发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种具有提高和改善记忆作用的共发酵产物的乙醇提取物及其制备方法和应用，为阿尔茨海默症的药物治疗提供新的选择。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种具有提高和改善记忆作用的共发酵产物的乙醇提取物，该提取物是以灵芝、蛹虫草作为发酵菌株，以天麻为药性基质进行双向液体共培养发酵制备而成；蛹虫草菌株为B1528，菌株保藏号为：CCTCC NO：M 2019789，于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心保藏；灵芝菌种为B1.4，菌株保藏号为：CCTCC NO：M 2019790，于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心保藏。

上述的具有提高和改善记忆作用的共发酵产物乙醇提取物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)培养基制备：

菌种活化培养基：常规PDA培养基；

种子和发酵培养基制备：取土豆20g，洗净去皮切成小块放入锅中，加水100mL，煮沸10-15分钟，过滤，滤液加入蔗糖1.82g、蛋白胨3.00g、磷酸二氢钾0.09g、天麻粉3.00g，加热搅拌均匀，冷却后pH自然，121℃灭菌30min，备用；

初始液体培养基制备：取土豆20g，洗净去皮切成小块放入锅中，加水100mL，煮沸10-15分钟，过滤，滤液加入葡萄糖2g、天麻3g，加热搅拌均匀，冷却后，pH自然，121℃灭菌30min，备用；

(2)活化菌种：将灵芝菌种B1.4、蛹虫草菌种B1528分别转接于PDA平板上，25℃黑暗条件下培养7d，备用；

(3)制备种子液：无菌条件下，用打孔器从步骤(2)平板中打取直径5mm的活化灵芝菌种B1.4、蛹虫草菌种B1528，接入装有100mL的种子液培养基的500mL锥形瓶中，于200r/min、25℃的摇床培养箱中，黑暗条件下震荡培养5d，备用；

(4)液体发酵：取活化灵芝菌种B1.4和蛹虫草菌种B1528接种至初始液体培养基中，蛹虫草-灵芝接种比例为1:2，接种量3mL/100mL，轻轻摇匀后，放入恒温培养摇床中，200rpm/min、25℃黑暗培养15d，即得灵芝和蛹虫草共培养发酵天麻产物。

(5)发酵产物乙醇提取物的制备：将获得的发酵产物离心(10000rpm/10min)，得到固形物，在60℃下干燥固形物(6889.11g)，烘干后打粉(791.85g)，加入10倍体积95％乙醇，25℃浸渍24h，布氏漏斗过滤，残渣重复浸提一次，将提取液合并浓缩成浸膏(76.77g)，提取率为9.7％。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明利用中药的共培养发酵技术，提供了一种全新的利用灵芝和蛹虫草对天麻进行发酵的产物，该产物具有明显的改善记忆作用，可用于制备改善记忆力的保健品及治疗具有记忆障碍症状的疾病，如，阿尔茨海默症等的药物。具有良好的应用前景。

本发明采用响应面设计方法，获得最佳的发酵工艺条件，并以最佳发酵工艺条件获得的发酵产物的乙醇提取物给药学习记忆障碍模型大鼠，研究发酵产物的乙醇提取物对学习记忆障碍大鼠的影响。发现这种乙醇提取物具有显著的改善记忆的作用。本发明使用共培养发酵技术不仅提高了对药用菌和中药的利用，也为抗记忆障碍药物的研发提供了新的物质基础，具有重要理论和实践意义。

下面结合

具体实施方式

对本发明作进一步的说明。

一、灵芝蛹虫草共培养发酵天麻的工艺优化

1、实验条件

1.1菌种：灵芝Ganoderma Lucidum B1.4，菌株保藏号为：CCTCCm 2019790，于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心保藏；蛹虫草Cordycepsmilitaris B1528，菌株保藏号为：CCTCCm 2019789，于2019年10月9日在中国典型培养物保藏中心保藏。

