二甲基亚砜在制备提高昆虫病原线虫产量制剂中的应用
阅读说明：本技术 二甲基亚砜在制备提高昆虫病原线虫产量制剂中的应用 (Application of dimethyl sulfoxide in preparation of preparation for improving yield of entomopathogenic nematodes ) 是由 谷星慧 王杰 屈玲 李江舟 曹莉 韩日畴 黄智华 崔永和 杨海林 刘珏廷 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了二甲基亚砜在制备提高昆虫病原线虫产量制剂中的应用。本发明发现,相比于PBS对照组,DMSO显著提高S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06感染期线虫产量。因此,可以将DMSO用于提高S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06感染期线虫产量,为获得商品化的昆虫病原线虫提供核心技术。(The invention discloses application of dimethyl sulfoxide in preparation of a preparation for improving the yield of entomopathogenic nematodes. The invention finds that the DMSO significantly improves the yield of S.carpocapsae All or H.bacteriophora H06 infected nematode compared to the PBS control group. Thus, DMSO can be used to increase nematode production during the s.carbopapsae All or h.bacteriophora H06 infection phase, providing a core technology for obtaining commercially available entomopathogenic nematodes.)
技术领域
本发明属于生物农药研发领域，具体涉及二甲基亚砜(DMSO)在制备提高昆虫病原线虫产量制剂中的应用。
背景技术
昆虫病原斯氏线虫属Steinernema和异小杆线虫属Heterorhabditis线虫是业已广泛用于防治农林、牧草、花卉和卫生等领域的害虫的天敌类杀虫制剂。这类线虫以3龄感染期虫态主动搜索寄主昆虫，对非靶标生物和环境安全，可规模化生产。昆虫病原线虫以感染期虫态随寄主食物或从昆虫的自然开口(如肛门、气门)、节间膜进入昆虫体内，随后释放肠腔中携带的Xenorhabdus属(与斯氏线虫Steinernema共生)或Photorhabdus属(与异小杆线虫Heterorhabditis共生)共生细菌致死昆虫。然后线虫利用共生细菌转化寄主体内的营养物质繁殖后代。
目前昆虫病原线虫培养方法主要有活体培养(In vivo)和离体培养(In vitro)。活体培养技术是利用昆虫寄主来培养昆虫病原线虫。离体培养主要包括固体培养和液体培养。固体培养是在含有海绵填充剂的培养基中加入单一共生细菌和无菌线虫构建的。液体培养主要是应用发酵罐系统培养昆虫病原线虫。不论是使用固体还是液体培养方法，昆虫病原线虫商业化培养的技术关键是如何获得高产量的线虫和降低线虫成本。
二甲基亚砜是一种即溶(DMSO)于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂，可作为农药的添加剂，同时也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。本发明发现，于线虫培养系统中添加二甲基亚砜有利于提高感染期线虫的产量。
发明内容
本发明的第一个目的是提供二甲基亚砜(DMSO)在制备提高昆虫病原线虫产量制剂中的应用。
本发明通过实验发现，于加入共生细菌的培养基中添加DMSO能提高昆虫病原线虫S.carpocapsae All和H.bacteriophora H06的产量。因此，本发明提供DMSO在制备提高昆虫病原线虫产量制剂中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种提高昆虫病原线虫产量的方法，即将DMSO添加到业已加入相应共生细菌的昆虫病原线虫的培养基中，线虫繁殖后获得更高的感染期线虫产量。
优选的，所述昆虫病原线虫是S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06。
优选的，所述DMSO的浓度是质量分数0.1％。
本发明发现，相比于PBS对照组，DMSO显著地提高S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06感染期线虫产量。因此，可以将DMSO用于提高S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06感染期线虫产量，获得具有成本优势的S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06线虫。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
一、实验材料
1、二甲基亚砜(DMSO)：将DMSO以无菌PBS稀释成质量分数为0.1％，采用0.22μm过滤器过滤除菌后使用。
二、实验方法
1、共生细菌单菌培养S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06线虫：将常规固体培养基培养的S.carpocapsae All或H.bacteriophora H06线虫经清洗后，用无菌PBS缓冲液洗涤三次后，以无菌PBS配制成10μl含50条感染期线虫(IJs)的浓度(5000IJs/mL)，装入250ml三角瓶中(装50ml线虫悬液)，置于9-13℃备用。
2、共生菌液的培养：以LB(121℃灭菌30min)于25℃，120rpm摇床中培养S.carpocapsae All线虫的共生细菌(Xenorhabdus nematophila All)使得菌液浓度OD600值为0.2。以LB(121℃灭菌30min)于25℃，120rpm摇床中培养H.bacteriophora H06线虫的共生细菌(Photorhabdus luminescens H06)使得菌液浓度OD600值为0.2。
3、线虫培养基制备：于无菌48孔板中，每个孔中加入0.3ml高压灭菌的强化营养肉汤培养基(LA：按质量分数计，包括1.6％营养肉汤，1％玉米油和1.2％琼脂，其余为纯净水)，冷却后使用。
4、共生细菌接种：于加入LA培养基的培养板中每孔加入20μL已培养好且无污染的共生菌溶液(X.nematophila All或P.luminescens H06)在28℃条件下培养3天。
5、感染期线虫接种和DMSO加入：于LA培养基且添加共生菌的情况下，以10μl的量加入约50条感染期线虫到孔中。含X.nematophila All的孔中加入S.carpocapsae All线虫。含P.luminescens H06的孔中加入H.bacteriophora H06线虫。再分别加入10μl0.1％DMSO溶液(均匀喷洒在整个孔中)。以加入等体积无菌PBS为对照。每个处理设置4个孔的重复。
6、线虫产量计数:将平板以封口膜封口后，放置25℃下黑暗培养。15天后，于平板中分批加入5ml无菌PBS，清洗其中的线虫到新的无菌平板中(直径＝9cm)，转移到15ml的离心管中进行定容和取样，混匀后取样计数感染期线虫数量和其它龄期线虫(如母虫、非感染期线虫)数量。
结果如表1和表2所示：
表1：DMSO对S.carpocapsae All感染期线虫产量(条数/孔)的影响(15天)
注：字母不同表示处理之间差异显著性(p＜0.05)。
表2：DMSO对H.bacteriophora H06感染期线虫产量(条数/孔)的影响(15天)
注：字母不同表示处理之间差异显著性(p＜0.05)。
从表1和表2可以看出，与无菌PBS对照组相比，DMSO能显著提升S.carpocapsaeAll线虫产量(比对照组提高约46％)和H.bacteriophora H06线虫产量(比对照组提高约80％)。
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