一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用 (sgRNA and cell line with duck hnRNPA3 gene knocked out, and construction method and application thereof ) 是由 陈舜 胡涛 吴震 陈维琼 汪铭书 程安春 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA,所述sgRNA位于鸭hnRNPA3基因第五外显子上,所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述sgRNA对应的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了一种包含上述sgRNA的表达载体,所述表达载体为CRISPR/Cas9重组慢病毒载体,所述表达载体命名为lentiCRISPR-v2-Blast。本发明进一步提供了一种敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系及其构建方法和应用。本发明首次得到敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭源细胞系,本发明中的hnRNPA3基因敲除细胞系能够成为鸭源病毒扩增和研究的重要工具,尤其是有利于研究hnRNPA3基因参与TMUV生命周期中发挥的功能。(The invention discloses a sgRNA for knocking out duck hnRNPA3 gene, wherein the sgRNA is positioned on the fifth exon of duck hnRNPA3 gene, and the nucleotide sequence of the sgRNA is shown as SEQ ID NO. 1; the upstream primer nucleotide sequence corresponding to the sgRNA is shown as SEQ ID NO.2, and the downstream primer nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO. 3. The invention also provides an expression vector containing the sgRNA, wherein the expression vector is a CRISPR/Cas9 recombinant lentiviral vector and is named lentiCRISPR-v 2-Blast. The invention further provides a duck hnRNPA3 gene knockout cell line and a construction method and application thereof. The stably passaged duck source cell line with the duck hnRNPA3 gene knocked out is obtained for the first time, and the hnRNPA3 gene knocked-out cell line can become an important tool for amplification and research of duck source viruses, and is particularly favorable for researching the function of the hnRNPA3 gene participating in TMUV life cycle.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统是在细菌和古生物菌中发现的获得性免疫系统，此系统能够实现对特定基因进行定点切割。其中，基于链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统由于元件组成简单[功能单元：Cas9蛋白和sgRNA(single-guide RNA)]，相对效率高，因此成为目前广泛应用的基因编辑系统。当生物体基因组中出现由CRISPR/Cas9系统带来的双链DNA断裂(doublestrand break,DSB)后，细胞会通过自身的修复机制同源重组(Homology directedrepair,HDR)或非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)对损伤的双链DNA进行修复，由于修复过程中可能在连接处引入突变，因此通常利用这种特点实现对靶基因进行基因编辑，尤其是基因敲除。
慢病毒系统是以HIV-1为基础发展起来的一种基因转导工具。此系统能够在体内外介导分裂和非分裂细胞的有效转导和稳定表达。由于CRISPR/Cas9系统发挥功能需要Cas9蛋白和sgRNA的稳定表达，因此利用慢病毒载体将CRISPR/Cas9系统整合到宿主基因组中，能够稳定的发挥CRISPR/Cas9的功能，从而实现对靶基因的稳定敲除。
鸭坦布苏病毒(TMUV)属于黄病毒科黄病毒属，主要感染鸭，引起鸭的鸭坦布苏病毒病。鸭感染后表现为采食量下降、拉绿色稀粪、产蛋量急剧下降等临床症状。鸭坦布苏病毒病的特点是发病急、传播快，给养鸭业造成巨大的经济损失。因此，对鸭坦布苏病毒的研究非常重要。但是由于目前鸭源的基因敲除细胞系较少，通常只能实现基因敲低和基因过表达，而无法完全将基因敲除，不能提供用于病毒体外研究的鸭源基因敲除细胞系。并且由于鸭坦布苏病毒在现有细胞系中的扩增水平较低，没有合适的基因敲除细胞系严重影响了对鸭坦布苏病毒感染鸭细胞模型的研究。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的没有适合用于鸭坦布苏病毒研究的鸭源基因敲除细胞系，不利于对鸭坦布苏病毒进行深入研究的问题，提供一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA，所述sgRNA位于鸭hnRNPA3基因第五外显子上，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述sgRNA对应的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种包含上述sgRNA的表达载体，所述表达载体为CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述表达载体命名为lentiCRISPR-v2-Blast。
