一种丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物及其制备方法与应用 (Acrolein-formaldehyde-gamma-aminobutyric acid adduct and preparation method and application thereof ) 是由 宋媛 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物及其制备方法与应用,属于有机化合物合成和食品检测技术领域,所述丙烯醛、甲醛和γ-氨基丁酸的摩尔比为(1～2)：1：(1～10),以水作为溶剂,对丙烯醛、甲醛和γ-氨基丁酸持续加热进行反应,获得丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物,分子式为C-(11)H-(15)NO-(3),本发明所述方法操作简便,对丙烯醛和甲醛的消除效果显著,纯化产物的纯度和产率高。(The invention discloses an acrolein-formaldehyde-gamma-aminobutyric acid adduct and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of organic compound synthesis and food detection, wherein the molar ratio of the acrolein to the formaldehyde to the gamma-aminobutyric acid is (1-2): 1: (1-10), continuously heating acrolein, formaldehyde and gamma-aminobutyric acid to react by using water as a solvent to obtain an acrolein-formaldehyde-gamma-aminobutyric acid adduct with a molecular formula of C 11 H 15 NO 3 The method of the invention has simple operation, obvious elimination effect on acrolein and formaldehyde and high purity and yield of the purified product.)
技术领域
本发明涉及有机化合物合成和食品检测技术领域，特别是涉及一种丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物及其制备方法与应用。
背景技术
丙烯醛(Acr)是一种具有高毒性质的α，β-不饱和醛，其在小鼠和大鼠的LD50分别为30mg/kg和50mg/kg。外源性的丙烯醛主要产生于自然环境和食品加工过程，如森林火灾、染料燃烧、烘焙食品的美拉德反应和酒精饮料的酿造过程中均会产生丙烯醛；内源性丙烯醛主要通过脂质过氧化，氨基酸氧化及多胺氧化等多种途径自发生成，肠道微生物也可能是内源性丙烯醛形成的途径之一。丙烯醛作为一种强亲电子试剂，水溶性高，可以迅速穿过细胞膜，与谷胱甘肽、DNA、蛋白质等形成加合物，积累氧自由基，从而导致细胞膜破裂、线粒体功能障碍，甚至诱发基因突变，导致蛋白质交联、细胞坏死和凋亡，对呼吸系统、心血管系统、生殖系统、神经系统等造成不同程度的危害。大量研究已表明丙烯醛与肺癌、阿尔茨海默病、心血管疾病、动脉粥样硬化和脊髓损伤等多种病理状况有关。世界卫生组织对人体口服丙烯醛的可耐受最大摄入量设定为7.5μg/kg·bw/day。
甲醛(Formaldehyde，FA)是最活泼的脂肪醛，它既可以是由食品内源性产生，也可通过外源添加或环境污染存在于食品中。甲醛是细胞的代谢产物，所以甲醛广泛存在于人体中和各种动植物组织中。食品在加工或贮存过程中会发生美拉德反应和热降解反应生成甲醛，尤其是酒、面包等发酵性食品。甲醛已被国际癌症研究机构(IARC)列为第一类致癌物，是影响人类健康最危险的化学物质之一。甲醛不仅可与视紫红质的蛋白质中赖氨酸的胺官能团发生反应，而且还会与其他蛋白质(包括许多酶)中的氨基发生反应，影响酶的功能和生化代谢。
游离氨基酸普遍存在于各种食品中，有的氨基酸被广泛用于食品配料，如γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，属于新资源食品。它广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中，而谷物、茶叶、蔬菜等食品中含量较高，例如，在马铃薯中含量高达660mg/kg，仅次于天冬酰胺。GABA具有类似于谷氨酸甜味，能够增强食品风味。GABA在神经系统调节方面具有重要作用，例如可以促进神经元生长以及预防失眠、焦虑和抑郁。
目前甲醛的清除剂主要有氨基类、多酚类、天然提取成分和强氧化剂。其中，氨基类不仅具有良好清除效果，而且不易产生二次污染。另外，有研究表明，一些氨基酸能和丙烯醛形成加合物进而有效地清除丙烯醛，降低丙烯醛的细胞毒性，如半胱氨酸。但是，氨基酸是否能同时与丙烯醛和甲醛形成加合物从而同时清除这两种醛类尚未有人研究。
发明内容
不仅氨基酸是否能同时与丙烯醛和甲醛形成加合物从而同时清除这两种醛类尚未有人研究，而且，在没有标准品的条件下，无法对食品中的加合物进行检测，且形成的加合物的毒性也有待研究，而获得加合物标准品是进一步开发检测方法和进行毒理学研究的重要前提。因此，本发明主要解决如何获得高产率和高纯度的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的标准物的问题，提供一种丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物，分子式：C11H15NO3，分子量：209，结构式如下：
