一种水母提取物的制备方法
阅读说明：本技术 一种水母提取物的制备方法 (Preparation method of jellyfish extract ) 是由 林润暄 陈钰淇 林灼华 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本申请公开一种水母提取物的制备方法,包括以下步骤：(1)取洗净后的水母触手,组织匀浆,冷冻干燥得到冻干粉；(2)将冻干粉和水混合,搅拌,分散均匀得到分散液；(3)调节分散液的pH至7.5～8.0,升温至45～50℃,加入胰蛋白酶,搅拌使之酶解,酶解后使酶失活；(4)向酶解后的分散液中乙醇和氯化钠,搅拌,在20～25℃下保温60～120s,离心取滤液；(5)取离心后的滤液,加入EDTA二钠,搅拌反应除重金属；(6)过滤：将去重金属后的滤液用0.5μm滤膜真空抽滤,取滤液；(7)浓缩、干燥,过程控温、控量等,具有抑制ACE的优点。(The application discloses a preparation method of a jellyfish extract, which comprises the following steps: (1) taking the cleaned jellyfish to touch hands, homogenizing tissues, and freeze-drying to obtain freeze-dried powder; (2) mixing the freeze-dried powder and water, stirring, and uniformly dispersing to obtain a dispersion liquid; (3) adjusting the pH value of the dispersion liquid to 7.5-8.0, heating to 45-50 ℃, adding trypsin, stirring for enzymolysis, and inactivating enzyme after enzymolysis; (4) adding ethanol and sodium chloride into the dispersion liquid after enzymolysis, stirring, preserving the heat for 60-120 s at 20-25 ℃, and centrifuging to obtain filtrate; (5) adding EDTA disodium into the centrifuged filtrate, and stirring to react to remove heavy metals; (6) and (3) filtering: vacuum filtering the filtrate with 0.5 μm filter membrane to obtain filtrate; (7) concentration, drying, temperature control and quantity control in the process and the like, and has the advantage of inhibiting ACE.)
技术领域
本发明涉及一种水母提取物的制备方法。
背景技术
白色霞水母俗称：麻蛰、海蜇。白色霞水母(Cyanea nozakii Kishinouye)隶属于腔肠动物门，刺胞亚门(Coelenterata)，钵水母纲(Class Scyphomedusae)，旗口水母目(Semaeostomeae)，霞水母科(Cyaneidae)，霞水母属，是一类海洋大型浮游动物。白色霞水母的资源丰富、分布范围广，是中国沿海大陆架地区大型水母中的优势种群。
目前国内外关于霞水母的研究主要集中在霞水母的形态结构、生长规律、渔业生态学及对海洋渔业资源的危害等方面。而有关霞水母药用价值的研究主要集中于水母毒素方面，霞水母中富含胶原蛋白，但一直以来仅以初加工食品为主，市场上仅见有食品类的即食产品，未见有下游深加工产品的开发。
因此，研发出一款水母提取物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种水母提取物的制备方法，具有抑制ACE的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种水母提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取洗净后的水母触手，组织匀浆，冷冻干燥得到冻干粉；
(2)将冻干粉和水混合，搅拌，分散均匀得到分散液；冻干粉和水的投入质量比为1:8～12；
(3)调节分散液的pH至7.5～8.0，升温至45～50℃，加入胰蛋白酶，搅拌使之酶解，酶解时间为1.5～2.5hr，酶解后升温至95～100℃并保温12～20min使酶失活；分散液和胰蛋白酶的质量比为100:0.4～0.6；
(4)向酶解后的分散液中乙醇和氯化钠，搅拌，在20～25℃下保温60～120s，离心取滤液；分散液、乙醇和氯化钠的质量比为1:0.04～0.06:0.002～0.004；
(5)取离心后的滤液，加入EDTA二钠，搅拌反应除重金属；离心后的滤液和EDTA二钠的质量比为100:0.01～0.03；
(6)过滤：将去重金属后的滤液用0.5μm滤膜真空抽滤，取滤液；
(7)浓缩、干燥。
优选的，水母选用白色霞水母；步骤(3)包括以下两个部分：
①调节分散液的pH至7.5～8.0，升温至45～50℃，加入胰蛋白酶，搅拌使之酶解，酶解时间为1.5～2.5hr，酶解后升温至95～100℃并保温12～20min使酶失活；分散液和胰蛋白酶的质量比为100:0.4～0.6；