优选地，所述表达载体的构建方法为：人工合成sgRNA序列和sgRNA对应的上、下游引物序列，经退火后形成双链DNA；将双链DNA与经过BsmBⅠ酶切的载体lentiCRISPR-v2连接，获得表达载体lentiCRISPR-v2-Blast；所述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系，所述细胞系为利用上述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast敲除鸭hnRNPA3基因获得的单克隆细胞株，所述细胞系为稳定传代的鸭胚成纤维细胞系。
本发明进一步提供了一种敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
S1、表达载体lentiCRISPR-v2-Blast的构建、转化、筛选、PCR鉴定及测序验证；所述PCR鉴定的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
S2、将S1中构建的表达载体lentiCRISPR-v2-Blast与辅助质粒psPAX2和辅助质粒pCMV-VSV-G共同转染HEK293T细胞，获得重组慢病毒；
S3、杀稻瘟菌素S(Blasticidin S,BS)用于筛选基因敲除阳性细胞的浓度的确定；
S4、将S2中获得的重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞及筛选单克隆细胞。
优选地，所述S2中，所述表达载体lentiCRISPR-v2-Blast、辅助质粒psPAX2和辅助质粒pCMV-VSV-G的质量比为4：3：1。
优选地，所述S3中，分别用浓度为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml的BS培养永生化鸭胚成纤维细胞，据此来确定BS筛选基因敲除阳性细胞的浓度。
进一步优选，所述S4中，用S2中获得的重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞，感染48h后加入S3中确定筛选浓度的BS进行加压筛选；将筛选后存活的细胞稀释并进行单克隆筛选，将筛选出的阳性单克隆细胞进行蛋白质免疫印迹验证；同时继续使用BS维持对阳性单克隆细胞的筛选，从而获得敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭胚成纤维细胞系。
本发明进一步提供了上述敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系在鸭源传代细胞系生产上的应用。
本发明进一步提供了上述敲除鸭hnRNPA3基因的细胞系在制备hnRNPA3基因参与鸭坦布苏病毒(TMUV)生命周期研究的细胞模型上的应用。
本发明所具有的有益效果：
一)本发明利用CRISPR/Cas9系统从传代的鸭胚成纤维细胞中敲除鸭hnRNPA3基因，从基因和蛋白水平的检测都证实已经成功敲除鸭hnRNPA3基因，首次得到敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭源细胞系，本发明中的hnRNPA3基因敲除细胞系能够成为鸭源病毒扩增和研究的重要工具。
二)本发明通过RT-qPCR表明本发明所构建的hnRNPA3基因敲除细胞系感染鸭坦布苏病毒(TMUV)后较亲代鸭胚成纤维细胞中病毒基因组水平更高,说明敲除hnRNPA3基因的细胞系能够显著提高鸭坦布苏病毒(TMUV)的扩增水平；利用TMUV翻译系统表明hnRNPA3基因敲除细胞系能够促进TMUV基因组的翻译，有利于研究hnRNPA3基因参与TMUV生命周期中发挥的功能。
附图说明
图1为靶向鸭hnRNPA3基因的sgRNA及表达载体lentiCRISPR-v2-Blast质粒示意图；
图2为不同浓度的杀稻瘟菌素用于基因敲除阳性细胞筛选的细胞生长图；
图3为敲除鸭hnRNPA3基因阳性单克隆细胞免疫印迹(WB)验证图；
图4为RT-qPCR评价鸭hnRNPA3基因敲除细胞对TMUV增殖影响的结果图；
图5为利用TMUV翻译系统评价鸭hnRNPA3基因敲除对TMUV RNA翻译的影响结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
质粒、细胞、病毒：lentiCRISPR-v2质粒购自Addgene，编号#83480；质粒pCMV-VSV-G购自Addgene，编号#8454；质粒psPAX2购自Addgene，编号#12260；永生化鸭胚成纤维细胞(DEF)购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；DH5α感受态细胞由四川农业大学动物医学院禽病防治中心提供、HEK293T细胞购自于武汉普诺赛生命科技有限公司；鸭坦布苏病毒(TMUV)由四川农业大学动物医学院禽病防治中心提供。
1.表达载体lentiCRISPR-v2-Blast质粒的构建
靶向鸭hnRNPA3基因的sgRNA及表达载体lentiCRISPR-v2-Blast质粒示意图如图1所示。用BsmBⅠ内切酶线性化lentiCRISPR-v2载体，线性化体系与程序如下：BsmBI 1μL，lentiCRISPR-v2质粒1μg，NEB Buffer3.1 5ul，用灭菌水补足到50ul；酶切条件为55℃30min；酶切完成后回收后备用。
人工合成sgRNA序列SEQ ID NO.1和sgRNA对应的上、下游引物序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；将sgRNA寡核苷酸退火成双链。利用DNA连接酶与线性化载体lentiCRISPR-v2-Blast连接，反应体系与程序如下：载体质粒1μL，退火后的sgRNA 1μl，Solution I 5μl，灭菌水3μL；反应条件为16℃1h，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布在含氨苄抗性的LB固体培养基中37℃过夜培养。之后挑取单菌落至含氨苄抗性的固体培养基中，以序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物进行PCR扩增后电泳鉴定菌落，电泳阳性的菌落在含氨苄抗性的LB液体培养基中扩大培养，然后抽提质粒并进行测序验证，获得表达载体lentiCRISPR-v2-Blast，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6。同时抽提辅助质粒pCMV-VSV-G和psPAX2。sgRNA及引物序列详见表1。
