一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料及其制备方法与应用 (Intramolecular cross-linking self-assembled membrane modified spinning nanofiber material and preparation method and application thereof ) 是由 赵名艳 高翔 黄瑞 楚佳奇 龚帆 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料及其制备方法与应用。该分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料的制备方法如下：S1.对透明质酸进行巯基化修饰；S2.壳聚糖的马来酰化改性；S3.聚电解质溶液的制备；S4.静电纺丝法制备纳米纤维；S5.纳米纤维层层自组装(LBL)表面功能化。本发明提供的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料具有良好的抗菌和保湿性能,并具有较好的组织粘附性；其可作为水溶性药物及生物活性因子的稳定、高效缓释载体,适用于在组织再生修复中的应用,尤其是糖尿病患者皮肤修复领域。(The invention relates to an intramolecular cross-linking self-assembled membrane modified spinning nanofiber material and a preparation method and application thereof. The preparation method of the intramolecular cross-linking self-assembly membrane modified spinning nanofiber material comprises the following steps: s1, carrying out sulfhydrylation modification on hyaluronic acid; s2, maleylation modification of chitosan; s3, preparing a polyelectrolyte solution; s4, preparing the nano fibers by an electrostatic spinning method; s5, performing layer-by-layer self-assembly (LBL) surface functionalization on the nanofiber. The intramolecular cross-linking self-assembly film modified spinning nanofiber material provided by the invention has good antibacterial and moisturizing performances and good tissue adhesion; it can be used as stable and high-efficiency slow-release carrier of water-soluble medicine and bioactive factor, and is suitable for application in tissue regeneration and repair, especially in the field of skin repair of diabetic patients.)
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料及其制备方法与应用。
背景技术
在糖尿病(DM)患者中，伤口愈合不良是影响患者健康的主要问题，也是世界范围内的关键临床挑战。随着对伤口愈合过程理解的深入，基于生物材料的伤口敷料经常被用于促进创面愈合。从病理生理上讲，伤口愈合是一个非常复杂的过程，包括细胞生长、血管生成和细胞外基质(ECM)沉积。因此，理想的伤口敷料不仅应该能够提供物理保护和抵抗微生物的渗透和繁殖，而且还应该为伤口界面处的愈合提供最佳微环境。尤其是上皮和血管再生能力有限的糖尿病足溃疡的皮肤创面等一些慢性创面，对生物活性敷料的需求日益迫切和必要。
