检测小鼠脑梗死体积的试剂盒、其制备方法及检测方法
阅读说明：本技术 检测小鼠脑梗死体积的试剂盒、其制备方法及检测方法 (Kit for detecting cerebral infarction volume of mouse, preparation method and detection method thereof ) 是由 薛珂 折佟平 祁勉 李霞 顾锦华 于 2021-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种检测小鼠脑梗死体积的试剂盒,包括：Na-2HPO-4·12H-2O、KH-2PO-4、NaCl、KCl、ddH-2O和TTC。本发明建立了急性缺血性脑卒中的动物模型,通过使用目前存在的TTC染色方法以及我们的试剂盒进行实验,比较在脑缺血再灌注模型组中的小鼠脑梗死体积的染色情况,为脑梗死体积的测量提供一种新思路和理论依据。相对于传统的TTC染色来看,本发明的试剂盒具有染色均匀和染色快速的优势。(The invention provides a kit for detecting the cerebral infarction volume of a mouse, which comprises: na (Na) 2 HPO 4 •12H 2 O、KH 2 PO 4 、NaCl、KCl、ddH 2 O and TTC. The invention establishes an animal model of acute ischemic stroke, compares the staining condition of the mouse cerebral infarction volume in the cerebral ischemia reperfusion model group by using the existing TTC staining method and the kit to perform experiments, and provides a new thought and theoretical basis for the measurement of the cerebral infarction volume. Compared with the traditional TTC staining method, the kit has the advantages of uniform staining and quick staining.)
技术领域
本发明属于生物医学
技术领域
，具体涉及一种检测小鼠脑梗死体积的试剂盒、其制备方法及检测方法。背景技术
脑血管疾病包括出血性出血性脑中风和缺血性脑中风。脑卒中是我国成人死亡第二大病因，其中缺血性脑中风是脑血管疾病的主要类型，约占85%左右。缺血性脑中风、脑血栓、脑栓塞、腔隙性缺血性脑中风和多发性缺血性脑中风及小中风都属于缺血性脑卒中，缺血性脑卒中又叫缺血性脑梗死，是指脑血管狭窄或闭塞，导致脑血流阻断而使脑组织发生缺血缺氧、软化甚至坏死，致使脑血管功能障碍，引起相关症状。动脉粥样硬化是基础，缺血性脑中风存活的患者面临的最大的问题是再发作（五年内的平均复发率高达40%以上）和其他缺血性事件的发生。
由于临床研究的限制，动物脑缺血模型被广泛应用于脑梗死的研究损伤机制及防治措施。TTC（2,3,5—氯化三苯基四氮唑）染色是缺血性脑卒中实验研究的常用方法。TTC（2,3,5—氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，1894年用于合成用来检测种子的生存能力，1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。
TTC染色是TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲臜，用来表示细胞的活力。配制多为2%，染色要避光，37℃条件下，它是评价脑缺血损伤常用的指标。虽然目前的TTC染色方法较为普遍，但在这一领域还有很多的细节性技术需要研究人员去填补，比如存在染色时间较长、染色不均匀的现象。因此，急需获得一种染色快速并染色均匀且精准的试剂盒，从而在实验研究中通过对脑梗死体积进行精准快速的检测，实现有效快速计算脑梗死体积，进一步实现实验研究的快速精确的进展。
目前基础研究的TTC染色的技术手段存在染色不均匀、对比度不高、梗死边界不清晰等现象，这就意味着研究人员在脑统计梗死体积时可能会存在不精确的问题。再者，现有的TTC染色技术还存在染色时间较长的问题，一般染色时间为15-30分钟不等，大大浪费了科研人员的时间与精力。因此，急需要一种染色快速、精确并染色均匀的测量脑梗死体积的试剂盒，通过应用此试剂盒与实验技术，大大节约研究人员的时间与精力，实现有效测量脑梗死体积的技术手段，进一步实现测量脑卒中脑梗死体积的精准医疗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能快速检测小鼠脑梗死体积的试剂盒、其制备方法及检测方法，在检测脑梗死体积的技术与方法中更加快速、精确并染色均匀的测量脑梗死体积，为目前所存在的TTC染色提供进一步的改善与指导方案。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种检测小鼠脑梗死体积的试剂盒，包括：Na2HPO4•12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、ddH2O和TTC。