本发明提供所述的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的制备方法，包括以下步骤：以水作为溶剂，加入丙烯醛、甲醛和γ-氨基丁酸，加热进行反应。
进一步地，所述丙烯醛、甲醛和γ-氨基丁酸的摩尔比依次为(1～2)：1：(1～10)。
进一步地，所述加热温度为30～120℃，反应时间为30min～12h。优选加热温度为80℃，反应时间为4h。
进一步地，加热反应后还包括将反应后的体系减压浓缩，过滤，经反相硅胶柱层析法(ODS填料)分离纯化后得到丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物纯品。
反相硅胶层析法中：选用反相硅胶粉(ODS填料)，上样量1～3mL，以5％甲醇水等度洗脱，通过碘熏法显色法收集加合物，再由高效液相检测法检验纯度，收集洗脱液，得到纯化后的固体样品。
进一步地，所述丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物纯品的结构鉴定方法：将纯度大于99％的馏分，采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC法)对加合物纯品进行初步鉴定，获得一级、二级质谱；并采用高分辨质谱仪和核磁共振波谱仪分析加合物样品，获得精确相对分子质量和结构式。
取固体纯品溶于600μL重水中，采用Avance III光谱仪(600MHz Bruker BioSpin，瑞士)检测得到加合物纯品的NMR 1H、NMR 13C、Dept-135、HSQC、H,H COSY和HMBC核磁谱图。
进一步地，所述高分辨质谱仪离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描范围为m/z 50～1500。
进一步地，所述高效液相色谱串联质谱法中：
高效液相色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-Aq，4.6mm×250mm，5μm；流动相为水-乙腈，5:95，V/V，进样体积5μL，流速0.6mL/min，柱温40℃；检测波长267nm；
质谱条件：流动相为0.1％乙酸水和甲醇，95:5，V/V，进样体积0.1μL，流速0.4mL/min，柱温40℃，离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描范围为m/z 50～800；源温度为300℃，去溶剂化温度为250℃，毛细管电压为4000V，扫描速率为1000Da/sec，碰撞能量为15eV。
本发明提供所述的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物在同时消除丙烯醛和甲醛中的应用。
本发明提供所述的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物在食品检测领域的应用，以便对丙烯醛和甲醛的共同产物进行更快速地分析鉴定以及含量的检测。本发明公开了以下技术效果：
本发明制备得到的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物产率高、纯度高，纯度达到99％以上，能够用于丙烯醛和甲醛的同时消除，能够用于检测食品中丙烯醛和甲醛含量。在检测食品中丙烯醛和甲醛的过程中，通过快速定量检测食品中丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物含量，评估食品中丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的暴露水平，从而对此类食品的安全性进行较为全面的评价。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物的高效液相色谱图(HPLC图)；
图2为实施例1中γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的高效液相色谱图；
图3实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的紫外吸收光谱图；
图4实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的高分辨质谱图；
图5为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的一级质谱图(正离子模式)；
图6为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的二级质谱图(正离子模式)及主要碎片离子结构；
图7为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的13C NMR核磁谱图；
图8为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的Dept-135核磁谱图；
图9为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的1H NMR核磁谱图；
图10为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的HSQC-NMR谱图；
图11为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的H,HCOSY-NMR谱图；