近年来，静电纺丝纳米纤维因其独特的结构，如高比表面积、高孔隙率和微孔结构，在结构上与细胞外基质(ECM)相似，是最合适的伤口敷料之一。此外，纳米纤维基质提供的开放微孔结构有利于气体的交换和渗出液的排出。
为了建立模拟天然细胞外基质(ECM)的理想伤口敷料，我们计划选择聚 (L-乳酸)(PLLA)，一种经FDA批准的合成聚酯，用于制备纳米纤维基质。因为PLLA具有相对良好的生物力学特性，而且其降解产物无毒副作用。然而，许多研究表明，聚(L-乳酸)(PLLA)具有高疏水性，并且其表面由于缺乏粘附配体而不利于细胞的粘附，而适宜的表面对于支持皮肤细胞的粘附、伸展和增殖至关重要。此外，单纯聚(L-乳酸)(PLLA)不具备抗菌活性和加速组织修复的功能。因此，需要将聚(L-乳酸)(PLLA)纳米纤维基质功能化使其具有生物活性，并通过持续释放生物活性分子以促进伤口愈合并缩短修复周期。
层层自组装(LBL)技术可以交替沉积具有相反电荷的天然或合成聚电解质，是增强纳米纤维生物活性的简单有效的表面修饰方法，而且还是实现药物持续释放的有效策略。壳聚糖(CH)是一种常用于聚电解质多层膜制备的天然阳离子聚合物，此外，由于其止血、抗菌、生物相容性和可生物降解的特性，壳聚糖(CH)已广泛用作伤口治疗中的局部敷料。透明质酸(HA)是一种存在于包括真皮在内的不同类型结缔组织中的天然聚合物，广泛应用于美容和整形外科等医学领域。研究表明，CD44受体与透明质酸(HA)的连接与细胞外基质 (ECM)内大量细胞的粘附有关，其中成纤维细胞的粘附主要就是通过该作用实现，并通过启动修复的增殖阶段诱导细胞迁移和增殖，在伤口愈合过程中起关键作用。此外，透明质酸(HA)的降解产物还具有促血管生成作用。最近的研究表明，透明质酸(HA)还可通过LYVE-1介导的信号通路诱导淋巴管生成，从而促进伤口愈合。因此，通过层层自组装(LBL)技术用壳聚糖(CH)和透明质酸(HA)对纳米纤维进行表面功能化修饰可能成为一种改善基于纳米纤维的伤口敷料生物活性的有效方法。然而，多糖基生物多层膜在生理或恶劣的操作条件下(高盐浓度、高或低pH值或机械应力)通常不稳定。因此，这种涂层可能无法保持其对组织修复的长期促进作用。另一方面，通过对层层自组装 (LBL)多层膜的共价交联可以提高其化学和机械稳定性；然而，这种交联作用通常会导致多层膜功能的改变。
与传统的后交联方法相比，我们最近开发了一种独特的多层膜系统，主要基于组装过程中聚电解质分子间形成亚胺键或二硫键的额外分子内交联。我们发现这种多层膜的稳定性和生物活性较基于离子配对形成的聚电解质膜有了很大的提高。有趣的是，叶和他的同事报道了使用马来酰化CH(mCH)和巯基化HA(tHA)，通过迈克尔加成反应可原位形成复合水凝胶，但是是否可以利用此体系构建分子内交联聚电解质多层膜，目前尚不清楚。
近来越来越多的研究表明胰岛素(IN)对伤口愈合有很大作用。胰岛素(IN) 可以增加愈合代谢途径中信号分子，例如蛋白激酶B(Akt)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平，从而诱导细胞的增殖和分化。据报道，胰岛素可通过刺激角质形成细胞的迁移和生长促进临时组织的再上皮化。在糖尿病大鼠局部使用胰岛素可减少伤口上皮形成所需的时间并导致表皮层变厚。此外，胰岛素能够通过诱导内皮细胞的迁移和管形成来增强伤口愈合过程中的血管生成。然而，胰岛素的局部给药存在半衰期短，并且在富含肽酶的伤口环境中会失去生物活性的问题。使用合适的系统来持续递送胰岛素是克服这一问题的有效策略。在所有递送系统中，LBL技术是一种制备薄膜和微胶囊用于生物活性分子有效控释的常用方法。此外，据报道，LBL薄膜或微胶囊内的交联会极大地影响生物活性分子的释放，因为膜或微胶囊内的交联作用会对生物活性分子产生扩散屏障，并保护它们免受降解。例如，与基于离子配对形成的膜系统相比，基于分子内交联的多层膜系统显示出了更持久的BMP-2释放效果并增强了C2C12 细胞的成骨分化，这表明分子内交联多层膜系统可更有效地缓释生物活性分子。
总体而言，多层膜的内在交联对其稳定性、生物性能甚至生物活性分子的负载和控释效果具有促进作用。因此，我们有兴趣了解是否可利用mCH和tHA 通过LBL技术构建基于分子内交联的多层膜并探讨其是否可以应用于对由 PLLA制成的纳米纤维进行表面功能化修饰，以建立持续释放胰岛素以治愈糖尿病伤口的敷料。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料的制备方法。