1.2药材与试剂：

天麻—贵州达灵药业有限公司(批号181201)，虫草素对照品—上海源叶生物科技有限公司(批号Y02M6K1)，天麻素对照品—SIGMA(批号SLBN0006V)，齐墩果酸对照品—中国食品药品检定研究所(批号308D024)，乙腈色谱纯—美国天地(批号18075173)，无水乙醇—重庆川东化工(集团)有限公司(批号20181101)，甲醇色谱纯—天津市科密欧化学试剂公司(批号20180506)，硫酸—重庆川东化工(集团)有限公司(批号20160501)，乙酸乙酯—重庆江川化工有限公司(批号20170919)，冰醋酸—太仓沪试剂有限公司(批号2018425)，香草醛—天津市科密欧化学试剂公司(批号20170110)，高氯酸—天津市鑫源化工试剂公司(批号20180323)，娃哈哈纯净水—杭州娃哈哈集团有限公司(批号20180721)。

2、实验方法

2.1培养基制备：菌种活化：常规PDA培养基；种子液培养基：水100mL，土豆20g，葡萄糖2g，pH自然，121℃灭菌30min，备用；初始液体培养基：水100mL，土豆20g，葡萄糖2g，天麻3g，pH自然，121℃灭菌30min，备用。

2.2活化菌种：将灵芝菌种B1.4，蛹虫草菌种B1528分别转接于PDA平板上，25℃条件下黑暗培养7d，备用。

2.3制备种子液：无菌条件下，用打孔器从2.2的平皿中打取直径为5mm的活化菌种B1.4和B1528，接入装有100mL的种子液培养基的500mL锥形瓶中，于200r/min、25℃的摇床培养箱中，黑暗条件下，震荡培养5d，备用。

2.4液体发酵：取B1.4和B1528种子液各1.5mL，接种至初始液体培养基中，轻轻摇匀后，放入恒温培养摇床中，200rpm/min、25℃黑暗培养。每个条件设置3个平行样品。

2.5指标测定

2.5.1生物量的测定：取250mL发酵产物，10000r/min离心10min，弃上清液，收集菌丝体，电子天平称量。

2.5.2灵芝三萜(总三萜-甾醇)的测定

2.5.2.1灵芝三萜的提取方法：取2mL发酵产物至离心管中，加入50mL无水乙醇，震荡至充分混匀，超声45min后，4000rpm/min离心5min，取200μL上清液至试管中，70℃干燥，即得。

2.5.2.2灵芝三萜的含量测定：将2.5.2.1中得到的样品中精密加入200μL香草醛冰醋酸溶液(香草醛0.5g，冰醋酸定容至10mL)，高氯酸800μL，摇匀，70℃水浴15min后，立即冰浴冷却5min后，精密加入乙酸乙酯4mL，摇匀。利用紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，以无水乙醇为空白组进行测定。

2.5.3虫草素、天麻素的测定

2.5.3.1虫草素、天麻素的提取方法：取5mL发酵产物至离心管中，加入50％甲醇，定容至10mL，震荡至充分混匀，超声40min后，取1mL样品至1.5mLEP管，15000rpm/min离心5min，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.5.3.2虫草素、天麻素的含量测定

采用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵产物中虫草素、天麻素的含量。随着发酵时间的增加，未能在发酵产物提取物中检测出天麻素，这可能是在发酵过程中，天麻素被转化或分解，最终只检测发酵产物中虫草素的含量。

色谱条件：色谱柱：Agilent Poaris C18-A(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测波长：220nm；流速：1.0mL/min；流动相：0.05％磷酸溶液-乙腈(97：3)；进样量：10μL。

2.6单因素实验

2.6.1培养时间：发酵时间设定为10、12、14、16、18、20d，天麻3g，葡萄糖2g，土豆20g，水100mL。蛹虫草-灵芝接种比例为1:1(接种量3mL)，200rpm/min、25℃黑暗条件下培养，每个条件设置3个平行样品。在发酵的第10、12、14、16、18、20d对发酵产物中的生物量(湿重)、灵芝三萜、虫草素进行测定。

2.6.2蛹虫草灵芝接种比例：发酵时间15d，天麻3g，葡萄糖2g，土豆20g，水100mL。接种量3mL，蛹虫草-灵芝接种比例设定为4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4。200rpm/min、25℃黑暗条件下培养，每个条件设置3个平行样品。检测发酵产物中的生物量(湿重)、灵芝三萜、虫草素的含量。