表1
2.重组慢病毒包装及浓缩
将HEK293T细胞接种至10cm细胞培养皿，待细胞长到70％-80％进行转染，将构建好的lentiCRISPR-v2-blast质粒与辅助质粒pCMV-VSV-G和psPAX2共同转染HEK293T细胞，其中lentiCRISPR-v2-blast，psPAX2和pCMV-VSV-G的质量比为4：3：1，转染6-8h后换液。转染60h后，收取细胞培养皿中的上清液，用滤膜过滤去除细胞杂质，4℃、12000rpm离心3h。离心后，弃上清，用200ul的Opti-MEM培养基重悬病毒沉淀，获得重组慢病毒悬液用于后续感染。
3.杀稻瘟菌素S(Blasticidin S,BS)用于筛选基因敲除阳性细胞的浓度的确定
为了后续使用BS筛选可能的基因敲除的阳性细胞，首先要确定永生化鸭胚成纤维细胞(DEF)中BS筛选曲线。将永生化DEF传至6孔板，待细胞密度达到70％-80％时，在各孔中依次加入不同浓度的BS(0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml)。每隔24h观察细胞的存活情况，据此来确定BS最佳的使用浓度。死亡细胞呈圆形漂浮于培养基上，活细胞呈梭形贴壁生长。筛选结果表明，8μg/ml的BS可以在加药三天后杀死全部DEF细胞，因此使用此浓度作为后续的筛选浓度。结果如附图2所示。
4.重组慢病毒感染永生化鸭胚成纤维细胞及筛选单克隆细胞
设置试验组和对照组，试验组和对照组均取生长良好的永生化DEF接种于6cm细胞培养皿。试验组细胞密度达到80％时，根据病毒滴度接种慢病毒；对照组不感染病毒。48h后，试验组和对照组均换上含5％FBS的DMEM培养基，同时加入8μg/ml的BS筛选，每3天换液一次，直至对照组细胞全部死亡。
将上述试验组中感染重组慢病毒的永生化DEF消化成细胞悬液，取100ul细胞悬液用DMEM稀释10倍，再取稀释后的细胞悬液20μl，加入等体积的0.4％台盼蓝染液混匀，加入细胞计数室，静置数分钟后进行活细胞计数。将细胞稀释成100个cell/10ml，接种于96孔板中，每3天换液一次，7天后将单克隆细胞传代至24孔板。待24孔板中细胞长满后，扩大培养到两个24孔板中，其中一个24孔板用于蛋白免疫印迹(WB)验证，为9-1clone组；设立对照组为未感染重组慢病毒的亲代鸭胚成纤维细胞(naive DEF)组，WB验证试验结果如附图3所示。将另一个24孔板用于后续的扩大培养，由24孔板传代至6孔板，单克隆细胞在6孔板中生长时加入BS加压维持筛选，6孔板长满后，继续扩大培养并冻存，获得敲除鸭hnRNPA3基因的传代鸭胚成纤维细胞系。
实施例2
验证hnRNPA3敲除细胞系上TMUV增殖情况
设立试验组9-1clone和对照组DEF(IM)，试验组将实施例1中制备的hnRNPA3基因敲除的DEF接种到12孔板中，每组设置三个重复；对照组将等量的亲代鸭胚成纤维细胞(naive DEF)接种到12孔板中，每组设置三个重复。待试验组和对照组的细胞密度达到80-90％时，分别感染等量的TMUV，感染24h后，弃去上清，利用Trizol法对总RNA进行抽提，并将其反转录为cDNA。利用荧光定量PCR(RT-qPCR)，检测试验组和对照组中TMUV E基因相对于内参基因β-actin的表达情况，以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为内参基因β-actin的引物；以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为TMUV E基因的引物。RT-qPCR引物如表2所示。结果如附图4所示，hnRNPA3基因敲除细胞可以显著促进了TMUV在细胞模型上的增殖。
表2
实施例3
验证hnRNPA3敲除细胞系上TMUV病毒RNA翻译情况
设立试验组9-1clone和对照组DEF(IM)，试验组将实施例1中制备的hnRNPA3基因敲除的DEF接种到24孔板中，每组设置四个重复；对照组将等量的naive DEF接种到24孔板中，每组设置四个重复。待密度达到80-90％时，分别转染TMUV翻译系统5’UTR-Rluc-3’UTR，转染4h后，弃去上清，收取细胞样品，检测细胞内Rluc水平，即代表了TMUV基因组翻译情况。结果表明，如图5所示，hnRNPA3基因的敲除可以显著促进TMUV RNA在鸭胚成纤维细胞上的翻译水平。
综上所述，本发明利用CRISPR/Cas9系统从传代的鸭胚成纤维细胞中敲除鸭hnRNPA3基因，首次得到敲除鸭hnRNPA3基因的稳定传代的鸭源细胞系。实施例2中RT-qPCR的结果表明在感染等量的鸭坦布苏病毒(TMUV)后，本发明所构建的hnRNPA3基因敲除细胞系较亲代鸭胚成纤维细胞中的病毒基因组水平更高，说明敲除hnRNPA3基因的细胞系能够显著提高鸭坦布苏病毒(TMUV)的扩增水平；实施例3中利用TMUV翻译系统表明hnRNPA3基因敲除细胞系能够促进TMUV基因组的翻译，本发明提供的hnRNPA3基因敲除细胞系有利于研究hnRNPA3基因参与TMUV生命周期中发挥的功能。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种敲除鸭hnRNPA3基因的sgRNA、细胞系及其构建方法和应用
<141> 2021-10-14
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgcgtccat caaccttatg tgg 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 25
<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 6
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<212> DNA
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gtacttcacc gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa 1980
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gcagaatggg cgggatatgt acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta 2880
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gctgaccaga agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt 3000
gaagaagatg aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa 3060
gttcgacaat ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt 3120
catcaagaga cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga 3180
ctcccggatg aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat 3240
caccctgaag tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg 3300
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gggccgggat tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa 3660
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gaatcccatc gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat 3960
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ctccaagaga gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa 4260
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cgagacacgg atcgacctgt ctcagctggg aggcgacaag cgacctgccg ccacaaagaa 4500
ggctggacag gctaagaaga agaaagatta caaagacgat gacgataagg gatccggcgc 4560
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ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct 5520
tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca 5580
gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcgtcga ctttaagacc aatgacttac 5640
aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt 5700
cactcccaac gaagacaaga tctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag 5760
atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc 5820
ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga 5880
tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gggcccgttt aaacccgctg 5940
atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 6000
ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 6060
atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 6120
gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc 6180
tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc 6240
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tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 6420
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ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 6540
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 6600
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg 6660
aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa 6720
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ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga 6960
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