本发明的第二目的在于提供上述制备方法制备的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料，本发明提供的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料具有良好的抗菌和保湿性能，并具有较好的组织粘附性；其可作为水溶性药物及生物活性因子的稳定、高效缓释载体，适用于皮肤修复领域尤其是糖尿病患者皮肤修复领域。
本发明的第三目的在于提供上述分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料的应用。
本发明的首要目的采用下述技术方案：
一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料的制备方法，包括如下步骤，
S1.对透明质酸进行巯基化修饰
对透明质酸溶液进行巯基化修饰，经透析、冷冻干燥即得巯基化透明质酸；
S2.壳聚糖的马来酰化改性
对壳聚糖溶液进行马来酰化改性，经透析、冷冻干燥即得马来酰化壳聚糖；
S3.聚电解质溶液的制备
将多巴胺溶解于Tris-HCl溶液中，配置成多巴胺溶液，将马来酰化改性的壳聚糖溶解于乙酸溶液中；配置巯基化透明质酸水溶液；
S4.静电纺丝法制备纳米纤维
将纺丝纳米纤维经多巴胺溶液浸泡后充分水洗，然后将纺丝纳米纤维依次浸入巯基化透明质酸溶液和马来酰化壳聚糖溶液中吸附，吸附完后洗脱；
S5.纳米纤维层层自组装(LBL)表面功能化
重复吸附、洗脱步骤若干次后即得巯基化透明质酸和马来酰化壳聚糖交替吸附的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料。
优选的，所述步骤S1中选用N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺对(NHS)透明质酸水溶液进行活化处理；选用半胱氨酸盐酸盐对透明质酸进行巯基化修饰。
优选的，所述步骤S1中N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐与 N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1；透明质酸和半胱氨酸盐酸盐的质量比为0.8～ 1.5:1；透明质酸和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为 0.5～1:1。
优选的，所述步骤S1中透析为在盐酸条件下进行，透析时间为三天。
优选的，所述步骤S2中壳聚糖氨基和马来酸酐(MA)的摩尔比(n-NH2/nMA) 为0.5～2:1。
优选的，所述步骤S2中壳聚糖氨基和马来酸酐(MA)的摩尔比(n-NH2/nMA) 为1:1。
优选的，所述步骤S3中多巴胺溶液的质量浓度为1.0～3.0mg mL-1，马来酰化改性的壳聚糖的质量浓度为0.4～0.8mg mL-1，巯基化透明质酸水溶液的浓度为质量0.4～0.8mgmL-1。
优选的，所述S4中巯基化透明质酸溶液的pH为5～7，马来酰化壳聚糖溶液的pH为3～5。
优选的，所述S5中巯基化透明质酸(tHA)及马来酰化壳聚糖(mCH)重复吸附、洗脱步骤9～11次。
在本发明中，所述修饰层主要通过高分子间功能团的反应实现其在纺丝纤维表面的自组装。
在本发明中，所述S3中的纺丝纳米纤维可以是聚乳酸纺丝纳米纤维，也可以根据修复医学领域需求选用本领域的其它高分子纺丝纳米纤维如聚乳酸羟基乙酸纺丝纳米纤维等。
在本发明中，所述分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料还可以巯基化壳聚糖和巯基化透明质酸通过二硫键交联制备；所述分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料还可以氧化透明质酸和胶原基于Schiff键交联制备。
通过静电纺丝技术制备的纺丝纳米纤维具有较大的比表面积、可调控的孔隙率和较好的延展性、吸附性，且能模拟天然细胞外基质结构和功能等优势，成为了修复材料发展的新方向，然而单纯的人工合成高分子纺丝纳米纤维往往不具有抗菌、保湿性和生物活性。需要对其进行适当的修饰与改性，以提高其用于创面修复的可行性。与单纯通过CH与HA修饰相比，本发明通过对CH与 HA的化学改性，将其用于纺丝纤维修饰后可赋予修复材料良好的抗菌能力，无需进行额外的抗菌药物负载。