图12为实施例1的γ-氨基丁酸与丙烯醛和甲醛形成的加合物纯化产物的HMBC-NMR谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
配制甲醛(FA)、丙烯醛(Acr)和γ-氨基丁酸(GABA)溶液：分别取10mL丙烯醛、甲醛和γ-氨基丁酸于100mL三角烧瓶中，反应摩尔比依次为1：2：1，在80℃下反应4h，得到丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物，纯度为62％。减压浓缩反应液后过滤膜，利用ODS硅胶层析柱分离纯化并冷冻干燥得到丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物纯化产物，产率为86％，纯度达到99％以上。
所述ODS硅胶层析柱法具体实施方法如下：
取350mL ODS硅胶粉浸泡于甲醇中并放置24h，将硅胶甲醇溶液装于层析柱(30×600mm)中，反应液经旋蒸浓缩并过滤膜后上样，流动相为5％甲醇和水，加压洗脱，利用碘熏法检测出含有加合物的馏分，利用HPLC法验证纯度后，将纯度大于99％的馏分浓缩并进行冷冻干燥(-40℃，90Pa，24h)后得到0.1g固定样品。
本实施例制备的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的表征结果如图1～12所示。
由HPLC图可知，产物的最大吸收波长为267nm，保留时间为6.6min。由一级质谱图中的[M+H]+m/z 210可以确定产物的相对分子量为209，由高分辨质谱仪进一步得到了产物的准确分子量为209.1125，分子式为C11H15NO3。由二级质谱图知，目标产物脱去一个羧基得到m/z＝164的碎片峰，说明加合物含有γ-氨基丁酸的一个羧基。m/z＝107的基峰是1-甲基-3-亚甲基-1,2,3,6-四氢吡啶环结构。由纯化后的目标产物的13C谱、1H谱和Dept-135谱图可知，产物含有6个亚甲基。氢谱中化学位移为δ9.41的峰信号与醛基上的氢原子相对应，δ5.83的峰信号与环内的碳碳双键的氢原子相对应，δ5.83和δ5.71这两组峰与环外的碳碳双键的氢原子相对应。加合物的二维核磁共振谱图信号关联情况如表1所示，可进一步确定本发明的加合物是由一分子γ-氨基丁酸、一分子甲醛和两分子丙烯醛反应并脱去两分子水得到，其结构为
本发明方法制备获得的加合物纯度高，重复性好，分离度高，可应用于食品检测领域，可以便更快速分析食品中丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的性能及含量。
表1丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的核磁信号归属
实施例2
配制GABA、Acr和FA溶液：分别各取10mL于100mL三角烧瓶中，按摩尔比1:2:1在37℃下反应12h。减压浓缩反应液后过滤膜，利用ODS硅胶层析柱分离纯化冷冻干燥后得到丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物，纯化、冷冻干燥过程同实施例1。该体系下生成的产物单一，易分离，丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的纯度达到98％以上。
实施例3
配制GABA、Acr和FA溶液：分别取2mL于10mL钢管中，按摩尔比1:2:1在120℃下反应30min，减压浓缩反应液后过滤膜，利用ODS硅胶层析柱分离纯化冷冻干燥后得到丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物，纯化、冷冻干燥过程同实施例1。该体系生成的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸目标加合物的纯度达到98％以上，反应时间大大缩短。
对比例1
制备方法同实施例1，不同之处仅在于，将反应时间调整为30min。
丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物产率为43％，纯化后的纯度为98％。反应时间缩短后，虽然加合物的纯度变化不大，但是生成的加合物含量很少，产率极低。
对比例2
制备方法同实施例1，不同之处仅在于，将反应时间调整为10h。
丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物产率为79％，纯化后的纯度为87％。反应时间过长，会产生其他的杂质，降低纯化后加合物的纯度，产率也降低了；且反应液过于浓稠，不易于柱层析的前处理。
对比例3
制备方法同实施例2，不同之处仅在于，将反应时间调整为0.2h。
丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物产率为36％，纯化后的纯度为90％。原理同对比例1。
对比例4
制备方法同实施例1，不同之处仅在于，将反应摩尔比调整至GABA：Acr：FA为5：5：1。
丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物产率为80％，纯化后的纯度为67％。摩尔比增大，GABA过量，不利于柱层析的纯化分离，得到的加合物纯度低。
对比例5
制备方法同实施例1，不同之处仅在于，将反应摩尔比调整至GABA：Acr：FA为10：1：2。
丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物产率为59％，纯化后的纯度为45％。GABA比例过高，不利于柱层析分离，导致纯度大幅降低，且没有保证丙烯醛过量，加合物产率降低。
