具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

T4连接酶购自NEB；

DNA聚合酶购自Takara，商品名称为Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase；

DNA纯化回收试剂盒购自Magen；

重组试剂盒购自诺唯赞，商品名称为ClonExpress Ultra One Step CloningKit；

PX330载体购自Addgene；

129mES细胞来自本实验室分离；

H9 hES细胞来自ATCC；

NP40、蛋白酶K和F12培养基购自Thermo Scientific；

PCR扩增试剂购自诺唯赞Vazyme；

AP1903购自DC Chemicals；

Annexin V-FITC/PI检测试剂盒购自BD Biosciences；

Hoechst33342购自碧云天Beyotime；

DMEM高糖培养基购自Hyclone；

血清购自Gibco；

Matrigel购自Corning；

免疫缺陷鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司；

Nanog抗体Sox2抗体购自R&D；

OCT4抗体、ɑ-SMA抗体、AFP抗体和GFAP抗体购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY；

TRA-1-81抗体购自Millipore。

实施例1

本实施例提供一种OCT4基因编辑系统，所述OCT4基因编辑系统包括靶向OCT4基因的sgRNA、spCas9和供体质粒。

所述OCT4基因编辑系统通过如下方法进行制备：

(1)构建含有靶向OCT4基因的sgRNA和Cas9的表达载体：

为了实现iCASP9在内源多能性基因OCT4位点的特异性表达，同时为了保持干细胞的多能性特征，需要尽量小的干扰内源基因的正常功能，所以选择在基因表达终止子的位置进行定点插入，通过自剪切多肽2A序列(self-cleaving2A peptide，2A)连接OCT4和自杀基因，达到与多能性基因共表达的目的。

所述靶向OCT4基因的sgRNA包括mgRNA或hgRNA中的任意一种；

其中，所述mgRNA的编码序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述hgRNA的编码序列包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，加粗部分为靶向位点。

SEQ ID No.1：

SEQ ID No.2：

合成靶向OCT4基因的sgRNA的编码序列，通过T4连接酶连接到PX330载体上，得到含有靶向OCT4基因的sgRNA和Cas9的表达载体mgRNA-spCas9和hgRNA-spCas9。

(2)构建含有iCASP9基因和筛选标记基因的供体质粒；

为了防止iCASP9自杀基因在细胞中表达过多引起细胞的自发凋亡，设计了2种供体质粒，分别是2A-Tdtomato-IRES-iCASP9(命名为T9)和2A-iCASP9-PURO(命名为9P)，结构及打靶示意图如图1所示。T9通过核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)降低其后的iCASP9基因的表达量，用Tdtomato作为阳性筛选标记，便于后续的流式分选。而9P中2A肽结构短小并且上下游基因的表达平衡性好，因此在9P中iCASP9的表达稍高，同时9P通过嘌呤霉素进行阳性筛选。

使用DNA聚合酶进行上述片段的扩增，通过DNA纯化回收试剂盒进行DNA凝胶回收，并使用重组试剂盒将片段进行重组连接。

经验证，成功构建了OCT4基因编辑系统。

实施例2

本实施例提供一种诱导死亡的重组细胞，所述诱导死亡的重组细胞为经过实施例1中所述的OCT4基因编辑系统编辑后，OCT4基因中插入了iCASP9基因的多能干细胞。

所述重组细胞通过如下方法进行制备：

(1)表达载体和供体质粒通过转染导入多能干细胞中：

按照转染试剂说明书上的要求进行转染实验，将表达载体和供体质粒按照质量比为1:3转染到小鼠胚胎干细胞(129mES)和人胚胎干细胞(H9 hES)中。对129mES而言，使用表达载体mgRNA-spCas9和2种供体质粒分别进行转染；对H9 hES而言，使用表达载体hgRNA-spCas9和2种供体质粒分别进行转染。

(2)筛选阳性克隆：

转染后5天对T9组进行流式分选，得到tdTomato阳性的细胞，同时9P组添加工作浓度2μg/mL的嘌呤霉素筛选2周，得到具有嘌呤霉素抗性的细胞。阳性克隆的筛选结果如图2所示。

经鉴定，成功筛选出4种阳性克隆：MT9(受体细胞为129mES细胞，供体质粒为T9)、HT9(受体细胞为H9 hES细胞，供体质粒为T9)、M9P受体细胞为129mES细胞，供体质粒为9P)和H9P(受体细胞为H9 hES细胞，供体质粒为9P)，可用于后续的实验中。