天然高分子自组装修饰层虽然具有良好的生物学活性，然而其在生理环境下的稳定性往往不够，需通过化学或物理交联手段提高其稳定性。本发明通过对HA和CH进行化学修饰，在分子间引入具有反应活性的巯基及双键，使其在对纺丝纳米纤维进行自组装修饰过程中可以原位形成分子内交联，达到稳定HA 和CH修饰层的效果。同时，避免了事后小分子化学交联剂的使用，从而减少了后续的一系列小分子清洗等步骤，也一定程度上规避了小分子化学交联剂存在的潜在毒性作用。
本发明通过自组装生物功能化修饰对纺丝纳米纤维进行改性，在维持纺丝纳米纤维基体材料良好性能的基础上改善了其生物学功能，经修饰所得的修复材料具有良好的抗菌和保湿性能，其持水性也得到了明显的改善，还具有较好的组织粘附性。另外，本发明提供的生物功能化修饰后的纺丝纳米纤维能够承受诸如pH、高离子强度以及机械力等外界环境压力，可作为药物载体、组织工程支架或伤口修复材料应用在生物医学组织工程领域。
本发明方法采用层层自组装技术对纺丝纤维进行修饰，反应介质为水溶液，修饰过程在室温下进行，后续生物活性因子或药物的负载亦是在此条件下开展，不会引起材料的降解和变性，也不会影响负载因子的生物学活性。
本发明的第二目的采用下述技术方案：
一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料，由上述制备方法制备得到。
本发明的第三目的采用下述技术方案：
一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料的应用。
优选的，所述分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料在抗菌中的应用。
优选的，所述分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料在胰岛素负载中的应用。
优选的，所述分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料在促干细胞增殖中的应用。
优选的，所述分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料在促进糖尿病小鼠创面修复中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对现有的纺丝纳米纤维进行生物功能化修饰，提供了一种具有良好抗菌和保湿性能的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料，该纺丝纳米纤维材料还具有较好的组织粘附性。本发明提供的纺丝纳米纤维材料可作为水溶性药物或生物活性因子的稳定、高效缓释载体，适用于组织修复领域，尤其是糖尿病患者皮肤修复领域。
另外，本发明用于制备分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料的方法和体系容易操作和控制，实验条件温和、成本低，避免了高能源的投入，具有较大的推广应用价值。
附图说明
图1为巯基化透明质酸(tHA)及马来酰化壳聚糖(mCH)的合成机制(A) 及其1H NMR(B)谱图；
图2为通过QCM检测后根据Sauerbrey方程计算得到的在层吸附过程中膜分子吸附质量(A)的及厚度(B)的变化情况；其中奇数层为HA或tHA，偶数层为CH或mCH；[P：单纯PLLA纺丝纳米纤维；P-PDA：PDA修饰后PLLA 纺丝纳米纤维；P-CH/HA：天然CH与HA LBL修饰后PLLA纺丝纳米纤维； P-mCH/tHA：mCH与tHA LBL修饰后PLLA纺丝纳米纤维]；
图3为LBL修饰前后PLLA纳米纤维纺丝膜对大肠杆菌的抑制效果(A) 及其抑制圈直径(B)，[P：单纯PLLA纺丝纳米纤维；P-CH/HA：天然CH与 HA LBL修饰后PLLA纺丝纳米纤维；P-mCH/tHA：mCH与tHA LBL修饰后 PLLA纺丝纳米纤维]；(C)为利用软件通过扫描电镜图得到的 PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的纤维直径；(D)为PLLA、P-CH/HA 以及P-mCH/tHA的应力-应变曲线图；(E)为PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及 P-mCH/tHA的红外光谱图；(F)为PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA 的全XPS光谱图；(G)为通过XPS检测得到的PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的N1s图；(H)为通过XPS检测得到的PLLA、P-PDA、P-CH/HA 以及P-mCH/tHA的S2p谱图；