应用实施例
将实施例1制备的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物作为标准物对食品中的加合物的含量进行检测。
加合物检测应用实施例1
S0.原料获取
从当地超市购买薯片，分别为乐事原味薯片、好丽友薯愿香烤原味薯片。
S1.标准曲线的制作
配制丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的标准系列溶液，质量浓度分别为1、5、10、50、100、500μg/kg，以产物峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，线性方程为y＝6348910x+6327.09，相关系数为0.9995。以此对本实验中的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物含量进行检测。
S2.加合物提取
取16g薯片于研钵中研碎，分别取5g于三个50mL的离心管中，再分别加入20mL甲醇，涡旋5min后10000rpm/min离心10min，重复以上操作三次，合并上清液约60mL，减压旋干溶剂后用5mL甲醇定容，过滤膜后待HPLC-MS/MS检测加合物的含量。
S3.HPLC-MS/MS对食品中加合物含量
采用HPLC-MS/MS中的MRM正离子模式，选用离子对分别是：210/124(定量离子对，碰撞能量20eV)；210/164(定性离子对，碰撞能量30eV)；210/192(定性离子对，碰撞能量38eV)，流动相：0.1％乙酸水/甲醇(70:30，V/V)，等度洗脱；流速0.4mL/min；进样量1μL。
最终测得乐事原味薯片中丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的含量为6μg/kg、好丽友薯愿香烤原味薯片中加合物的含量为25μg/kg。
加合物检测应用实施例2
S0.原料获取
从当地超市购买粗粮米卷，分别为21谷杂粮味糙米饼和101谷物活力棒。
S1.标准曲线的制作
配制丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的标准系列溶液，质量浓度分别为1、5、10、50、100、500μg/kg，以产物峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，线性方程为y＝6348910x+6327.09，相关系数为0.9995。以此对本实验中的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物含量进行检测。
S2.加合物提取
取16g粗粮米卷于研钵中研碎，分别取5g于三个50mL的离心管中，再分别加入20mL甲醇，涡旋5min后10000rpm/min离心10min，重复以上操作三次，合并上清液约60mL，减压旋干溶剂后用5mL甲醇定容，过滤膜后待HPLC-MS/MS检测加合物的含量。
S3.HPLC-MS/MS对食品中加合物含量
采用HPLC-MS/MS中的MRM正离子模式，选用离子对分别是：210/124(定量离子对，碰撞能量20eV)；210/164(定性离子对，碰撞能量30eV)；210/192(定性离子对，碰撞能量38eV)，流动相：0.1％乙酸水/甲醇(70:30，V/V)，等度洗脱；流速0.4mL/min；进样量1μL。
最终测得21谷杂粮味糙米饼中丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的含量为21μg/kg、101谷物活力棒中加合物的含量为23μg/kg。
加合物检测应用实施例3
S0.原料获取
从当地超市购买饼干，分别为字母牛奶饼干以及酵母梳打饼干。
S1.标准曲线的制作
配制丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的标准系列溶液，质量浓度分别为1、5、10、50、100、500μg/kg，以产物峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，线性方程为y＝6348910x+6327.09，相关系数为0.9995。以此对本应用实施例中的丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物含量进行检测。
S2.加合物提取
取16g饼干于研钵中研碎，分别取5g于三个50mL的离心管中，再分别加入20mL甲醇，涡旋5min后10000rpm/min离心10min，重复以上操作三次，合并上清液约60mL，减压旋干溶剂后用5mL甲醇定容，过滤膜后待HPLC-MS/MS检测加合物的含量。
S3.HPLC-MS/MS对食品中加合物含量
采用HPLC-MS/MS中的MRM正离子模式，选用离子对分别是：210/124(定量离子对，碰撞能量20eV)；210/164(定性离子对，碰撞能量30eV)；210/192(定性离子对，碰撞能量38eV)，流动相：0.1％乙酸水/甲醇(70:30，V/V)，等度洗脱；流速0.4mL/min；进样量1μL。
最终测得字母牛奶饼干中丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物的含量为48μg/kg、酵母梳打饼干中加合物的含量为62μg/kg。
由以上应用实施例可以看出本发明可快速定量检测食品中丙烯醛-甲醛-γ-氨基丁酸加合物含量。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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