②调节分散液的pH至6.8～7.2，升温至38～42℃，加入脂肪酶，搅拌使之酶解，酶解时间为2～4hr，酶解后升温至85～95℃并保温4～5min使酶失活；分散液和脂肪酶的质量比为100:0.1～0.3。
优选的，步骤(2)还增加有碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素，冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素和水的投入质量比为1:0.02～0.03:0.04～0.05:0.01～0.03:8～12。
优选的，步骤(5)中，除了向滤液中加入EDTA二钠外，步骤(5)中还添加有微晶纤维素和乙酸乙酯；步骤(5)中，离心后的滤液、EDTA二钠、微晶纤维素和乙酸乙酯的质量比为100:0.01～0.03:0.07～0.09:10～12。
优选的，步骤(6)除了抽滤外，还将滤液进行以下处理：将抽滤后得到的滤液和氯化钙按质量比1:0.06～0.10混合，用醋酸调节pH至6.5～7.0，在40～45℃下搅拌反应40～50min。
优选的，包括以下步骤：
(1)取洗净后的白色霞水母触手，组织匀浆，冷冻干燥得到冻干粉；
(2)将冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素和水混合，搅拌，分散均匀得到分散液；冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素和水的投入质量比为1:0.02:0.04:0.02:10；
(3)酶解：
①调节分散液的pH至7.8，升温至45℃，加入胰蛋白酶，搅拌使之酶解，酶解时间为2.0hr，酶解后升温至100℃并保温15min使酶失活；分散液和胰蛋白酶的质量比为100:0.5；
②调节分散液的pH至7.0，升温至40℃，加入脂肪酶，搅拌使之酶解，酶解时间为3hr，酶解后升温至90℃并保温5min使酶失活；分散液和脂肪酶的质量比为100:0.2；
(4)向酶解后的分散液中乙醇和氯化钠，搅拌，在25℃下保温90s，离心取滤液；分散液、乙醇和氯化钠的质量比为1:0.05:0.003；
(5)取离心后的滤液，加入EDTA二钠、微晶纤维素和乙酸乙酯，搅拌反应除重金属；离心后的滤液、EDTA二钠、微晶纤维素和乙酸乙酯的质量比为100:0.02:0.08:10；
(6)过滤：将去重金属后的滤液用0.5μm滤膜真空抽滤，取滤液；将抽滤后得到的滤液和氯化钙按质量比1:0.08混合，用醋酸调节pH至6.8，在42℃下搅拌反应45min；
(7)真空浓缩至固含量为50wt％，喷雾干燥。
本发明技术效果主要体现在以下方面：
白色霞水母中富含胶原蛋白，通过本申请的方式来获得小分子肽类物质，能有效抑制血管紧张素转化酶(ACE)，从而达到降低血压的作用，且因来源于食物，安全性高；
在处理过程中利用EDTA二钠进行重金属处理，降低产品中重金属含量，提高食品安全性；在处理过程中由于重金属的存在，过程中的多肽和重金属存在螯合的可能性，从而导致产品中存在螯合的重金属，利用碳酸氢钙在碱性条件下和重金属的作用推动、并结合微晶纤维素对其分散和螯合的阻碍，从而减少重金属和多肽的螯合，使重金属处于游离态，以便其与EDTA二钠作用，提高重金属去除效果，也减少多肽的损失；
在酶解后得到的酶解液中乳化稳定性较好，分离不理想，影响分离时间和产品质量，在本申请中通过脂肪酶酶解脂肪，破坏蛋白质和脂肪相互作用，降低乳液的稳定性，从而使得油水分离，并通过乙酸乙酯和微晶纤维素的作用，提高分离效果，加快工艺进程，提高蛋白回收率；
在酶解后通过乙醇沉降、将过滤液和氯化钙螯合作用，提高产品的稳定性，适于室温保存。
具体实施方式
实施例1：一种水母提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取洗净后的白色霞水母触手，组织匀浆，冷冻干燥得到冻干粉；
(2)将冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素和水混合，搅拌，分散均匀得到分散液；冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素和水的投入质量比为1:0.02:0.04:0.02:10；
(3)酶解：
①调节分散液的pH至7.8，升温至45℃，加入胰蛋白酶，搅拌使之酶解，酶解时间为2.0hr，酶解后升温至100℃并保温15min使酶失活；分散液和胰蛋白酶的质量比为100:0.5；
②调节分散液的pH至7.0，升温至40℃，加入脂肪酶，搅拌使之酶解，酶解时间为3hr，酶解后升温至90℃并保温5min使酶失活；分散液和脂肪酶的质量比为100:0.2；
(4)向酶解后的分散液中乙醇和氯化钠，搅拌，在25℃下保温90s，离心取滤液；分散液、乙醇和氯化钠的质量比为1:0.05:0.003；
(5)取离心后的滤液，加入EDTA二钠、微晶纤维素和乙酸乙酯，搅拌反应除重金属；离心后的滤液、EDTA二钠、微晶纤维素和乙酸乙酯的质量比为100:0.02:0.08:10；
(6)过滤：将去重金属后的滤液用0.5μm滤膜真空抽滤，取滤液；将抽滤后得到的滤液和氯化钙按质量比1:0.08混合，用醋酸调节pH至6.8，在42℃下搅拌反应45min；
(7)真空浓缩至固含量为50wt％，喷雾干燥。
实施例2：步骤(2)对水母提取物的制备方法的影响
测试对象：实施例1、对照组1-4。
对照组1：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(2)中，冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素和水的投入质量比为1:0.03:0.05:0.03:10。