图4为革兰氏阴性菌大肠杆菌在PLLA、P-CH/HA、P-mCH/tHA上抗菌能力图以及革兰氏阴性菌大肠杆菌在PLLA、P-CH/HA、P-mCH/tHA上抑菌圈直径图；
图5为LBL修饰前后PLLA纳米纤维纺丝膜上胰岛素的负载效率及体外胰岛素在不同时间点的释放情况；[P：单纯PLLA纺丝纳米纤维；P-CH/HA：天然CH与HALBL修饰后PLLA纺丝纳米纤维；P-mCH/tHA：mCH与tHALBL 修饰后PLLA纺丝纳米纤维]；
图6为间充质干细胞在PLLA、P-CH/HA、P-mCH/tHA上的粘附、伸展及增殖行为，其中(A)和(B)分别为有无胰岛素负载条件下间充质干细胞在PLLA、P-CH/HA、P-mCH/tHA上的SEM形貌和共聚焦观察其肌动纤维(红色)和细胞核(蓝色)情况；方框标记为所选图片的放大图，可见明显的ECM形成；(C) 为在有无胰岛素条件下间充质干细胞在PLLA、P-CH/HA、P-mCH/tHA上第1 天及第三天的增殖行为；
图7为(A)未处理组以及单纯PLLA、PLLA_IN、P-CH/HA、P-mCH/tHA 处理后糖尿病小鼠全层皮肤创面(8mm直径)在不同时间点的大体形貌图；以及(B)通过“Image-Pro Plus”软件测量得到的不同时间点的创面愈合速率；
图8为通过HE(A)和马氏三色染色(B)观察未处理组以及经过单纯PLLA、 PLLA_IN、P-CH/HA和P-mCH/tHA处理后创面处肉芽组织的形成、再上皮化以及胶原沉积情况；
图9为通过免疫组化染色观察未处理组以及经过单纯PLLA、PLLA_IN、 P-CH/HA和P-mCH/tHA处理后创面处CD31(A)和VEGF-R(B)的表达情况。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1一种分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料
(1)对透明质酸进行巯基化修饰
磁力搅拌下，将0.2g透明质酸(HA)溶解在50ml水中搅拌均匀，配制透明质酸(HA)水溶液；依次加入25mM的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和25mM的N-羟基琥珀酰亚胺，用盐酸调节体系pH为5.5。避光，室温搅拌2小时后，在反应体系中加入0.2g半胱氨酸盐酸盐，用盐酸调节体系 pH为4.75，避光，室温搅拌，盐酸透析3天；透析第一天，将反应体系中的混合物在0.2mM盐酸中进行透析，分子截留量Mw＝3.5kDa；透析第二天，用含有质量百分数为1％的氯化钠0.2mM盐酸进行透析；透析第三天，再次使用 0.2mM盐酸调节反应体系为3.5，冷冻干燥后即可得巯基化HA(tHA)。
(2)壳聚糖的马来酰化改性
将壳聚糖(CH)以10mg mL-1的浓度溶解在0.5mol L-1醋酸中，根据CH 重复单元与马来酸酐摩尔比为1:1的投料比向壳聚糖溶液中加入马来酸酐搅拌混合，室温下避光搅拌24小时后蒸馏水透析3天，分子截留量Mw＝3.5kDa，以除去杂质和未反应的小分子，冷冻干燥后即可得马来酰化CH(mCH)。
(3)聚电解质溶液的制备
各聚电解质溶液的配制如下：
多巴胺(2mg·mL-1)溶解于Tris-HCl(pH为8.5)溶液中；
将巯基化修饰后的HA(0.5mg·mL-1)溶解于水溶液中，马来酰化CH(0.5 mg·mL-1)溶解于0.05M乙酸溶液中，磁力搅拌过夜使其充分溶解；同时配制同等浓度的天然HA和天然CH溶液作为对比。
上述各溶液在使用前，除了多巴胺与tHA溶液之外，所有溶液的pH值均调至4。
(4)静电纺丝法制备聚(L-乳酸)(PLLA)纳米纤维
将7wt％的聚乳酸粉末溶解于DCM/DMF(4:1v/v)混合液中并装入10mL 注射器中并固定于微量注射泵上，采用削平的针头作为喷射细流的的毛细管，毛细管内径为0.4mm，电压18kv下，挤出速度1mL·h-1。将纺丝得到的纤维收集到旋转滚筒上，真空干燥12小时，去除残留的有机溶剂即可得聚(L-乳酸) (PLLA)纳米纤维。
(5)聚(L-乳酸)(PLLA)纳米纤维层层自组装(LBL)表面功能化
