具体实施方式

本发明在授权公告号为CN103191466 B的专利基础上，提供了一种用于软组织填充修复的脱细胞基质微粒产品，设置不同的工艺参数使得制备的产品具有不同降解梯度和不同降解时间、空间结构，以适合真皮浅层组织、真皮深层组织、真皮下组织等软组织的填充与修复。

本发明一实施例提供了一种用于软组织填充修复的脱细胞基质微粒产品，其包括如下质量百分比的组分：脱细胞基质微粒2.0-10％，助悬剂0.1-5.0％，余量为注射用水；

该脱细胞基质微粒是由非交联脱细胞基质微粒、低交联脱细胞基质微粒、高交联脱细胞基质微粒中的一种或者几种混合组成。

在本发明一优选的实施方式中，上述助悬剂选自透明质酸、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶原、明胶等中的一种或几种。

在本发明一优选的实施方式中，上述脱细胞基质微粒产品包括如下质量百分比的助悬剂中的一种：透明质酸0.1-5.0％，胶原或明胶0.5-5.0％，羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素0.1-5.0％。

在本发明一优选的实施方式中，基于上述脱细胞基质微粒的总质量，脱细胞基质微粒由以下质量百分比的组分组成：非交联脱细胞基质微粒60-80％和低交联脱细胞基质微粒20-40％。

在本发明一优选的实施方式中，基于上述脱细胞基质微粒的总质量，脱细胞基质微粒由以下质量百分比的组分组成：非交联脱细胞基质微粒40-60％，低交联脱细胞基质微粒15-35％和高交联脱细胞基质微粒15-35％。

在本发明一优选的实施方式中，基于上述脱细胞基质微粒的总质量，脱细胞基质微粒由以下质量百分比的组分组成：非交联脱细胞基质微粒15-35％，低交联脱细胞基质微粒15-35％和高交联脱细胞基质微粒40-60％。

本发明一实施例提供了上述脱细胞基质微粒产品的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，低温匀浆制粒：提前将匀浆设备开起循环水降温；然后将剪碎的脱细胞基质、冰醋酸与纯化水加入料斗，起动匀浆设备，并打开下排阀收集料液；依据需要循环4-6次；根据需要将匀浆液过滤不同目数的筛网，得到浆料；

步骤二，调整pH：用1-10％NaOH溶液调节浆料的pH至4.0-8.0，得到浆料B，即非交联脱细胞基质微粒；

步骤三，交联：将气体分散头插入稀释后的浆料B底部，开启气体阀门，调节气体流量0.5-2.0升/分钟，搅拌；同时加入交联剂，边加边搅拌；交联剂加入完毕后继续通气体3-6分钟，继续交联，交联完成后用注射用水清洗得到低交联脱细胞基质微粒或高交联脱细胞基质微粒；

步骤四，混料：混合非交联脱细胞基质微粒、低交联脱细胞基质微粒，和/或高交联脱细胞基质微粒得到上述脱细胞基质微粒；

步骤五，配料：将上述脱细胞基质微粒、助悬剂和注射用水混合均匀，冻干、切割、分装、包装、灭菌得上述脱细胞基质微粒产品。

在本发明一优选的实施方式中，步骤一中的匀浆频率为10-22Hz。

在本发明一优选的实施方式中，步骤一中脱细胞基质和冰醋酸的质量比为(1.0-5.0)：(0.1-0.3)。

在本发明一优选的实施方式中，步骤三中的气体为氮气或氦气。

在本发明一优选的实施方式中，步骤三中，加入0.01-0.05％交联剂后继续交联12-24小时使得交联度为20-40％获得低交联脱细胞基质微粒。

在本发明一优选的实施方式中，步骤三中，加入交联剂并使得交联剂的终浓度为0.1-0.5％，继续交联4-12小时使得交联度为40-60％获得高交联脱细胞基质微粒。

在本发明一优选的实施方式中，交联剂选自戊二醛、甲醛、乙醛、1,4-丁烷二缩水甘油醚(BDDGE)、N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯、六亚甲基二异氰酸酯(HMDC)、氰胺、二苯基磷酰叠氮化物、京尼平中的一种。

在本发明一优选的实施方式中，步骤三中清洗所用的注射用水的质量是低交联脱细胞基质微粒或高交联脱细胞基质微粒质量的5-10倍，清洗的次数为15-20次，每次清洗20-30分钟。

在本发明一优选的实施方式中，步骤五中的灭菌采用环氧乙烷灭菌，或Co60或电子束辐照灭菌。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种脱细胞基质微粒(非交联、低交联度和高交联度)，其制备方法包括如下步骤：

1、脱细胞基质的制备：取动物组织，按照授权公告号为CN103191466 B的发明专利“制备人体或动物脱细胞组织的方法”披露的方法制备脱细胞基质(包括脱细胞真皮基质、脱细胞腹膜基质、脱细胞心包膜基质、脱细胞膀胱膜基质等)。

2、脱细胞基质微粒的制备：

2.1剪碎：将上述脱细胞基质(湿态)，剪成小碎片；

2.2低温匀浆制粒：

依据制备粒径的大小需求，选择不同的技术参数，先开起循环水降温；将已剪碎的碎片脱细胞基质，按照1.0-5.0％脱细胞基质(湿重)、0.1-0.3％冰醋酸与纯化水加入料斗，起动匀浆设备，依据需要选定频率10-22Hz；打开下排阀收集料液；依据需要循环4-6次；根据需要将匀浆液过滤不同目数的筛网滤除粗颗粒，得到浆料A；