(3)PCR鉴定：

挑取阳性克隆使用NP40裂解液(0.45％NP40和60μg/mL蛋白酶K)在PCR仪中进行裂解，以裂解产物作为模板，对插入片段的5端和3端分别进行PCR鉴定。

检测使用的引物及扩增产物的大小如表1所示，引物名称与位点的对应关系如图3A和图3B所示。

表1

SEQ ID No.3：gttcagccagaccaccatct；

SEQ ID No.4：ggctgttttaacttcctccg；

SEQ ID No.5：tacaagtagatgcggccgccccctctccctcc；

SEQ ID No.6：cagcctggcctacagagttc；

SEQ ID No.7：tgcagaaagaactcgagcaa；

SEQ ID No.8：gcggccgcatctacttgtacagctcgtccat；

SEQ ID No.9：gagccttacaccaagccaaa；

SEQ ID No.10：ttcaagcatcccggtgtagt；

SEQ ID No.11：gcaacctccccttctacgag。

PCR鉴定结果如图4A、图4B、图4C和图4D所示。由图可知，目标片段成功插入到受体细胞的基因组中。取鉴定后的阳性克隆(即重组细胞)扩大培养，并进行后续实验。

实施例3

本实施例测试实施例2构建得到的重组细胞在药物诱导时所需的最佳浓度和处理时间，步骤如下：

使用浓度梯度为0～200nM的药物AP1903对重组细胞进行诱导处理，同时使用野生型129mES和H9 hES作为对照，通过MTS细胞毒性实验进行检测分析，结果如图5A所示。由图可以确定最佳的药物浓度为10nM。同时可以看出，在5nM的低浓度处理下，9P组反应要比T9组更敏感，另外，过高浓度在MT9和M9P组中出现明显的勾回效应，即随着浓度增加，诱导凋亡效率出现明显的下降，这可能是药物作用出现饱和导致。

接着在10nM的最佳处理浓度下测试诱导四种重组细胞凋亡所需的时间，结果如图5B所示。由图可以看出，M9P和H9P均能在2h内完全凋亡，作用迅速。而表达相对较弱的MT9和HT9则需要较长的诱导时间，其中MT9需要大约72h，HT9需要6h左右。同时对野生型129mES和H9 hES而言，72h内均无明显毒性作用，进一步证明该药物具有良好的选择性和安全性。

考虑到需要尽量快速的诱导凋亡才能更好地阻断畸胎瘤的生长，选择M9P和H9P进行后续的实验，同时采用10nM的处理浓度和2h的处理时间。

实施例4

本实施例对药物处理后的重组细胞进行凋亡检测，步骤如下：

向M9P和H9P中加入终浓度为10nM的AP1903，处理2h，随后通过Annexin V-FITC/PI进行凋亡检测，结果如图6A所示。同时对给药前后细胞的Annexin V-FITC/PI染色情况进行流式分析，结果如图6B所示。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双分子层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸具有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸判断细胞的生理状态。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

在图6A中可以看到，给药2h后M9P和H9P克隆中几乎所有细胞都发生了破碎和皱缩，同时死细胞漂浮起来形成团状，无可见的完整细胞形态，给药6h后无可见贴壁细胞。由图6B可知，相比于未给药组，给药组超过95％的细胞处于Annexin V-FITC和PI双阳性的凋亡晚期或者Annexin V-FITC单阳性的凋亡早期以及PI单阳性的死细胞状态，效果快速显著。

实施例5

本实施例对诱导分化后的M9P和H9P进行诱导凋亡检测，步骤如下：

对M9P和H9P使用分化培养基(90％DMEM高糖培养基和10％血清)进行培养，一周后可以看到混杂的细胞群形成，包括聚拢形态的干细胞(白色虚线部分)和平铺形态的分化细胞。加入终浓度为10nM的AP1903，处理2h，随后使用PI和Hoechst33342染色，结果如图7所示。

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，可被PI着红色。Hoechst为膜通透性的荧光染料，可对活细胞进行染色。

由图7可知，加药后的M9P细胞中只有聚拢形态的干细胞被PI着色，而周围的分化细胞只染上Hoechst，而未加药组几乎所有细胞都未被染上PI。H9P分化细胞也有类似的现象，另外在加药后聚拢的克隆漂浮起来形成团状，与之前H9P阳性克隆给药后的情况一致。

综上，此实验证明M9P和H9P细胞系能快速、特异性响应AP1903的凋亡诱导，且AP1903对已分化细胞没有杀伤作用。

实施例6

本实施例对M9P和H9P的多能性标记基因的表达情况进行验证，步骤如下：

对干细胞的多能性标记基因Nanog、Sox2、OCT4、TRA-1-81进行细胞免疫荧光(IF)实验，以野生型129mES和H9 hES细胞作为对照，结果如图8所示。

由图可知，重组细胞中均能检测到与野生型细胞基本一致的多能基因表达，说明M9P和H9P细胞系具有良好的分化潜能，能为后续的干细胞治疗和定向分化提供良好的材料。

实施例7

本实施例使用免疫缺陷鼠通过实验模拟临床干细胞治疗中移植后畸胎瘤的形成，同时验证M9P和H9P的凋亡对畸胎瘤的阻断效果，步骤如下：

将M9P和H9P悬浮于F12培养基中(密度为1×10⁷个/mL)，与Matrigel按体积比为1:1混合，置于冰上。选择4周的免疫缺陷鼠，每只腹腔注射200μL1.25％的阿佛丁麻醉，背侧剃毛，然后在皮下注射200μL细胞Matrigel混合液。