聚乳酸纺丝纳米纤维经75％乙醇浸润后充分水洗，首先将其转移至2 mg·mL-1的多巴胺溶液中浸泡30分钟，然后充分水洗，使其在纺丝纤维表面组装上一层带正电的多巴胺基础层。经多巴胺修饰后的纺丝纳米纤维依次浸入tHA 与mCH溶液中，每一层吸附12分钟后都伴随着洗脱步骤(3×3min)，洗脱液为水溶液；同时将多巴胺修饰后的纺丝纳米纤维依次浸入HA与CH溶液中，同等条件处理作对比。
重复以上步骤多次最终在多巴胺基础层上分别得到9层HA与CH (P-CH/HA)及tHA与mCH交替吸附的P-mCH/tHA纺丝纳米纤维。
对上述经自组装修饰后的聚乳酸纺丝纳米纤维的形貌特征等物化性能进行检测，测试结果如下。
物化性能测试
(1)活性基团的鉴定
图1A为在碳二亚胺偶联剂的存在下，通过HA的羧基和半胱胺酸的胺基之间形成酰胺键来制备tHA，图1A为通过CH与马来酸酐的马来酰化反应合成有乙烯基羧酸基团的mCH；tHA和mCH的化学结构通过1H NMR表征。与HA 相比，-CH2SH-上的亚甲基质子在2.81ppm处出现新峰(见图1B)，表明成功地引入了巯基。通过比较图1B中CH和mCH的1H NMR光谱，在mCH中发现了-CH＝CH-在6.17ppm处的新峰，验证了用马来酸酐成功修饰CH。根据标准Ellman测试和马来酸标准曲线法更进一步证实成功地对HA和CH进行了巯基化和马来酰化改性，其中巯基含量为120.4±4.8μmol g-1，而与CH结合的乙酰基数目为1783.6±96.5μmol g-1。
(2)石英晶体微天平(QCM)监测多层膜的增长行为
通过QCM检测观察基于分子内交联的mCH/tHA多层膜体系与基于离子配对CH/HA多层膜体系的差异。图2为层吸附过程中通过QCM检测并利用 Sauerbrey方程计算得到的mCH/tHA和CH/HA膜体系的吸附质量(A)及厚度 (B)变化情况，其中奇数层为tHA或HA，偶数层为mCH或CH。从图2中可以看到，由于mCH与tHA分子间双键与巯基的分子内共价交联作用，该膜体系的分子吸附质量(即mCH和tHA的吸附量明显高于CH和HA)及膜厚度均明显高于CH/HA膜体系。
(2)自组装修饰后的聚乳酸纺丝纳米纤维的形貌结构以及亲水性、保湿、持水能力
接触角(WCA)检测是反应材料表面亲疏水性的重要手段，随着材料表面亲水性的增加，其WCA值将降低。
图3显示的实施例1制备的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料为共有9层HA与CH及tHA与mCH交替吸附的P-CH/HA和P-mCH/tHA纳米纺丝纤维，[P：纯PLLA纺丝膜，P-PDA：吸附PDA层的PLLA纺丝膜，P-CH/HA：自组装有9层HA和CH的PLLA纺丝膜，P-mCH/tHA：自组装有9层 mCH/tHA的PLLA纺丝膜]。
其中，图3A为P-CH/HA以及P-mCH/tHA在CH(mCH)及HA(tHA) 交替吸附过程中的水接触角(WCA)变化情况，从图中可以看到经过层吸附后 PLLA膜的亲水性有了明显的改善，且接触角呈现出交替变化的趋势表明CH (mCH)和HA(tHA)成功地交替吸附到了PLLA膜上。此外，随着mCH和 tHA的交替吸附，其WCA变化程度明显较CH和HA大，进一步证实了mCH 及tHA的吸附质量高于CH及HA；图3B分别为PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的形貌结构，从图3B可以看到经过mCH与tHA修饰后PLLA 纺丝纤维表面粗糙度有了明显的提高，这表明mCH和tHA已经成功地吸附到 PLLA纺丝纳米纤维上；图3C为利用软件通过扫描电镜图得到的PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的纤维直径；图3D为PLLA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的应力-应变曲线图，从图中可以看到经过LBL修饰后PLLA纺丝纤维的拉伸强度有了明显的提高，尤其是mCH/tHA修饰后的纺丝纤维具有最高的抗拉强度，这可能是因为膜内分子间交联增强了其抗拉强度；图3E为PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的红外光谱图，经过mCH/tHA LBL修饰后，P-mCH/tHA在1640cm-1和1560cm-1处出现了mCH与tHA形成的酰胺键(-CONH-)以及mCH上的酰胺Ⅱ带峰，此外mCH原本在864cm-1处的马来酰基双键峰在与tHA自组装反应后减弱；图3F为PLLA、P-PDA、 P-CH/HA以及P-mCH/tHA的全XPS光谱图，其中图3G、3H分别为通过XPS 检测得到的PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的N1s和S2p谱图，发现在经过LBL修饰后PLLA膜的N含量明显增加，而P-mCH/tHA上可见来源于tHA的S含量增加，进一步表明成功对PLLA进行了LBL修饰。