本发明还提供一种检测小鼠脑梗死体积的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
S1、含钾离子的1x0.01 M PBS（磷酸盐缓冲液）的配制：称取3.63g Na2HPO4•12H2O、0.24g KH2PO4、8.0g NaCl、0.2g KCl于烧杯中，再使用量筒量取500ml ddH2O于烧杯中使其溶解，最后再使用量筒量取ddH2O定容至1000ml，在磁力搅拌器上搅拌均匀；
S2、1% TTC染色液的配制：根据实验需要使用含钾离子的1x0.01 M PBS配制1%的染色液，避光混匀；
S3、2% KH2PO4的配制：称取0.2g KH2PO4 烧杯中，加入10ml的含有钾离子的1x0.01M PBS，Vortex混匀；
S4、染色试剂盒的制备：同时加入上述的使用含钾离子的1x0.01 M PBS配制1%的染色液、2% KH2PO4，避光混匀，制成染色试剂盒备用。
其中，步骤S1中，Na2HPO4•12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl的质量比为：3.63:0.24:8:0.2。
本发明还提供一种检测小鼠脑梗死体积的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
S101、断头法处死动物后迅速取脑（3min内），反面置于载玻片粗糙面上，快速转移至-20℃冰箱中；
S102、于-20℃冰箱中冷冻15-40min；
S103、在染色瓶里提前加入6ml试剂盒染色液，避光；
S104、将脑片拿出-20℃，快速使用刀片将小鼠脑切成5块，厚度为2mm；
S105、将切好的5片脑片立马放入装有试剂盒溶液的瓶子中，封口膜封口，37℃避光水浴等待，每30s轻晃动，使其充分染色；
S106、待充分染色均匀时，水浴锅中拿出后，取出脑片，使用PBS溶液洗涤3-5min；
S107、对染色结束的脑片使用4%的PFA进行固定、过夜；
S108、选择图像进行分析，测量每一片的梗死体积，每一层梗死为该层梗死面积，每层梗死体积为该层梗死体积和层厚的成绩，各层的梗死体积即为总的梗死体积；
S109、计算统计，并数据分析。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1、相对于传统的TTC染色来看，本发明的试剂盒具有染色均匀的优势，能显著提高红白对比度，使得研究人员在统计梗死体积时更为精确，减少误差。
2、相对于传统的TTC染色来看，本发明的试剂盒也具有染色快速的优势，传统TTC在1min时还未出现梗死区域，而本发明试剂盒在1min时已经出现较为明显的梗死区域，且红白对比度较高。而随着时间的延长，本发明试剂盒组的梗死区域更加明显，且基本在5min时就已经完成染色，而传统的TTC染色组在15-30min才可完成染色。总之，本发明的试剂盒显著的减少了实验人员的时间与精力，可为测量脑梗死体积方面提供一种新的思路与方法。
3、本发明的研究结果将为测量脑梗死体积提供新的思路与方法，将在促进研究人员的科研方面发挥重要的作用，比如在研究急性缺血性脑卒中、高血糖、阿尔茨海默病等疾病中发挥重要的作用。
附图说明
图1为本发明中传统TTC染色与发明试剂盒染色效果比较图；
图2为本发明中传统TTC染色与发明试剂盒染色时间情况比较图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种检测小鼠脑梗死体积的试剂盒，包括：Na2HPO4•12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、ddH2O和TTC。
检测小鼠脑梗死体积的试剂盒的制备方法包括如下步骤：
S1、含钾离子的1x0.01 M PBS（磷酸盐缓冲液）的配制：称取
3.63g Na2HPO4•12H2O(10039-32-4，西陇科学股份有限公司)、
0.24g KH2PO4(7778-77-0, 西陇科学股份有限公司)、
8.0g NaCl(7647-14-5, 上海润捷化学试剂有限公司)、
0.2g KCl(7447-40-7, 西陇科学股份有限公司)于烧杯中，再使用量筒量取500mlddH2O于烧杯中使其溶解，最后再使用量筒量取ddH2O定容至1000ml，在磁力搅拌器上搅拌均匀；
S2、1% TTC染色液的配制：根据实验需要使用含钾离子的1x0.01 M PBS配制1%的染色液，避光混匀；
S3、2% KH2PO4的配制：称取0.2g KH2PO4 烧杯中，加入10ml的含有钾离子的1x0.01M PBS，Vortex混匀；
S4、染色试剂盒的制备：同时加入上述的使用含钾离子的1x0.01 M PBS配制1%的染色液、2% KH2PO4，避光混匀，制成染色试剂盒备用。
检测小鼠脑梗死体积的试剂盒的检测方法包括如下步骤：
S101、断头法处死动物后迅速取脑（3min内），反面置于载玻片粗糙面上，快速转移至-20℃冰箱中；
S102、于-20℃冰箱中冷冻15-20min；
S103、在染色瓶里提前加入6ml试剂盒染色液，避光；
S104、将脑片拿出-20℃，快速使用刀片将小鼠脑切成5块，厚度为2mm；