2.6.3天麻添加量：发酵时间15d，天麻添加量设定为1g、2g、3g、4g，土豆20g，水100mL。蛹虫草-灵芝接种比例为1:2(接种量3mL)。200rpm/min、25℃黑暗条件下培养，每个条件设置3个平行样品。检测发酵产物中的生物量(湿重)、灵芝三萜、虫草素的含量。

2.6.4添加碳源：发酵时间15d，天麻3g，土豆20g，水100mL。设定低聚麦芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖四个因素为添加碳源，添加量2g。蛹虫草-灵芝接种比例为1:2(接种量3mL)。200rpm/min、25℃黑暗条件下培养，每个条件设置3个平行样品。检测发酵产物中的生物量(湿重)、灵芝三萜、虫草素的含量。

2.6.5添加氮源：发酵时间15d，天麻3g，蔗糖2g，土豆20g，水100mL。设定蛋白胨、酵母、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠六个因素为添加碳源，添加量2g。蛹虫草-灵芝接种比例为1:2(接种量3mL)。200rpm/min、25℃黑暗条件下培养，每个条件设置3个平行样品。检测发酵产物中的生物量(湿重)、灵芝三萜、虫草素的含量。

2.6.6添加无机盐：发酵时间15d，天麻3g，蔗糖2g，蛋白胨2g，土豆20g，水100mL。设定氯化钙、氯化铁、磷酸二氢钾、硫酸镁、硝酸钠、硫酸锌六个因素为添加碳源，添加量0.1g。蛹虫草-灵芝接种比例为1:2(接种量3mL)。200rpm/min、25℃黑暗条件下培养，每个条件设置3个平行样品。检测发酵产物中的生物量(湿重)、灵芝三萜、虫草素的含量。

2.7Box-Behnken实验：对筛选出的蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾的添加量为考察因素，根据Box-Behenken中心实验设计原理，在单因素实验的基础上，选取最优值为中心点，上下各选一个水平值作为响应面实验设计水平，以生物量、虫草素、灵芝三萜含量计算所得的综合评分为指标，设计三因素三水平的响应面分析(见表1-2)。采用DesignExpert.V8.0.6软件对实验数据进行响应面回归分析。

表1-2 Box-Behnken实验因素与水平

2.8验证实验：以发酵培养基优化后的配方进行验证实验，验证理论预测值与实验检测值是否相符，然后进行可靠性分析，得到最终优化配方。

3、实验结果

3.1培养时间：以培养温度25℃，摇床旋转200rpm/min，接种比例1:1(接种量3mL)为基本条件，当培养至第14d时，样品中虫草素含量达到高值，样品中灵芝三萜含量在培养第16d时达到高值(表1-3)。而样品的生物量，在培养第16d时达到高值。为获得较多的虫草素、灵芝三萜和生物量，故确定培养时间为15d以进行其他因素的实验。

表1-3时间因素对发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量的影响

3.2蛹虫草灵芝接种比例：以培养温度25℃，摇床旋转200rpm/min，发酵时间15d，接种量3mL为基本条件，蛹虫草-灵芝的接种比例对发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量的影响见表1-4。当两菌接种比例从4:1改变到1:2(灵芝接种量逐渐增加)时，发酵所得的生物量及灵芝三萜含量明显增加。当接种比例为4:1或3:1时，虫草素和灵芝三萜的含量较高，但显著影响菌丝体的生长。当灵芝接种量过多时，不利于两菌的生长，减少生物量的产生。综合考察，蛹虫草-灵芝接种比例1:2时适宜菌丝体的生长及代谢产物的合成与积累。

3.3天麻添加量：以培养温度25℃，摇床旋转200rpm/min，发酵时间15d，蛹虫草-灵芝接种比例1:2(接种量3mL)为基本条件，研究不同天麻添加量对发酵产生的影响，结果见表1-5。未添加天麻进行发酵时，发酵产物中虫草素和灵芝三萜的含量最低，当天麻的添加量从1g增加到3g时，发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量都明显增加，天麻添加量为3g时达到最高。当继续增加天麻的添加量，从3g增加到4g时，虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量呈下降趋势。因此，最适宜的天麻添加量为3g/100mL。