2.3调整pH：浆料A，用1-10％NaOH溶液，调节pH至4.0-8.0；得浆料B1，即非交联脱细胞基质微粒；

2.4交联

浆料B1稀释一倍后，选择气体分散头，将气体分散头插入浆料底部，开气氮气或氦气等气体的阀门，调节流量0.5-2.0升/分钟，搅拌；同时加入交联剂(具体的交联剂如下表1)，边加边搅拌；交联剂加入完毕后继续通气体3-6分钟，关闭气体。按照下表1的时间继续交联得中间产品A(中间产品分别为：A2、A3)

表1交联剂的种类以及交联工艺的参数

注：采用三硝基苯肼法测定交联度。

2.5清洗

对中间产品A2或A3，用5-10倍(按质量计)的注射用水，清洗15-20次，每次清洗20-30分钟。清洗完成后适当沥干，得中间产品B2：低交联脱细胞基质微粒，或B3：高交联脱细胞基质微粒。

2.6固含量测定

取中间产品B1或B2或B3，进行固含量测定。

实施例2

本实施例提供一种用于真皮浅层组织填充与修复的脱细胞基质微粒产品，包括脱细胞基质微粒3.5％，助悬剂0.5％，余量为注射用水；

基于上述脱细胞基质微粒的总质量，脱细胞基质微粒由以下质量百分比的组分组成：B1 70％和B2 30％。

该脱细胞基质微粒产品的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按照上述质量百分比称取中间产品B1和B2混合均匀，得到中间产品C1；

步骤二，按照上述质量百分比称取中间产品C1、助悬剂和水，混合均匀，得中间产品D1；

步骤三，冻干：将中间产品D1，倒入冻干盘中，送入冻干机冻干，得中间产品E1；

步骤四，切割、分装、包装：将中间产品E1切割成适当的粒状，按照装入要求装入注射器中，将装好中间产品E1的注射器，放入包装盒中，得待灭菌产品；

步骤五，灭菌：选择环氧乙烷灭菌，得到最终产品；该产品的粒径分布图如图1所示，扫面电镜图如图2所示，呈分散的胶原蛋白纤维束状，纤维束直径普遍在500nm以下。

实施例3

本实施例提供一种用于真皮深层组织填充与修复的脱细胞基质微粒产品，包括脱细胞基质微粒6.5％，胶原3.5％，余量为注射用水；

基于上述脱细胞基质微粒的总质量，脱细胞基质微粒由以下质量百分比的组分组成：B1 50％、B2 25％和B3 25％。

该脱细胞基质微粒产品的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按照上述质量百分比称取中间产品B1、B2和B3混合均匀，得到中间产品C2；

步骤二，按照上述质量百分比称取中间产品C2、助悬剂和水，混合均匀，得中间产品D2；

步骤三，冻干：将中间产品D2，倒入冻干盘中，送入冻干机冻干，得中间产品E2；

步骤四，切割、分装、包装：将中间产品E2切割成适当的粒状，按照装入要求装入注射器中，将装好中间产品E2的注射器，放入包装盒中，得待灭菌产品；

步骤五，灭菌：选择Co60或电子束辐照灭菌进行灭菌得到最终产品；该产品的扫面电镜图如图3所示，呈分散的胶原蛋白纤维束状，纤维束直径普遍在500nm以下。

实施例4

本实施例提供一种用于真皮下组织填充与修复的脱细胞基质微粒产品，包括脱细胞基质微粒8.5％，助悬剂1.0％，余量为注射用水；

基于上述脱细胞基质微粒的总质量，脱细胞基质微粒由以下质量百分比的组分组成：B1 25％、B2 25％和B3 50％。

该脱细胞基质微粒产品的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按照上述质量百分比称取取中间产品B1、B2和B3混合均匀，得到中间产品C3；

步骤二，按照上述质量百分比称取中间产品C3、助悬剂和水，混合均匀，得中间产品D3；

步骤三，冻干：将中间产品D3，倒入冻干盘中，送入冻干机冻干，得中间产品E3；

步骤四，切割、分装、包装：将中间产品E3切割成适当的粒状，按照装入要求装入注射器中，将装好中间产品E3的注射器，放入包装盒中，得待灭菌产品；

步骤五，灭菌：选择环氧乙烷灭菌，得到最终产品；该产品的扫面电镜图如图4所示，呈分散的胶原蛋白纤维束状，纤维束直径普遍在500nm以下。

验证实施例

1.体外降解试验

分别取各实施例样品50mg块状，用纯水浸润，并排除所有空气。用滤纸除去多余的水，将浸水后的样品放入150ml具塞三角瓶中。瓶中已经装有100ml质量分数为1.0％胃蛋白酶(活力约为3000U/mg)的盐酸溶液(0.1mol/L)。在37℃±1℃条件下消化，直至完全消化，记录时间。重复三次，计算三次完全消化时间的平均值，结果如下表1。

2.大鼠植入降解试验

将样品切成规格1cm×1cm，灭菌。将所选SD大鼠，麻醉后，剔除背部被毛，碘酒消毒，手术沿脊柱切开皮肤，切口长约5cm，钝性分离皮下组织形成囊腔，充分止血后，在鼠脊柱两侧约2cm处等距离各选2个植入点，分别皮下植入样品，分离皮下组织与筋膜，缝合线缝合材料与皮下筋膜，最后缝合背部皮肤，创口用碘酒消毒。实验后连续3d每只大鼠注射青霉素50000U/(kg d)，以防感染。术后第2、4、6、8、10、20、22、24、26、28周取大鼠4只，颈椎脱臼处死，尽量分离皮下筋膜与材料，观察材料吸收情况，结果如下表2。

表2各实施例提供的脱细胞基质微粒产品的降解时间

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。