表1为PLLA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的含水量和溶胀率
样品
含水量(％)
溶胀率(％)
PLLA
37.5±4.17
20.48±6.44
P-CH/HA
70.96±3.64
513.38±49.58
P-mCH/tHA
78.59±2.10
527.78±25.46
由表1可知，经过mCH/tHA LBL修饰后，P-mCH/tHA含水量相比之单纯 PLLA从37.5±4.17％增加到78.59±2.10％；P-mCH/tHA溶胀率相比之单纯PLLA 从20.48±6.44％增加到527.78±25.46％。
表2为PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的力学性能
由表2可知，经LBL修饰后P-CH/HA以及P-mCH/tHA直径分别从644±175 nm(P)增加到了909±185nm和906±204nm，在P-CH/HA和P-mCH/tHA之间未发现纤维直径的差异；在相同尺寸和加载速率下，PLLA、P-PDA、P-CHI/HA 以及P-mCH/tHA具有不同的力学性能，从表2中可知，PLLA具有最低的拉伸强度1.13±0.09MPa，P-CH/HA的断裂伸长率和拉伸强度较PLLA没有显著变化，但是杨氏模量大大增加，相反地，P-mCH/tHA的力学性能相较于单纯PLLA和 P-CH/HA均有了极大地提高，断裂点处的最高拉伸应力和杨氏模量高达 3.23±0.57MPa和0.595±0.192MPa。
表3为PLLA、P-PDA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA的C、O、N和S的原子含量
样品
C1s(％)
O1s(％)
N1s(％)
S2p(％)
PLLA
73.26
25.84
0.73
0.17
P-PDA
65.59
33
1.32
0.09
P-CH/HA
65.27
32.03
2.66
0.03
P-mCH/tHA
64.62
31.74
3.55
0.28
从表3中可以看出，与PLLA相比，N的含量随着表面改性而增加。 PLL-PDA、P-CH/HA和P-mCH/tHA的N含量分别增加到1.32％、2.66％和3.55％。此外，P-mCH/tHA的S含量约为0.28％，是四个样品中最高的。
由以上图表结果可以看出，与CH/HA相比，mCH/tHA体系由于分子间交联作用的存在，其在PLLA上的吸附质量显著高于CH和HA，经CH和HA或 mCH与tHA修饰后的P-CH/HA和P-mCH/tHA的亲水性都有了明显的提高，而经mCH和tHA修饰后的P-mCH/tHA拉伸强度也有了明显的提高，表明通过此法制备的修复材料具有良好的吸水、保湿效果以及强的力学性能。
对比例1
配置与实施例1所述P-mCH/tHA同浓度的纯聚(L-乳酸)(PLLA)溶液。
对比例2
配置与实施例1所述P-mCH/tHA同浓度的未经过马来酰化改性的壳聚糖和巯基化改性的透明质酸(P-CH/HA)溶液。
应用试验例1实施例1提供的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料 (P-mCH/tHA)在抗菌作用中的应用
参照已发表文献方法中的琼脂扩散法研究了本发明专利实施例1提供的修复材料对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抗菌作用，并与对比例1中单纯PLLA及对比例2中常规CH/HA自组装修饰后的PLLA材料进行对比研究。首先将灭菌的 Luria-Bertani琼脂培养基倒入平板中，利用接种环将细菌均匀地涂散在斜面培养基表面。分别将单纯PLLA、P-CH/HA以及P-mCH/tHA裁剪成小圆片(12mm) 并放置在平板上，37℃下孵育24小时。培养结束后，测量平板上细菌生长抑制区的直径。结果发现，单纯PLLA本身无抗菌性，周围未见抑菌圈，而经未改性CH及HA修饰后的PLLA纺丝纳米纤维周围亦未见明显抑菌圈，提示其不具有抗菌能力。相反地，PLLA纺丝纳米纤维膜通过mCH/tHA自组装修饰后纺丝纤维周围出现了明显的抑菌圈，抑菌圈宽度约为6.53mm±1.54，表明该修复材料具有明显的抗菌、抑菌能力，具体情况如图4。