表1-4蛹虫草-灵芝接种比例对发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量的影响

表1-5天麻添加量对发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量的影响

3.4添加碳源：以培养温度25℃，摇床旋转200rpm/min，发酵时间15d，蛹虫草-灵芝接种比例1:2(接种量3mL)，天麻添加量3g/100mL为基本条件，分析不同碳源对发酵产物的影响，结果见表1-6。以蔗糖为添加碳源时，灵芝三萜含量以及生物量最高。以低聚麦芽糖或葡萄糖为添加碳源时，虫草素含量较高，但灵芝三萜含量及生物量较少；以可溶性淀粉为添加碳源时，虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量都较低。因此，考虑选择蔗糖作为添加碳源。

表1-6不同添加碳源对发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量的影响

3.5添加氮源：以培养温度25℃，摇床旋转200rpm/min，发酵时间15d，蛹虫草-灵芝接种比例1:2(接种量3mL)，天麻添加量3g/100mL，蔗糖2g/100mL为基本条件，研究不同氮源对发酵产物的影响，结果见表1-7。以蛋白胨为添加氮源时，发酵产物中的虫草素含量及生物量达到最高，灵芝三萜含量较高。以氯化铵为添加氮源时，发酵产物中的灵芝三萜含量达最高，但虫草素含量及生物量都较低。因此选择蛋白胨为添加氮源。

表1-7不同添加氮源对发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量的影响

3.6添加无机盐：以培养温度25℃，摇床旋转200rpm/min，发酵时间15d，蛹虫草-灵芝接种比例1:2(接种量3mL)，天麻添加量3g/100mL，蔗糖2g/100mL，蛋白胨2g/100mL为基本条件，以磷酸二氢钾为添加无机盐时，发酵产物中生物量达最高，虫草素含量及灵芝三萜含量较高(表1-8)。以硫酸镁为添加无机盐时，发酵产物中虫草素含量达最高，但灵芝三萜含量及生物量较低；以硫酸锌为添加无机盐时，发酵产物中灵芝三萜含量达最高，但虫草素含量为最低值，生物量也较少。综合考虑，以磷酸二氢钾为添加无机盐。

表1-8不同添加无机盐对发酵产物中虫草素含量、灵芝三萜含量以及生物量的影响

3.7Box-Behnken实验：在单因素实验的基础上，选择蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾的添加量为影响因素，分别以虫草素含量、灵芝三萜含量及生物量为评价指标，进行三因素三水平响应面分析实验，结果见表1-9。

表1-9 Box-Behnken实验因素与水平

表1-10回归模型方差分析结果(生物量)

注：R-Squared＝0.9389，Adj R-Squared＝0.8604，Adeq Precision＝11.917。

表1-11回归模型方差分析结果(虫草素)

注：R-Squared＝0.9281，Adj R-Squared＝0.8356，Adeq Precision＝9.782。

表1-12回归模型方差分析结果(灵芝三萜)

注：R-Squared＝0.9107，Adj R-Squared＝0.7960，Adeq Precision＝9.392。

利用Design Expert.V8.0.6软件对蔗糖(A)、蛋白胨(B)、磷酸二氢钾(C)三个因素对生物量(Y₁)、虫草素(Y₂)、灵芝三萜(Y₃)进行响应面分析，建立三元二次回归方程如下：

Y₁(生物量)＝-914.3+135.08A-41.77B-1066.18C+1.32AB+64.73AC-22.68BC-8.99A²+2.23B²-289.84C²；

Y₂(虫草素)＝-17017.92+815.42A+557.92B-19626.34C+53.06AB+465.63AC+107.58BC-100.23A²-108.28B²-5375.81C²；Y₃(灵芝三萜)＝-3074.65+450.34A-139.30B-3583.93C+4.24AB+215.78AC-75.61BC-29.88A²+7.51B²-974.46C²。

由表1-10、1-11、1-12的方差分析可以发现，回归模型P<0.05，表明回归模型达到显著水平，失拟项P(生物量)＝0.2594>0.05，P(虫草素)＝0.5207>0.05，P(灵芝三萜)＝0.2693>0.05，差异不显著，表明该未知因素对试验结果干扰较小，残差均由随机误差所引起。模型的相关系数R²(生物量)＝0.9389，R²(虫草素)＝0.9281，R²(灵芝三萜)＝0.9107，说明该模型拟合度较好，实验误差较小。

