg 6840
tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag 6900
atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag 6960
tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg 7020
ctgcctcgtc ctgtagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg 7080
ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg 7140
cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat 7200
cttgttcaat catgcgaaac gatccagatc cggtgcagat tatttggatt gagagtgaat 7260
atgagactct aattggatac cgaggggaat ttatggaacg tcagtggagc atttttgaca 7320
agaaatattt gctagctgat agtgacctta ggcgactttt gaacgcgcaa taatggtttc 7380
tgacgtatgt gcttagctca ttaaactcca gaaacccgcg gctgagtggc tccttcaacg 7440
ttgcggttct gtcagttcca aacgtaaaac ggcttgtccc gcgtcatcgg cgggggtcat 7500
aacgtgactc ccttaattct ccgctcatga tcctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 7560
gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct 7620
ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 7680
acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcccgggat ccagcggccg caggtaccaa 7740
ttccttatct ttaatcatat tccatagtcc ataccatagc acatacagta gttatatgcg 7800
aagagatcca acaaaacatt cacaatggat tatagaaaca tttgtttatt cattataatg 7860
agatcttaca ttcatttaat attagaaaaa gccacaaatt cataacacaa caagccaaga 7920
aaaaaacaca aacttaagca cacaagctag ctttttattt gacacaccaa atatttcatc 7980
ttcatcttca taagagctcg gtagcaattc ccgaggctgt agccgacgat ggtgcgccag 8040
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cggtgataca tatccagcca tgcacactga tactcttcac tccacatgtc ggtgtacatt 8340
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ctttggacat accatccgta ataacggttc aggcacagca catcaaagag atcgctgatg 8520
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cgaccaaagc cagtaaagta gaacggtttg tggttaatca ggaactgttc gcccttcact 9060
gccactgacc ggatgccgac gcgaagcggg tagatatcac actctgtctg gcttttggct 9120
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tcaacgctga catcaccatt ggccaccacc tgccagtcaa cagacgcgtg gttacagtct 9300
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attacgctgc gatggatccc ggcatagtta aagaaatcat ggaagtaaga ctgctttttc 9420
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tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctccca ccagcttata 11760
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tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattc actgttcctt 11940
gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc aaagttggcg 12000
tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccacaat tatgggtgat gctgccaact 12060
tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt ttctatcagc 12120
tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat 12180
cagcgctatc tctgctctca ctgccgtaaa acatggcaac 12220
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