具体实施方式

在阐述本发明的具体实施方案之前，定义本文使用的术语如下：

术语“PDMS”是指：聚二甲基硅氧烷；

术语“CRP”是指：C反应蛋白；

术语“PCT”是指：降钙素原；

术语“IL-6”是指：白介素-6；

术语“SA”是指：链霉亲和素；

术语“B”是指：生物素；

术语“HRP”是指：辣根过氧化物酶；

术语“BSA”是指：牛血清白蛋白；

术语“PBST”是指：含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

参照图1～图4，为本发明的第一个实施例，该实施例提供了一种军用检测感染标志物的微流控芯片，其结构简单，方便多种标志物的联合检测。

一种军用检测感染标志物的微流控芯片，其包括连接组件200，连接组件200包括上阀架202，上阀架202下侧连接有下阀架201，上阀架202的前后两端经第一短销203和第二短销204将下阀架201连接在一起，上阀架202和下阀架201之间具有安装口，上阀架202和下阀架201上分别开有同轴心的上连接孔202a和下连接孔201a，上阀架202和下阀架201间连接有用于感染标志物检测的微流控反应组件100，微流控组件和连接组件200上连接有能在高度方向上移动的控制阀300，通过控制阀300使微流控组件内的各个溶液按照检测顺序进样。

进一步的，微流控反应组件100连接在上阀架202和下阀架201之间，微流控反应组件100包括从上往下连接在一起的上芯片本体102和下芯片本体101，上芯片本体102和下芯片本体101上分别开有上阀孔102d和下阀孔101b，上芯片本体102朝下的一端设有混合微通道102l且排布有若干储液池，混合微通道102l远离控制阀300一端的上芯片本体102朝下的一端设有检测微通道102k，检测微通道102k远离混合微通道102l一端的上芯片本体102上设有废液微通道102j，废液微通道102j远离混合微通道102l一端的上芯片本体102上开有负压接口，下芯片本体101朝上的一端设有废液池101a，废液微通道102j与废液池101a连通，检测微通道102k处的上芯片本体102和下芯片本体101之间连接有检测层103。

进一步的，控制阀300能下压依次穿过上连接孔202a、上阀孔102d、下阀孔101b和下连接孔201a，控制阀300和上芯片本体102、下芯片本体101之间为过盈配合，控制阀300能使不同的储液池与混合微通道102l连通。

进一步的，储液池的一端封闭，储液池另一端的上芯片本体102上设有进液通道102m，进液通道102m远离储液池的一端与上阀孔102d连通，控制阀300上设有在高度方向上间隔设置的若干与储液池一一对应的控制通道，控制通道的一端与对应的储液池连通，所有控制通道的另一端均能与混合微通道102l的首端连通，混合微通道102l能覆盖控制通道的另一端；上芯片本体102上排布有若干与储液池一一对应的正压接口，正压接口与对应的储液池连通。

进一步的，检测层103上包被有若干条捕获抗体的条带，捕获抗体条带呈直线且相互平行排布，捕获抗体条带的长度为10mm，宽度为400μm，间隔3mm，检测层103尺寸具体为，长10mm，宽8mm，厚0.1mm。

进一步的，通过大量实验得到最佳的混合微通道102l的形状及其尺寸参数，混合微通道102l由若干个半椭圆形微通道首尾相连组成，每个半椭圆长轴为5mm，短轴为3mm,宽度为400±5μm，深度为400±8μm；废液微通道102j为长17mm的直线微通道；使用CIMSOL软件对混合微通道102l中流体的混合效率进行了仿真，入口处设置浓度为0mol/L和1mol/L的两种溶液，在雷诺数分别为0.4、4、40的条件下模拟混合效果，若两种不同浓度的溶液可以混合为浓度均一的溶液，则说明混合微通道102l具有良好的混合能力，如图7所示，对不同的雷诺数，混合微通道102l的混合效率均在0.995以上，这说明无论是采用自动化仪器驱动还是手动控制，混合微通道102l可以在任意雷诺数下完成高效混合，这是本申请中的微流控芯片适用于如军事条件等复杂环境下的前提条件。