基于该模型，为确定各因素的最佳取值Y分别对A、B、C的偏导为零，对拟合出的二次方程求导，得出方程组，求解方程组，对结果四舍五入取整数得蔗糖(A)＝1.82、蛋白胨(B)＝3.00、磷酸二氢钾(C)＝0.09，结合单因素实验结果，得最佳培养条件和培养基组成为：蔗糖18.2g/L，蛋白胨30.0g/L，磷酸二氢钾0.9g/L，蛹虫草-灵芝接种比例为1:2(接种量30mL/L)，天麻添加量为30.0g/L，培养时间15d，在此优化条件下预测的生物量和虫草素、灵芝三萜产量分别为215.37g/L、1142mg/L、10.84mg/L。

3.8验证实验结果：为检验实验模型的可靠性，采用上述工艺条件进行发酵培养，考虑到实际操作的可行性，将实验条件定为蔗糖18.2g/L，蛋白胨30.0g/L，磷酸二氢钾0.9g/L，蛹虫草-灵芝接种比例为1:2，天麻添加量为30.0g/L，培养时间15d，培养温度25℃，摇床旋转200rpm/min，在此条件下，发酵产物的生物量为217.24g/L，虫草素产量为1114.14mg/L，灵芝三萜产量为10.77mg/L，与预测值基本一致，且较优化前生物量、虫草素以及灵芝三萜产量分别提高了76.14％、319.20％、13.49％。

4、讨论

本发明将蛹虫草与灵芝以共培养的方式进行液体发酵，这不同于以往的单菌双向发酵，两种药用真菌在共培养的过程中形成了稳定的互作关系，通过共培养，也提高了发酵产物中多种物质的含量，其原因是由于共培养系统中存在更为丰富的酶系统，再加上生物诱导效应利用了中间代谢物，使得生物量快速增长。利用真菌与真菌的相互作用进行共培养，可以调节生物活性代谢产物，诱导产生细胞外次级代谢产物，特别是酚类和醌类化合物，除此之外，还可以诱导不同酶的产生。培养条件也会影响微生物的代谢特征，在液体培养基中进行共培养发酵，不仅能够帮助发现新的次级代谢产物，还可以激活微生物的生产力，在本实验中除了共培养作用，添加药性基质天麻也影响了发酵产物中次级代谢产物的产量。本发明利用中药发酵技术对蛹虫草、灵芝和天麻进行发酵，得到了更多的虫草素和灵芝三萜，菌丝体的产量也得到了提高。

二、发酵产物对脂多糖致学习记忆障碍大鼠的影响

1、实验材料

1.1实验动物：SPF级雄性八周龄SD大鼠，80只，初始体重180-220g。由长沙天勤实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014。饲养室内的温度保持在20-25℃，昼夜交替时间为12h/12h，每日按时饲喂固体颗粒维持饲料和无菌水(高压灭菌)，保持饲养环境安静。

1.2实验药物：

天麻醇提组分制备：取天麻1500g，打粉，加入10倍体积95％乙醇，25℃浸渍24h，布氏漏斗过滤，残渣重复浸提一次，将提取液合并浓缩成浸膏(178.44g)，提取率为11.89％。

灵芝蛹虫草发酵产物乙醇提组分制备：将获得的发酵产物离心(10000rpm/10min)，得到固形物，在60℃下干燥固形物(2180g)，烘干后打粉(250.57g)，加入10倍体积95％乙醇，25℃浸渍24h，布氏漏斗过滤，残渣重复浸提一次，将提取液合并浓缩成浸膏(28.43g)，提取率为11.3％。

灵芝蛹虫草共培养发酵天麻产物的乙醇提组分制备：将获得的发酵产物离心(10000rpm/10min)，得到固形物，在60℃下干燥固形物(6889.11g)，烘干后打粉(791.85g)，加入10倍体积95％乙醇，25℃浸渍24h，布氏漏斗过滤，残渣重复浸提一次，将提取液合并浓缩成浸膏(76.77g)，提取率为9.7％。脑复康片(杭州民生药业有限公司717H016)，研磨成粉后，备用。