S105、将切好的5片脑片立马放入装有试剂盒溶液的瓶子中，封口膜封口，37℃避光水浴等待，每30s轻晃动，使其充分染色；
S106、待充分染色均匀时，水浴锅中拿出后，取出脑片，使用PBS溶液洗涤3-5min；
S107、对染色结束的脑片使用4%的PFA进行固定、过夜；
S108、选择图像进行分析，测量每一片的梗死体积，每一层梗死为该层梗死面积，每层梗死体积为该层梗死体积和层厚的成绩，各层的梗死体积即为总的梗死体积；
S109、计算统计，并数据分析。
下面通过使用目前存在的TTC染色方法以及本发明的试剂盒进行染色实验，进一步严重本发明的优点。
通过对脑片进行染色，并检测其染色时间以及染色效果，旨在发现使用本发明的试剂盒并在染色过程中加入钾离子的实验方法是否染色时间更短，着色更为均匀。
1、实验过程：
实验品准备：将缺血3h再灌注24h的ICR小鼠放置在手术室，配制传统的TTC染色溶液以及本发明试剂盒染色溶液作为备用，将水浴锅打开并将水浴锅温度调节至37℃，准备枪头、染色瓶子等备用。
实验分为两个组，一个组作为实验组1，使用现有的TTC染色方法，在染色过程中加入5ml的2%的TTC溶液，并同时加入1ml生理盐水。实验具体过程为：首先将动物安乐死后进行断头取脑，再将取出的脑组织反面置于冰箱-20℃进行速冻15-20分钟。在此期间，在染色瓶里提前加入6ml试剂盒染色液，避光处理。速冻完成之后，再将脑片拿出-20℃，快速使用刀片将小鼠脑切成5块，厚度为2mm，然后将切好的5片脑片立马放入装有现有方法TTC染色溶液的瓶子中，封口膜封口，37℃避光水浴等待，每30s轻晃动，使其充分染色。待充分染色均匀时，水浴锅中拿出后，取出脑片，使用PBS溶液洗涤3-5min。对染色结束的脑片使用4%的PFA进行固定、过夜。第二天使用佳能扫描仪对按照前后顺序依次在载玻片上摆放整齐的5片脑片进行拍图，分辨率为300dpi，然后选择拍摄的图像使用Fiji(Image J)软件进行分析，测量每一片的梗死体积，每一层梗死为该层梗死面积，每层梗死体积为该层梗死体积和层厚的成绩，各层的梗死体积即为总的梗死体积。最后按照Fiji(Image J)的计算结果进行统计，并数据分析。
另一个组作为实验组2，使用本发明的试剂盒，在染色过程中加入同等体积的染色液，并同时加入1ml的钾离子（KH2PO4，磷酸氢二钾）。实验具体过程为：首先将动物安乐死后进行断头取脑，再将取出的脑组织反面置于冰箱-20℃进行速冻15-20分钟。在此期间，在染色瓶里提前加入6ml试剂盒染色液，避光处理。速冻完成之后，再将脑片拿出-20℃，快速使用刀片将小鼠脑切成5块，厚度为2mm，然后将切好的5片脑片立马放入装有本发明试剂盒溶液的瓶子中，封口膜封口，37℃避光水浴等待，每30s轻晃动，使其充分染色。待充分染色均匀时，水浴锅中拿出后，取出脑片，使用PBS溶液洗涤3-5min。对染色结束的脑片使用4%的PFA进行固定、过夜。第二天使用佳能扫描仪对按照前后顺序依次在载玻片上摆放整齐的5片脑片进行拍图，分辨率为300dpi，然后选择拍摄的图像使用Fiji(Image J)软件进行分析，测量每一片的梗死体积，每一层梗死为该层梗死面积，每层梗死体积为该层梗死体积和层厚的成绩，各层的梗死体积即为总的梗死体积。最后按照Fiji(Image J)的计算结果进行统计，并数据分析。
两组同时进行染色并处理，所处条件除了所用染色试剂盒不同其他条件均相同。最终对比发现，使用本发明的试剂盒染色较为均匀，且染色时间较短。
2、实验结果：
2.1、相对于传统的TTC染色，本发明的试剂盒染色更加均匀
传统的TTC染色技术作为实验组1，使用本发明的试剂盒进行染色作为实验组2。染色结果如图1所示，根据染色原理，红色区域代表的是非梗死部分，白色区域代表的是梗死部分。比例尺为10mm。结果发现，实验组1染色不均匀，对比度不高，甚至看不清梗死与非梗死部分的边界，以至于在测量脑梗死体积时误差较大，为研究人员带来较大的测量困扰；而实验组2染色均匀，对比度极高，在测量脑梗死体积时较为精确。
2.2、相对于传统的TTC染色，本发明的试剂盒染色更加快速
传统的TTC染色技术作为实验组1，使用本发明的试剂盒进行染色作为实验组2。染色结果如图2所示，根据染色原理，红色区域代表的是非梗死部分，白色区域代表的是梗死部分。分别在1min、5min、10min、15min进行拍片，测量脑梗死面积比。结果发现，实验组1实验组在染色1min时，还未出现梗死区域，随着时间的推移，染色慢慢增加，在10min时梗死区域的对比度仍然不高。基本在染色15min再往后梗死区域未发生变化，染色时间在15min左右。而在实验组2中，在染色1min时，就已经出现较为明显的梗死区域，随着时间的推移，染色区域慢慢更为明显，对比度极高，在5min再往后梗死区域基本已经不会再发生变化，染色时间仅需要5min左右，快速而且精确的达到实验要求，大大的减少了实验人员的时间与精力的消耗。
本发明建立了急性缺血性脑卒中的动物模型，通过使用目前存在的TTC染色方法以及我们的试剂盒进行实验，比较在脑缺血再灌注模型组中的小鼠脑梗死体积的染色情况，为脑梗死体积的测量提供一种新思路和理论依据。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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