进一步的，控制阀300上设有两个下出液微通道301，两个下出液微通道301在相同高度上且分别与两个紧挨着的进液通道102m一一对应，下出液微通道301上方的控制阀300上设有至少一个上出液微通道302，上出液微通道302和下出液微通道301的一端均能与对应的进液通道102m连通，上出液微通道302和下出液微通道301的另一端均能与混合微通道102l连通；通过下压控制阀300与指定的储液池选定连通，实现溶液按照设定顺序依次混合反应；控制阀300上部的外侧设有指示键303，安装控制阀300时，指示键303与混合微通道102l一端所在位置对应。

上芯片本体102和下芯片本体101的材质为PDMS，可以采用光刻、一次性注射成型、模具制造等方法制作，方法均为行业内成熟方法；检测层103的材质为硅胶；本实施例中，储液池设置有四个，四个储液池分别为第一储液池102f、第二储液池102g、第三储液池102h和第四储液池102i，两个下出液通道能分别与第一储液池102f和第二储液池102g连通，下面的上出液通道能与第三储液池102h连通，上面的上出液通道能与第四储液池102i连通，四个正压接口分别为与第一储液池102f连通的第一正压接口102a、与第二储液池102g连通的第二正压接口102b、与第三储液池102h连通的第三正压接口102e和与第四储液池102i连通的第四正压接口102c。

实施例2

为本发明的第二个实施例，与第一个实施例的不同之处在于，该实施例提供了使用军用检测感染标志物的微流控芯片进行检测的方法，其包括以下步骤：

向第一储液池102f中加入抗原的标准溶液或是稀释后的血清样本；

向第二储液池102g中加入与HRP偶联的CRP、PCT检测抗体，与B偶联的IL-6检测抗体，与SA偶联的HRP；

向第三储液池102h中加入PBST洗涤液；

向第四储液池102i中加入化学发光底物；

下压控制阀300，使两个下出液微通道301分别与第一储液池102f和第二储液池102g连通，将第一个储液池和第二个储液池内的溶液抽入混合微通道102l，使抗原与检测抗体均匀混合，混合后的溶液进入检测微通道102k，静止孵育，检测层103上包被的捕获抗体特异性地吸附抗原，形成捕获抗体-抗原-检测抗体的三明治夹心结构；

将反应后的溶液抽入废液池101a；

下压控制阀300，使最下面的上出液微通道302与第三个储液池连通，将第三个储液池中的PBST洗涤液抽入混合微通道102l，将未参与反应的杂质冲进废液池101a；

继续下压控制阀300，使上面的上出液微通道302与第四个储液池连通，将第四个储液池中的化学发光底物抽入检测微通道102k，化学发光底物中的过氧化氢和HRP反应生成氧自由基，氧自由基氧化化学发光底物中的鲁米诺，产生化学发光；

将芯片放入化学发光检测仪器中曝光，检测微通道102k横向的直线条带与检测层103上包被的抗体条带构成发光点阵，测量得到各点的化学发光值，将它们的平均灰度值减去背景值即可用于样品浓度的计算。

实施例3

为本发明的第三个实施例，与第1和第2个实施例的不同之处在于，该实施例提供了装配微流控芯片的方法，其包括以下步骤：

将上芯片本体102和下芯片本体101清洗干净后放置于等离子清洗机中断开表面硅氧键，将检测层103放置于二者之间的指定位置，按压紧密，过程中需避免按压微通道；上芯片本体102和下芯片本体101紧密键合后，将下阀架201放置于下芯片本体101下侧，插入第一短销203和第二短销204，实现上阀架202和下阀架201的连接；最后插入控制阀300，指示键303对准混合微通道102l的入口处；各部件图片以及实物图如图5所示，如图6所示为芯片中各部位的尺寸表征图，可见制造误差极小，都在2％之内。

实施例4

为本发明的第四个实施例，与第1～3任一实施例的不同之处在于，该实施例提供了预处理微流控芯片的方法，其包括以下步骤：

将CRP、PCT和IL-6的捕获抗体溶液分别注入通道中，20min后用PBST洗液清洗微通道，去除未包被成功的捕获抗体，捕获抗体即包被在检测层103上；

在芯片组装完成后，向任一储液池内加入50μl 5％BSA溶液，将控制阀300上对应的出液微通道下压至对应储液池高度，将BSA溶液抽入微通道中，直至充满整个混合微通道102l和检测微通道102k，静止孵育15分钟，以封闭微通道以及检测层103上未封闭的空余位点，避免非特异性吸附，最后将BSA溶液全部抽入废液池101a中，将控制阀300恢复原位，完成微流控芯片的预处理。