2、实验方法

2.1动物分组及给药：SPF级雄性SD大鼠80只，适应性喂养3天后，经Morris水迷宫实验(MWM)淘汰反应过于敏感(10s内找到平台)或过于迟钝(2min内未能找到平台)的大鼠，将选出的64只大鼠随机分为8组，每组8只，分别为：空白组(生理盐水)，模型组(生理盐水)，阳性对照组(脑复康片)(0.4g·kg^-1·d^-1)，天麻中剂量组(0.14g·kg^-1·d^-1)，灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组(0.13g·kg^-1·d^-1)，灵芝蛹虫草发酵天麻产物高剂量组(0.23g·kg^-1·d^-1)，灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组(0.12g·kg^-1·d^-1)，灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组(0.06g·kg^-1·d^-1)。

适应性喂养后，各组大鼠连续给于对应的药物28天，第22天开始，进行行为学测试，连续测试7天。行为学测试前半小时，采用脂多糖作为造模药，模型组，阳性对照组，天麻中剂量组，灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组，灵芝蛹虫草发酵天麻产物高剂量组，灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组及灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组腹腔注射脂多糖(250μg/kg)，空白组腹腔注射相应剂量生理盐水。在进行脂多糖腹腔注射前30分钟在各组中进行口服给药(灌胃)处理。

从第22天腹腔注射结束后，采用行为学测试(Morris水迷宫、避暗实验)测定大鼠学习记忆能力，并且每天观察药物治疗对各组大鼠的精神状态、体重变化、毛发光泽、饮食饮水等形态学变化。末次给药及动物行为学测试结束后2小时进行取材。

2.2morris水迷宫实验：灌水前将水迷宫清理干净，灌水深度以刚好淹没站台2cm左右，水温23-25℃。实验过程中保持摆放位置固定，保持室内安静，光线柔和，以摄像头能捕捉到老鼠的游泳轨迹为标准，并将整个水迷宫用黑色围帘包围，与外界隔离以排除干扰因素。

2.3避暗实验：各组大鼠均在避暗装置中适应5min，然后将大鼠面部背向洞口放入明室中，同时启动计时器、接通暗室电源，大鼠因嗜暗习性会进入暗室，但在暗室遭到电击后则会返回明室，进而获得在暗室内遭受电击刺激的记忆。记录各组大鼠的避暗潜伏期(即实验开始到第一次遭受电击的时间)以及5min内避暗错误次数(即5min内遭受电击次数)。

2.4动物取材：实验第28天，在做完Morris水迷宫实验及避暗实验检测2小时后，大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，于大鼠腹主动脉处取血，取血完成后，静置10min，然后分离血清(3000rpm，15min，4℃)，-80℃冻存，备用。麻醉取血后，开颅取脑，从脑组织中分离出海马，并将大鼠海马组织放入液氮保存，取材结束后，将海马组织放入-80℃冰柜中冻存，备用。

2.5酶联免疫吸附测定法检测大鼠血清中SOD、MDA、IL-6、IL-10的含量：从4℃冰箱中取出试剂盒，室温放置10min，在酶标板上设计标准品孔、空白孔、样品孔。加入准备好的样品、标准品，用封板胶盖住反应孔，置于37℃恒温箱中，反应1小时。洗板5次，拍干，加入酶标试剂，用封板胶盖住反应孔，置于37℃恒温箱中，反应30分钟。洗板5次，加入显色液用封板胶盖住反应孔，置于37℃恒温箱中，反应15分钟。加入终止液，15分钟内置于酶标仪中，测定吸光度值，并记录。

2.6实时荧光定量PCR法检测大鼠海马中IL-10、TNF-α、BDNF的表达

⑴RNA的提取：操作步骤按试剂盒说明进行，获得的RNA，取部分使用，其余-80℃保藏备用。

⑵逆转录反应

①在RNase-free的200μLEP管中配制如下混合液(表2-3)