设置给药分组：移植前2h体外细胞给药、移植同时皮下给药和移植后不同时间段腹腔给药，对H9P细胞在移植后设置D1、D7、D14、D21和D28的腹腔给药时间点，AP1903给药量为5mg/kg/day，持续3天注射；对M9P细胞在移植后设置D1、D5、D9、D13、D17和D21的腹腔给药时间点，AP1903给药量为10mg/kg/day，持续3天注射。同时设置注射等体积PBS溶液的对照组。给药方案的示意图如图9A所示。

监测移植鼠的生存和畸胎瘤生长情况，并定期记录以制作畸胎瘤生长曲线和小鼠生存曲线，结果分别如图9B和图9C所示。

通过比较畸胎瘤的生长曲线(图9B)，可以看出H9P细胞在10天后畸胎瘤生长速率明显加快，D14组在畸胎瘤形成早期体积较小时给药，后续肿瘤体积持续缩小；另外D14之前的给药组都无肿瘤产生，而三周后给药则对肿瘤生长影响较小，基本与对照组一致。M9P细胞系在一周左右畸胎瘤生长明显加快，进程要比H9P更早，而D9和D13组都发生了加药后畸胎瘤体积缩小的情况，同时更早给药的组别基本没有畸胎瘤生长，而之后给药对畸胎瘤体积的影响较小，这些结果均与H9P的结果基本一致。

从移植鼠的生存曲线(图9C)也可以看出，给药组小鼠生存率大幅度延长。对H9P而言，移植前2h体外细胞给药、移植同时皮下给药和移植后两周内腹腔给药组的小鼠在6个月内生存良好，也说明该药物对生物体的毒副作用较小，而PBS对照组和D28组存活不超过35天，D21组可以延长到60天左右。与H9P的结果类似，M9P细胞的早期给药组的小鼠的生存率大幅度提高。

另外，向小鼠皮下同时注射野生型H9 hES和H9P，以及野生型129mES和M9P，两周内腹腔给药，对肿瘤的体积进行统计，结果如图9D所示。可以看出AP1903能够特异性杀伤H9P和M9P细胞所形成的畸胎瘤，对未经改造不携带自杀基因的野生型细胞影响较小，同时也证明诱导药物只特异性杀伤重组细胞而对其他细胞的毒副作用较小。另外从图片也可以看出，在个体水平AP1903对129mES WT的影响较小。

综上所述，对H9P和M9P细胞系进行预给药(移植前2h体外细胞给药)，移植同时皮下给药和早期(移植后两周内)腹腔给药对畸胎瘤均有较好的阻断效果，而晚期瘤体较大时药物处理的杀伤效果降低，这也符合干细胞在移植后因为分化、多能性基因表达逐渐降低的事实。预处理给药和移植同时给药的细胞均不致瘤提示临床使用该细胞系进行定向分化后治疗最好在细胞移植前或同时处理纯化。

实施例8

本实施例对实施例7中形成的畸胎瘤进行组织学分析，步骤如下：

在瘤体直径达到2cm后，对取出的畸胎瘤组织分别进行冰冻切片和免疫荧光，通过ɑ-SMA、AFP和GFAP抗体染色鉴定三胚层蛋白的表达和三胚层组织的形成，结果如图10所示。

ɑ-SMA(ɑ平滑肌肌动蛋白)是中胚层标志蛋白、AFP(甲胎蛋白)是由胚胎卵黄囊、胚胎肝细胞及其他内胚层分化的胃肠组织合成，是肝癌和生殖细胞肿瘤标志物。GFAP(外胚层)是神经胶质纤维酸性蛋白，表达于星形胶质细胞、室管膜细胞、视网膜细胞等，是外胚层标志性基因。

由图可知，H9P和M9P细胞系所产生的畸胎瘤组织均能检测到三种胚层marker蛋白的表达，具有较好的全能型。

综上所述，本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在多能干细胞的OCT4基因中插入了iCASP9自杀系统，制备得到了可以诱导死亡的重组细胞。所述重组细胞可以在AP1903的处理下定向杀伤未分化的干细胞而不损害分化后细胞，且具有良好的全能型；通过实验对给药时间和畸胎瘤形成的不同阶段的给药效果进行分析，发现早期给药能抑制畸胎瘤生长，缩小畸胎瘤的体积，为临床应用提供了参考。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种诱导死亡的重组细胞及其应用

<130> 2021

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaacaccgg tgcctcagtt tgaatgcagt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 60

ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 110

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaacaccgc acctcagttt gaatgcatgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 60

ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 110

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttcagccag accaccatct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctgtttta acttcctccg 20

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacaagtaga tgcggccgcc ccctctccct cc 32

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagcctggcc tacagagttc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgcagaaaga actcgagcaa 20

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcggccgcat ctacttgtac agctcgtcca t 31

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagccttaca ccaagccaaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcaagcatc ccggtgtagt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcaacctccc cttctacgag 20