对照组2：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(2)中冻干粉中未添加碳酸二氢钙、碳酸氢钠或微晶纤维素，仅添加水且冻干粉和水的投入质量比为1:10。
对照组3：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(2)中冻干粉中未添加微晶纤维素，冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠和水的投入质量比为1:0.02:0.04:10。
对照组4：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(2)中，冻干粉、碳酸二氢钙、碳酸氢钠、微晶纤维素和水的投入质量比为1:0.05:0.07:0.06:10。
测试内容：分别对测试对象进行粗蛋白的测定以及铅、镉、铬这三类重金属总量的测定。
粗蛋白的测定：凯氏定氮法测定，标准为GB5009.5-2010。蛋白回收率(％)＝产品蛋白含量×100％/原料蛋白含量，产品蛋白含量即步骤(7)喷雾干燥后得到的产品中的蛋白含量，而原料蛋白含量则为步骤(1)获得的冻干的蛋白含量。
重金属测定：参照GB15618-1995，测试对象为步骤(7)喷雾干燥后得到的产品。
测试结果如表1所示。表1显示：按实施例1和对照组1的步骤(2)进行，蛋白回收率高，重金属含量低，实施例1为最佳。
表1
实施例3：步骤(3)和步骤(5)的影响
测试对象：实施例1、对照组5-7。
对照组5：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(3)酶解步仅包括以下一个部分：调节分散液的pH至7.8，升温至45℃，加入胰蛋白酶，搅拌使之酶解，酶解时间为2.0hr，酶解后升温至100℃并保温15min使酶失活；分散液和胰蛋白酶的质量比为100:0.5。
对照组6：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(3)包括：
①调节分散液的pH至7.0，升温至52℃，加入中性蛋白酶，搅拌使之酶解，酶解时间为6hr，酶解后升温至80℃并保温10min使酶失活；分散液和中性蛋白酶的质量比为100:0.3；
②调节分散液的pH至7.0，升温至40℃，加入脂肪酶，搅拌使之酶解，酶解时间为3hr，酶解后升温至90℃并保温5min使酶失活；分散液和脂肪酶的质量比为100:0.2。
对照组7：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(5)向离心后的滤液中仅添加EDTA二钠，未添加微晶纤维素或乙酸乙酯。
测试内容：分别对测试对象进行抽真空过滤耗时的测定，即取1kg步骤(5)处理后的滤液，用0.5μm滤膜真空抽滤，抽滤压强为0.1MPa抽滤温度为25℃，从开始抽滤起计时，至滤液全滤过，记录总耗时。
粗蛋白的测定：凯氏定氮法测定，标准为GB5009.5-2010。蛋白回收率(％)＝产品蛋白含量×100％/原料蛋白含量，产品蛋白含量即步骤(7)喷雾干燥后得到的产品中的蛋白含量，而原料蛋白含量则为步骤(1)获得的冻干粉的蛋白含量。
测试结果如表2所示。表2显示，相比在步骤(3)中未进行二步处理的对照组5和①中用中性蛋白酶处理的对照组6，本申请的实施例1抽真空过滤耗时更快，蛋白回收率更高；相比在步骤(5)中未添加乙酸乙酯或微晶纤维素的对照组7，本申请的实施例1抽真空过滤耗时更快，蛋白回收率更高。
表2
抽真空过滤耗时(min)
蛋白回收率(％)
实施例1
7
74.3
对照组5
56
51.0
对照组6
31
50.3
对照组7
36
47.5
实施例4：ACE活性测试
测试对象：实施例1、对照组8-9、对照组6。
对照组8：参照实施例1，与实施例1的区别在于，未设置步骤(4)。
对照组9：参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤(6)仅包括过滤：将去重金属后的滤液用0.5μm滤膜真空抽滤，取滤液。
ACE抑制率的测定：取测试对象，溶于0.1mol/L硼酸缓冲液(pH＝8.3,含0.3mol/LNaCl)制成相应的样品供试液。HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)、ACE(血管紧张素转化酶)分别用0.1mol/L硼酸缓冲液(pH＝8.3,含0.3mol/L NaCl)配成5mmol/L HHL溶液和100Mu/mLACE溶液。取30μl HHL与10μl样品供试液(空白组采用硼酸缓冲溶液代替样品供试液)混匀后，置于37℃下预热5min，之后加入20μl的ACE溶液启动反应，混匀，置于37℃下反应1hr，迅速加入70μl 1mol/L HCl终止反应，用高效液相色谱仪分析结果。
色谱条件：Xbridge-C18柱(4.6×250mm，5μm，美国water公司)；流动相：A为0.05％三氟乙酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件：0～30min、B流动相10～60％(体积)，流速0.8mL/min；检测波长228nm；柱温30℃；进样量10μl。
将样品密封保存在玻璃瓶内，分别放置在0℃、25℃下60d，进行ACE抑制率测试。
表3
当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
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