表2-3逆转录反应体系

②将EP管内液体离心混匀并在42℃条件下孵育15min，85℃条件下孵育2min将Allin one逆转录酶失活，并在冰上冷却至室温，储存于-20℃条件下备用。

⑶实时荧光定量(qRT-PCR)检测

①将各引物管子瞬时离心，加入管子上面体积的三蒸水，充分混匀，再吸出10μL加入装有90μL三蒸水的EP管，放置-20℃保存。

②构建q-PCR体系(表2-4)

表2-4反应用量表

反应所需引物具体设计如表2-5。引物由Primer软件设计，并由上海生工生物有限公司合成。

表2-5待测mRNA引物序列

扩增程序：阶段1：预变性，95℃，5min，循环1次；阶段2：热溶解：95℃，15sec；60℃，30sec；72℃，30sec；循环40次；阶段3：溶解曲线：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；循环1次。

2.7数据处理：数据采用spss17.0进行统计分析，均数±标准差(X±S)表示；组间比较符合正态分布的数据采用单因素方差分析检验，若为非正态分布则采用秩和检验来比较两组间差异是否有统计学意义；以α＝0.05作为检验水准，以P<0.05认为差异有统计学意义，以P<0.01认为差异有显著统计学意义。

3、实验结果

3.1各组大鼠一般状态：实验期间，给药组大鼠精神状态良好，能够正常进水进食，活动自由，行为正常，毛发有光泽。模型组大鼠在注射脂多糖后期，精神萎靡，进水进食减少，行为倦怠，毛发无光泽，体重增长较为缓慢。其余各组大鼠的一般状态良好，实验中各组大鼠未出现死亡现象。

3.2发酵产物对大鼠体重的影响：实验大鼠经历给药、造模两个阶段，其体重平均值变化如表2-6所示。数据显示，给药后和造模后各组大鼠体重均有所增长。造模结束后，天麻中剂量组，灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组，灵芝蛹虫草发酵天麻产物高剂量组，灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组及灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组大鼠体重与空白组、阳性对照组大鼠体重无显著性差异；模型组大鼠体重增长缓慢，较空白组、阳性对照组低；天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高剂量组及灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组大鼠体重较模型组高。

表2-6灵芝蛹虫草发酵天麻产物对大鼠体重的影响(单位：g，X±S，n＝8)

注：与空白组比较^*P<0.05,^**P<0.01；与模型组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与阳性对照组比较^#P<0.05，^##P<0.01。

3.3morris水迷宫测试发酵产物对大鼠行为学的影响

与模型对照组比较，给药组的逃避潜伏期皆有缩短，空白组和阳性对照组第23、24天逃避潜伏期明显缩短，第25天到28天显著缩短；天麻中剂量组，第27、28天，逃避潜伏期显著缩短；灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组，第27、28天，逃避潜伏期明显缩短；灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组，第25、26天，逃避潜伏期明显缩短，第27、28天显著缩短；灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组，第25天起，逃避潜伏期有缩短趋势。与阳性对照组作比较，天麻中剂量组在第28天时，逃避潜伏期明显延长；灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组，第26天起，有延长趋势；灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组，逃避潜伏期没有明显差异；灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组第26天起，逃避潜伏期有延长趋势。

以上结果提示，灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组有改善脂多糖所致学习记忆障碍大鼠学习记忆的能力。

3.4避暗实验测试发酵产物对大鼠行为学的影响

本实验对大鼠进行了7天的测试，实验结果见表2-7。

表2-7避暗实验测试灵芝蛹虫草发酵天麻产物对大鼠行为学的影响(X±S，n＝8)

注：与空白组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与阳性对照组比较^#P<0.05，^##P<0.01。

与空白组相比，模型组避暗潜伏期缩短，避暗错误次数增多，表明造模成功；天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、低剂量组避暗潜伏期缩短，避暗错误次数增多；阳性对照组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组，避暗潜伏期略延长，避暗错误次数略增多，差异无统计学意义；与模型组相比，各组大鼠避暗潜伏期延长，避暗错误次数减少；与阳性对照组比较，天麻中剂量组，避暗潜伏期缩短，避暗错误次数增多；灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组，避暗潜伏期缩短，避暗错误次数增多；灵芝蛹虫草发酵天麻产物高剂量组，避暗潜伏期缩短，避暗错误次数略增多；灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组，避暗潜伏期略缩短，避暗错误次数略增多，差异无统计学意义；灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组，避暗潜伏期缩短，避暗错误次数略增多。