实施例5

为本发明的第五个实施例，与第1～4任一实施例的不同之处在于，该实施例提供了联合检测CRP、PCT、IL-6的方法，其包括以下步骤：

在检测层1032上包被CRP、PCT、IL-6的捕获抗体各一条，CRP、PCT、IL-6三种感染标志物的捕获抗体包被时浓度分别为40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL；

对芯片进行组装与预处理之后，向第一储液池102f中加入30μL标准样品，其中CRP、PCT、IL-6各10μL；

向第二储液池102g中加入40μL与HRP偶联的CRP、PCT检测抗体、与B偶联的IL-6检测抗体、与SA偶联的HRP，其中四种溶液各10μL，最终浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、50μg/mL、4μg/mL；向第三储液池102h中加入50μL PBST洗涤液，向第四储液池102i中加入35μL化学发光底物；各项试剂即加载完成；

在负压接口处用软管连接负压蠕动泵或者注射器，可使用负压驱动芯片内的流体；

在第一正压接口102a、第二正压接口102b、第三正压接口102e和第四正压接口102c处用软管连接注射泵或者注射器，可使用正压驱动芯片内的流体；

将控制阀300下压至下出液微通道301与进液通道102m对齐的高度，使第一储液池102f和第二储液池102g中的溶液在混合微通道102l中充分混合，反应后流入检测微通道102k，静止孵育15分钟，使混合溶液在检测微通道102k中发生特异性吸附，形成双抗体夹心结构；

之后将微通道内所有液体吸入废液池101a；

下压控制阀300至下面的上出液微通道302与进液通道102m对齐的高度，使第三储液池102h中的PBST洗液进入微通道中，完成15秒的连续洗涤，直至所有PBST洗液进入废液池101a，将未参与反应的杂质冲进废液池101a；

继续下压控制阀300至上面的上出液微通道302与进液通道102m对齐的高度，使化学发光底物流入检测微通道102k，与HRP反应，随后流入废液池101a；

反应过程结束后，将芯片放入化学发光检测仪中曝光20s；

检测微通道102k的三条直线通道与硅胶板上三条捕获抗体带交叉，CRP、PCT、IL-6每种标志物各有三个检测点，共生成九个检测点，对图像进行处理，得到各点的化学发光值，将它们的平均灰度值减去背景值即可用于样品浓度的计算。

分别对0.16μg/mL、0.31μg/mL、0.63μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL这一范围内的CRP进行检测，结果如图10所示；对各点进行拟合，如图11所示，可得CRP在1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL这一范围内呈良好的线性关系。

分别对0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL、6.4ng/mL、12.8ng/mL、25.6ng/mL、51.2ng/mL这一范围内的PCT进行检测，结果如图10所示；对各点进行拟合，如图11所示，可得PCT在0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL、6.4ng/mL、12.8ng/mL这一范围内呈良好的线性关系。

分别对12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、400pg/mL、800pg/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL、6.4ng/mL这一范围内的IL-6进行检测，结果如图10所示；对各点进行拟合，如图11所示，可得IL-6在50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、400pg/mL、800pg/mL、1.6ng/mL这一范围内呈良好的线性关系。

从上可以看出，使用本发明中的微流控芯片和方法实现宽浓度范围的感染标志物三联检，对血清中浓度高的的CRP、PCT采用普通的化学发光方法，在检测抗体上偶联多个B，在SA上偶联多个HRP，B可以与多个SA结合，使检测抗体上可以结合更多的HRP，低浓度的IL-6即可产生很强的化学发光信号，以此进行信号放大，从而实现在一片芯片中对宽浓度范围的感染标志物进行联合检测；CRP、PCT、IL-6三种感染标志物联合检测的发光点阵如图12所示，每个标志物在一次检测中产生三个亮点，标志物浓度在线性范围内亮点均可准确读出，同种标志物的亮点之间信号强度均一，重复性好。。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。