应用试验例2实施例1提供的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料 (P-mCH/tHA)在胰岛素负载中的应用
在我们前期研究中发现无血清条件下，一定浓度的胰岛素(IN)具有显著的促进脐带间充质干细胞增殖的能力。在此基础上，我们利用以实施例1中纺丝纤维修饰后的自组装高分子层为载体，通过简单浸泡的方式实现胰岛素在纺丝纤维内的负载，并与对比例1中单纯PLLA及对比例2中未改性CH/HA自组装修饰后的PLLA材料进行对比研究，考察本发明专利实施例1中的修复材料对胰岛素的负载效率及控释效果。
图5为单纯PLLA，P-CH/HA以及P-mCH/tHA三种材料上胰岛素的负载效率以及缓释行为。由图5结果可见，经过mCH/tHA修饰后的纺丝纤维内胰岛素负载量较其他两组有了明显的提高。此外，三组材料上前3小时内胰岛素均出现了突释，但是mCH/tHA修饰后材料上胰岛素的释放量明显降低，且在该组材料对胰岛素具有明显更好的缓释效果(9天后该组材料内胰岛素的释放量不到 60％)。
应用试验例3实施例1提供的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料 (P-mCH/tHA)在促干细胞增殖中的应用
生物材料用于皮肤创面修复的一个重要因素即要求其具有促创面修复能力，前期实验在二维培养条件下发现一定浓度的胰岛素能够在无血清条件下明显的促进脐带间充质干细胞增殖。本发明专利利用mCH/tHA自组装层作为胰岛素载体，发现经mCH与tHA修饰后的纺丝纤维材料可以明显提高胰岛素的缓释效果，通过对比研究对比例1中单纯PLLA及对比例2中CH/HA修饰后PLLA 上干细胞生长增殖行为，研究本发明专利修复材料在促进干细胞增殖中的作用。图6为不同材料表面脐带间充质干细胞增殖行为，由图6可知，负载胰岛素后的纺丝纤维可以显著促进细胞增殖，但是与单纯PLLA及经CH/HA修饰后PLLA 相比，本专利发明的修复材料通过对胰岛素的缓释作用具有更优的促细胞增殖作用，以及促细胞外基质分泌(局部放大图)的效果。
应用试验例4实施例1提供的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料 (P-mCH/tHA)在促进糖尿病小鼠创面修复中的应用
通过在南京大学模式动物研究所购买了30只糖尿病小鼠，根据文献报道方法在小鼠背面制造全层皮肤伤口模型。30只小鼠随机分为5组，分别为未处理组(control组)、PLLA处理组、P_IN处理组、P-CH/HA_IN处理组、P-mCH/tHA_IN 处理组。在创面处理的不同时期内(0、3天、5天、9天、16天)定时拍照记录创面愈合情况，处理16天后取材，包埋切片，进行组织化学及免疫组化染色，观察不同处理组创面的修复效果。
如图7中所示，不同处理组间创面的愈合速度具有显著的差异，其中本发明制备的修复材料，即mCH与tHA修饰后的纺丝纤维材料明显促进了创面的愈合。此外，通过HE(图7)染色可见，通过利用P-mCH/tHA_IN处理的皮肤创面可见完整的再上皮化和以形成良好表皮层为特征的可区分上皮，明显不同于未处理组的上皮不全以及PLLA处理组的表皮层不清晰。在P_IN处理组中虽然也可见完全再上皮化的迹象，但其表皮分层较少，真皮-表皮连接不全。此外，虽然P-CH/HA_IN处理组也可见较好的创面修复效果，然而P-mCH/tHA_IN处理组可见更明显分层结构的表皮层，且可见完整的基底膜，显示出发育良好的表皮-真皮连接。进一步地，通过图8所示的马氏三色染色，可见在P-mCH/tHA_IN 处理组可见明显多的胶原沉积，且沉积的胶原形成了类似于正常皮肤的网篮状结构。如图9所示，进一步对创面血管形成的观察可知，与血管新生相关的CD31 以及VEGF-R均在P-mCH/tHA_IN组高表达，表明本专利发明的修复材料具有良好的促血管形成的作用。
本发明通过对聚乳酸纺丝纳米纤维进行生物功能化修饰，得到了一种具有良好抗菌、保湿、适宜组织粘附性的分子内交联自组装膜修饰纺丝纳米纤维材料，同时该技术还可推广应用于其他的高分子纺丝纳米纤维修饰上，以及其他组织工程应用领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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