上述避暗实验结果表明，灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组的干预提高了脂多糖所致学习记忆障碍大鼠学习记忆的能力。

3.5大鼠血清中SOD、MDA、IL-6、IL-10的含量变化

3.5.1大鼠血清中SOD、MDA的含量变化：见表2-8。与空白组相比，模型组大鼠SOD含量显著减少，说明造模成功；与模型组相比较，阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组SOD含量显著增加；灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组SOD含量增加。与阳性对照组相比，天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中、低剂量组大鼠SOD含量显著减少。

与空白组相比，模型组大鼠MDA含量显著增加，说明造模成功；与模型组相比，阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组大鼠MDA含量显著减少。与阳性对照组相比，天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物低剂量组大鼠MDA含量显著增加；灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组大鼠MDA含量增加。

表2-8大鼠血清中SOD、MDA的含量(X±S，n＝8)

注：与空白组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与阳性对照组比较^#P<0.05，^##P<0.01。

3.5.2大鼠血清中IL-6、IL-10的含量变化：见表2-9。与空白组相比，模型组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、低剂量组大鼠IL-6含量显著增加；灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组大鼠IL-6含量增加。与模型组相比，阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中、低剂量组大鼠IL-6含量显著减少。与阳性对照组相比，天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、低剂量组大鼠IL-6含量显著增加。

与空白组相比，模型组、阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中、低剂量组大鼠IL-10含量显著减少。与模型组相比，阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组大鼠IL-10含量显著增加；灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组大鼠IL-10含量增加。与阳性对照组比较，天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、低剂量组大鼠IL-10含量显著减少(；灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组大鼠IL-10含量减少。

表2-9大鼠血清中IL-6、IL-10的含量(X±S，n＝8)

注：与空白组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与阳性对照组比较^#P<0.05，^##P<0.01。

3.6大鼠海马中TNF-α、BDNFmRNA表达水平：见表2-10。与空白组相比，模型组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、低剂量组TNF-αmRNA表达水平显著升高；天麻中剂量组TNF-αmRNA表达水平升高。与模型组相比，阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中、低剂量组大鼠TNF-αmRNA表达水平显著降低。与阳性对照组相比，天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组大鼠TNF-αmRNA表达水平略升高，差异无统计学意义；灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、低剂量组大鼠TNF-αmRNA表达水平显著升高。

与空白组相比，模型组、阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中、低剂量组BDNFmRNA表达水平显著降低。与模型组相比，阳性对照组、天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中、低剂量组BDNFmRNA表达水平显著升高。与阳性对照组相比，天麻中剂量组、灵芝蛹虫草发酵产物中剂量组、灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、低剂量组BDNFmRNA表达水平显著降低；灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组BDNFmRNA表达水平略降低，差异无统计学意义。

表2-10大鼠海马中TNF-α、BDNFmRNA表达水平(X±S，n＝8)

注：与空白组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与模型组比较^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与阳性对照组比较^#P<0.05，^##P<0.01。

4、结论

进行药物干预后，可以改善模型大鼠精神萎靡、食欲不振、体重减轻的症状。

在Morris水迷宫实验中，灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组能够显著缩短实验动物的逃避潜伏期(P<0.01)。避暗实验中，给药组避暗潜伏期均有所增加、记忆错误次数减少，以灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组作用最明显。

灵芝蛹虫草发酵天麻产物高、中剂量组均可以减少实验大鼠血清中MDA的含量(P<0.01)，以中剂量的效果最明显。灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量可以降低模型大鼠IL-6含量的作用(P<0.01)。提高实验大鼠血清中IL-10的含量(P<0.01)，以中剂量组的效果最明显。

实时荧光定量PCR技术对实验大鼠海马中TNF-α、BDNFmRNA的表达检测结果表明，灵芝蛹虫草发酵天麻产物中剂量组可以通过降低学习记忆障碍模型大鼠TNF-αmRNA的表达水平、升高模型大鼠BDNFmRNA的表达水平，从而起到改善脂多糖致学习记忆障碍大鼠的作用。